JPH0546357B2

JPH0546357B2 -

Info

Publication number: JPH0546357B2
Application number: JP62170753A
Authority: JP
Inventors: Kenji Matsui; Yutaka Ando; Yoshitaka Ando; Kyoko Hitomi
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 1987-07-08
Filing date: 1987-07-08
Publication date: 1993-07-13
Also published as: JPS6416795A

Description

【発明の詳細な説明】

〔イ〕発明の目的本発明は、牛脳を出発原料となし、これより、
水溶性蛋白質を得た後、さらにリン脂質、スフイ
ンゴ脂質の各抽出物を得ることを特徴とする製造
法に関する。「産業上の利用分野」本発明による牛脳抽出物は、医薬、化粧品、加
工食品に利用出来る。又、本発明による製造法に
よれば、牛脳に限らず、家畜類（哺乳動物：例え
ば牛をはじめ、豚、羊、馬など）の屠殺解体後の
各種臓器（例えば、脳をはじめ、心、脾、肝な
ど）からも得ることが可能であり、屠殺場にあつ
ては、これらの各種臓器の処理に当つて、衛生的
且つ合理的な管理が可能となる。「従来の技術」古くから各種の動物臓器をもとに、その有効利
用が行われてきている。本発明は、牛脳をもと
に、これより(1)水溶性蛋白質、(2)リン脂質、(3)ス
フインゴ脂質の３種類の抽出物が得られる。本発明による上記(1)水溶性蛋白質には、線維芽
細胞増殖能があることが特徴である。その主役成
分は、分子量が8000〜20000の付近にある蛋白質
である。本発明者らは、すでに線維芽細胞増殖能を有す
る水溶性蛋白質については、主として牛の各種臓
器をもとに、硫安を用いた抽出法を採用して、特
許出願番号：昭61−049384、昭60−225666、昭60
−225667、昭61−275679、昭62−019083、昭62−
019084、昭62−019085、昭62−019087等におい
て、その開発を行つてきた。又、その生理活性能については、培養された株
化されていない正常細胞を用い、これに各種の抽
出物（水溶性蛋白質）を添加して、その細胞の成
長率促進作用を求める方法によつて評価し、医薬
品、又は化粧品等への利用について開発に当つて
きた。一方、(2)〜(3)に係る脂質については、例えば、
本発明者らによるヒトの正常分娩後の胎盤を原料
となした、複合脂質に関する、特許公報：昭52−
42847、あるいは、最近では、他の研究者らによ
る公開特許公報：昭62−56414、昭60−163888、
昭60−163806、昭61−271205、昭61−286307、昭
61−260008などにおいて、主として化粧料への応
用について開示されている。「発明が解決しようとする問題点」本発明は、牛脳を出発原料となし、これより、
前記(1)〜(3)の抽出物を効率良く、無駄なく回収す
る方法に関する。従来、牛脳をもとに、さまざま
な抽出物が得られているが、一連の工程中から、
(1)〜(3)を効率良く、それぞれ分取する手段は見当
らないでいた。本法によれば、最終的には、前記
の３つの抽出物の他に、水に不溶性の蛋白線維質
が、オカラ状で得られる。このものは、さらに、
飼料用、又は肥料用として用いられる他、さらに
加水分解等の処理を加えれば、アミノ酸の抽出原
料として、あるいは、液体肥料等に利用可能であ
る。すなわち、本発明者らは、牛脳より、まず線維
芽細胞増殖能を有する、水溶性の蛋白質を分取し
た後、その際に残つた一方の沈澱物をもとに、さ
らにリン脂質とスフインゴ脂質を分取することに
よつて、最終的に残つた残渣物が、無臭の蛋白質
（水に不溶性）の粉体として得る方法に関するも
ので、このものが無臭で得られることが特徴であ
る。つまり、本法によれば、臓器の腐敗臭（悪
臭）公害の防止に役立ち、さらに、臓器から有効
成分を、効率良く回収することが出来るものであ
る。〔ロ〕発明の構成本発明は、牛脳を出発原料となし、これを２％
硫酸アンモニウム溶液を用いて、その溶液中に可
溶な、水溶性蛋白質を分取し、一方、その溶液に
不溶性の沈澱物に対して、ヘキサン９とイソプロ
パノール５の割合の混液を用いて、その可溶部を
分取した後、エーテルか、あるいはクロロホルム
１とメタノール２の割合からなる混液を用いて、
その可溶部からリン脂質、沈澱部よりスフインゴ
脂質を得ることを特徴となす。「問題点を解決するための手段」本発明は、あらかじめ硫酸アンモニウム溶液に
より、水溶性の蛋白質を分取することが、その大
きなポイントとなる。すなわち、従来法による多
