JPH053787A - 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨの酵素活性
を保持し、かつ安定性が改良された変異型大腸菌リボヌ
クレアーゼＨを提供する。 【構成】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨの第６２番
目のヒスチジンをプロリンで置換すると、天然型大腸菌
リボヌクレアーゼＨの酵素活性を保持し、かつ安定性が
改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨが得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、安定性が改良された変
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ、該変異型大腸菌リボヌ
クレアーゼＨをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有
し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含有している形質転換体、および該形質転換体を用
いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術、および発明が解決しようとする課題】大
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨ、またはＲＮaseＨと称す
る場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨを意味す
るものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量約１７
Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断すると
いう基質特異性を有する。この酵素は、その基質特異性
に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて利用価
値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。

【０００３】リボヌクレアーゼＨの重要性は遺伝子工学
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換
えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既
にＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤ
ＮＡ技術により生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６４、１１５４６−１１５４９(１９８９))。

【０００４】このように利用価値の高いリボヌクレアー
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。

【０００５】これまでに、本発明者らは組換えＤＮＡ技
術を用いて、変性剤に対して天然型リボヌクレアーゼＨ
よりも高い耐性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製
造したが、その安定化の程度は十分満足し得るものでは
なく、酵素活性も天然型酵素のそれを凌ぐものではなか
った（特願平０１−２８４４５４）。また、大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨよりも極めて高い安定性を有する好熱菌
リボヌクレアーゼＨの大腸菌による製造法も報告されて
いるが（金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム
・要旨集（１９９０）、６９頁；特願平０２−１１１０
６５）、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボヌクレア
ーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも低
いものであった。尚、後者の場合、精製には尿素を用い
て可溶化するという操作が必要であり、大腸菌リボヌク
レアーゼＨの場合に較べてその製造方法が複雑であると
いう欠点もあった。従って、より酵素活性、安定性にす
ぐれた酵素であって、その製造および精製も好熱菌リボ
ヌクレアーゼＨよりも容易である変異リボヌクレアーゼ
Ｈをつくることができれば、産業上より利用価値が高い
と考えられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の観点
から大腸菌リボヌクレアーゼＨの酵素活性を保持しなが
ら、その安定性を高めることを目的として、種々の改変
を試みた結果、該酵素の遺伝子に部位特異的変異を導入
することにより該酵素の第６２番目のＨis（ヒスチジ
ン）をＰro（プロリン）に置換した変異体が、天然型の
リボヌクレアーゼＨよりも熱および変性剤に対する安定
性が優れていることを見い出し、かつ、その酵素活性も
従来の安定化した変異リボヌクレアーゼよりも高く、天
然型リボヌクレアーゼＨとほぼ同等であることを確認
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第６２番目のＨisがＰroで置換されたアミノ
酸配列からなる変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを提供
するものである。

【０００８】また、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第６２番目のＨisをコードしているコドン、
ＣＡＴがＰroをコードするコドンに変換されている変異
型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を提供するものであ
る。また、本発明は上記変異型リボヌクレアーゼＨを大
腸菌で発現させるための発現ベクターを提供するもので
ある。

【０００９】また本発明は、上記の発現ベクターで形質
転換された変異型リボヌクレアーゼＨ産生性の形質転換
体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転換
体を培養することにより、高い安定性を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨを製造する方法を提供するものであ
る。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ Ｌaboratoy Ｍ
anual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratoy)に詳述され
ており、上記変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子、発
現ベクター、形質転換体は、この成書に記載の一般的手
法に従って、例えば後記実施例に示した様に常法通り作
製することができる。尚、本発明の発現ベクターは、大
腸菌内で機能するものであれば特に制限はないが、バク
テリオファージλのＰ_LおよびＰ_Rプロモーターの支配下
に上記変異型リボヌクレアーゼＨ遺伝子を含有している
ものが好ましい。

【００１０】

【発明の効果】本発明により安定性が高められた変異型
大腸菌リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレアーゼ
Ｈでは失活してしまう変性剤濃度よりも高い濃度あるい
は高い温度下でさえも変性することがない（実施例３参
照）ので、このような条件下での取扱いが可能である。
さらに、本発明の変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨは、
耐久性等も向上していると期待され、従来のリボヌクレ
アーゼＨよりも失活しにくく、安定に保存することがで
きるので、取り扱いが容易になることは理解されるであ
ろう。また、本発明の変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ
は天然型リボヌクレアーゼＨと同等の酵素活性を有し、
従来の安定化した変異型リボヌクレアーゼＨよりも少量
で同等の酵素活性を得ることができる。

【００１１】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。

【００１２】実施例１ プラスミドpＪＨ６２Ｐの作製 プラスミドpＪＨ６２Ｐの作製の概略を図１に示す。ま
ず、天然型リボヌクレアーゼＨの大腸菌での発現プラス
ミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５１８８参照）のr
nh遺伝子を鋳型として合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝子への点突然変異の
導入を行った。

【００１３】合成オリゴヌクレオチドとしては、化学合
成したオリゴヌクレオチドを用いた。用いたオリゴヌク
レオチドを図２に示す。図１に示すように、まず、pＡ
Ｋ６００を鋳型ＤＮＡとし、ＳphＩの制限酵素部位を含
む５'−プライマー(１)と変異導入