くの蛋白水溶性抽出物についての抽出法（製造
法）は、あらかじめ、脱脂等の前処理、脱血等の
処理、水洗処理などを加えた後、実施されてきた
が、本発明による水溶性抽出物を得るには、前処
理において、水洗、脱脂、脱血のための有機溶媒
の使用、あるいは、それらの工程は一切不要であ
る。したがつて、従来法によれば、前処理のため
に、それに対する設備、及び経費も多くかかつて
いた。又、その際の臓器の有する特異臭の発生な
どに対する処置も必要であつたが、本法は、これ
らの前処理を一切不要となした点が、製造上の大
きなメリツトの一つとして、まずあげることが出
来る。「製造法：実施例１」屠殺後、解体された新鮮な牛脳は、通常、ただ
ちにフリーザーに保存されて凍結される。ここで
用いる牛脳は、水洗等の処理を加えないものであ
つて、解体分離後の新鮮なものであれば、凍結前
のものでも、凍結保存されたもののいずれでも良
い。（第１抽出工程：水溶性蛋白質の分取）牛脳（湿体重量約0.7Kg）に対して、２％硫酸
アンモニウム液１を加え、ホモミクサーによ
り、10000rpm、10分間、氷水中で撹拌した後、
希硫酸を用いPH4.6〜5.0に調整後、遠心分離し
て、その上清液（可溶液層部）を取る。沈澱部
（沈澱層部）は、前記と同様の操作をさらに２回
繰り返し、それぞれ得られた上清液を混合し、次
に1N水酸化ナトリウムでPH6.4に調整した後、硫
酸アンモニウム（０〜0.8飽和溶液）を用いて分
画を行い、目的とする水溶性蛋白質を沈澱物で得
る。収量は、硫酸アンモニウムの飽和濃度によ
り、異なるも、さらに各々を透析後の凍結乾燥重
量からは、次表（第１表）に示すごとくが得ら
れ、又、その作用として、線維芽細胞に対する増
殖能は、0.4〜0.6飽和、0.6〜0.8飽和の硫酸アン
モニウムによる分画されたところの水溶性の蛋白
に認められ、とくに0.6〜0.8飽和による分画部の
水溶性蛋白質に、増殖能が高い傾向が認められ
る。又、分子量分布状態からは、8000〜16000付
近にある水溶性蛋白質が多いものほど、その作用
が強く示されることである。（第２抽出工程：複合脂質の分取）一方、前記工程において上清液分取後の沈澱物
に対しては、ヘキサン９とイソプロパノール５の
割合からなる混液１を加え、２時間程度、ホモ
ミクサーにより撹拌した後、遠心分離機にかけ、
４℃、9000rpmで20分間行い、その可溶部を分取
し、沈澱部は、再び前記の混合溶媒により、２回
繰り返し、それぞれに得られた可溶部を混和した
後、40〜45℃で、約300ml程度に濃縮し、次にこ
の濃縮物に対して、エーテル、又はクロロホルム
１とメタノール２の割合の混液３を、小量ずつ
添加しながら、ゆるやかに撹拌した後、４℃にお
いて一夜放置する。次に、濾過を行い、その濾液と沈澱物を分取す
る。ここで分別された濾液は、本発明による目的
となす、リン脂質、沈澱物はスフインゴ脂質の抽
出が容易である。そして、まず、濾液は４℃、２
日間放置し、その沈澱部を濃縮すると、42.7ｇ程
度のペースト状物が得られる。これをエーテル25
mlに溶解後、冷アセトン500ml中に撹拌しながら
注入後、４℃において1.5時間放置した後、アセ
トン洗浄を行い、遠心分離機（9000rpm、20分
間）にかけて、その沈澱物を分取し、減圧乾燥、
又は真空乾燥して、リン脂質（この例において得
られた収量は、35.2ｇが得られた）を得る。一方、濾液は、クロロホルム25ml中に分散さ
せ、冷アセトン500ml中に、４℃において20分間
程度撹拌を行つた後、４℃において一夜放置後、
アセトン洗浄を行い、遠心分離機（9000rpm、20
分間）にかけて、得られた沈澱物を分取し、減圧
乾燥（室温）、又は真空乾燥（30℃）を行い、ス
フインゴ脂質（この例において得られた収量は、
25.2ｇが得られた）を得る。尚、本工程中、第２抽出工程において、ヘキサ
ン９とイソプロパノール５の割合からなる混液を
用いて得られた、可溶部を分取した残りの沈澱部
は、水に不溶性の脂質を含まない、線維質構造か
らなる蛋白質を主体とする残渣物であるが、この
ものは、ベトツキのない、サラツとした状態にあ
り、又、悪臭もなく、若干の有機溶媒が混在して
いるも、水洗又は真空乾燥等により、有機溶媒を
除去して粉体とすれば、ほとんど臓器臭のない状
態で、保存性の良好な肥料、飼料として利用可能
である。又、さらに、加水分解処理を加えること
によつて、アミノ酸等の抽出原料として利用し易
いものである。「製造法の検討」本法による製造法によれば、リン脂質とスフイ
ンゴ脂質との分画も容易となる。これは、あらか
じめ、水に可溶性の蛋白を分取するための処理、
すなわち、硫酸アンモニウム溶液による、線維芽
細胞増殖物質を含む抽出物を、先に得る手段が有
効に働いているためと考えられた。

【表】備考収量欄中の数値は、いずれも透析
後、凍結乾燥したときの収量を示す。
（線維芽細胞増殖能試験法）第１表における線維芽細胞増殖能の評価に当つ
ては、モルモツト（ハートレー系）から採取した
線維芽細胞に、５％FBS（牛胎児血清）を添加し
たイーグルのMEM培地（GIBCO製）を用い、
一定期間培養した後、対照添加液には１％FBS、
その他は１％FBSに、前記製造法の第１工程中
において、各硫酸アンモニウムを用いて得られた
粉体を、30μｇ／mlの濃度になるように添加し、
その添加後の経過について、細胞増殖数を、ビユ
ルケルチユルクの血球計算盤を用いて測定し、対
照添加液の増殖率（能）と同等であるもの、又は
それ以下であるもの（−）、それより増殖率が向
上したもの（＋）、さらに増殖率が著明であるも
の（＋＋）で評価する方法を採用した。前表（第１表）中には、製造法（第１抽出工
程）で得られた水溶性蛋白質の収量、及び作用に
ついて評価を行つたが、次に、第２工程より得ら
れる、リン脂質及びスフインゴ脂質について、そ
の収量、及び得られた両抽出物の精製度につい
て、対比してみた。すなわち、従来法によるリン脂質及びスフイン
ゴ脂質の抽出法にあつては、いきなり各種の有機
溶媒（親油性の有機溶媒）を用いて抽出する方法
が採用されてきていたが、それらの手段は複雑で
あり、スフインゴ脂質とリン脂質の分画におい
て、効率的な工業的生産規模において、簡易な手
段が望まれていた。つまり、両物質は親油性有機
溶媒中で共存して溶出され、一方の純度を高める
となると、どちらか一方の収量が低下し、又、精
製するたびに、収量が低下することであつた。とくに最近では、スフインゴ脂質の応用に関し
ては、前記した公知刊行物中に示されるごとく、
化粧品に配合すれば、湿潤性能が向上することが
開示されている。本法によれば、第１工程による水溶性蛋白質の
抽出工程によつて、残つた沈澱物を用いることに
より、親油性有機溶媒への、スフインゴ脂質及び
リン脂質の移行性が向上し、その結果、両物質の
分離もスムーズとなることである。特に、溶媒の
組合せは、ヘキサン９とイソプロパノール５の割
合の混液の使用は、両物質の溶出が良好である。第１図は、本法によつて得られたスフインゴ脂
質、及びリン脂質のTLC（簿層クロマトグラフイ
ー法）によつて求めた、そのスポツトである。すなわち、本法による第２工程で示す、有機溶
媒の組合せの割合によれば、（これによつて、第
１図中イで示されるところのスフインゴ脂質は、
セレブロシド、スルフアタイド、スフインゴミエ
リンを主体となすスフインゴ脂質が得られること
となり、このなかには、リン脂質は、きわめて少
ない状態で得られていることが確認される。又、
さらに、もう一方で得られたところの、第１図中
ロで示されるリン脂質の方は、ホスフアシヂルコ
リン等のリン脂質類が主体に含まれ、このなかに
はスフインゴ脂質は、きわめて少ない状態で得ら
れることが確認された。つまり、第２工程におい
て、ヘキサン９とイソプロパノール５からなる混
液によつて、スフインゴ脂質及びリン脂質の混合
液（いわゆる複合脂質）が、効率よく回収された
後、次にエーテル、又はクロロホルム１とメタノ
ール２からなる混液による処理によつて、両物質
の分離が、容易に出来ることである。尚、第１図に示すTLCの測定は、次の条件で
実施した。（TLC測定条件）担体：シリカゲル60F254（メルク社製）。展開溶媒の組成：酢酸メチル25、ｎ−プロパノ
ール25、クロロホルム25、メタノール0.25％
KCl9。検出試薬：MnCl₂0.2ｇ＋水30ml＋メタノ
ール30ml＋濃硫酸２ml。検出器：UV366nｍより
照射。試料溶液：約10mgをクロロホルム１、メタ
ノール１の混液２mlに溶解し、10mlをスポツト。収量については、次表（第２表）に示すごとく
となる。第２表中には、第２工程で用いた有機溶
媒の組合せのもと、第１工程を経ないで、ストレ
ートに第２工程のみを採用してみたときの、両抽
出物の収量について、本法と対比をしてみたもの
である。その結果は、本法に示す、第１工程と第
２工程の組合せによる製造法中に示す手段を用い
た、第２工程の手段は、スフインゴ脂質及びリン
脂質を得るに当つて、これ自体でも、良好に両物
質の分離精製には有効な手段であることがわかつ
た。しかし、収量的には、本法で示すごとく、第
１工程を経て抽出したときの方が、むしろ向上す
ることである。尚、この方法とは逆に、あらかじめ、本法の第
２工程により、スフインゴ脂質及びリン脂質を分
取し、その残渣物（沈澱物）をもとに、第１工程
を採用して、水溶性蛋白を分取することも出来
る。尚、本法の第２工程において得られたスフイン
ゴ脂質について、スフインゴシンを標準物質とし
て入手し、スフインゴ脂質を加水分解処理して、
スフインゴシンとなし、比色法により、その定量
について、試みると、下限が30％程度、上限が50
％程度の範囲にあることがわかつた。

【表】〔ハ〕発明の効果本法（製造法）によれば、第１工程で硫酸アン
モニウム溶液を用いて、水溶性蛋白を得た後、第
２工程による抽出を行うことが特徴であり、これ
によつて、線維芽細胞に対して直接的に増殖作用
をもつた、水溶性蛋白質が得られると共に、さら
にスフインゴ脂質及びリン脂質が容易に分取され
ることとなる。したがつて、産業上からは、牛脳
の有効利用について、従来に増して促進すること
が出来る。又、それぞれの抽出物の生産原価の低
減に役立つ。尚、本法の工程中で、最終的に除去
された、水にも親油性溶媒にも不溶性の線維質状
蛋白質は、廃棄する必要はなく、これを、さら
に、強酸、強アルカリ、あるいは蛋白分解酵素を
用いて、加水分解を行えば、それによつて得られ
た抽出物は、古来から知られる牛脳加水分解物と
して用いることが出来る。例えば、この加水分解
物の利用は、小児及び発育成長期の子供の知能向
上のためのアミノ酸類が豊富に含まれており、健
康食品としても利用可能である。そして、本法に
より得られた、この残渣物は、とくに脂質類がほ
とんど除去されていることによつて、長期保存下
でも、悪臭の発生が少なく、とくに、蛋白分解酵
素による反応性に富み、水溶性の加水分解物（ア
ミノ酸類）の収量も高いなどのメリツトがある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本法によつて得られたスフインゴ脂
質、及びリン脂質のTLCによるスポツトである。
第１図中、イ，ロは本法による抽出物であり、イ
はスフインゴ脂質、ロはリン脂質、NLは中性脂
質、CERはセレブロシド類、SUはスルフアタイ
ド類、PEはホスフアジルエタノールアミン、PA
はホスフアチド酸、PIはホスフアチジルイノシ
トール、PSはホスフアチジルセリン、PCはホス
フアチジルコリン、SPはスフインゴミエリン。

Claims

【特許請求の範囲】

１牛脳に対して２％硫酸アンモニウム溶液を用
いて、その可溶液層部：Ａと、沈澱層部：Ｂに分
別した後、Ａから水溶性蛋白質を得て、Ｂから
は、ヘキサン９とイソプロパノール５の割合の混
液を用いて、その可溶層部を分取した後、さら
に、エーテル、又はクロロホルム１とメタノール
２の割合の混液を用いて、その可溶層部：Ｃ、沈
澱層部：Ｄに分別した後、Ｃからリン脂質、Ｄか
らスフインゴ脂質を得ることを特徴とする、牛脳
抽出物の製造法。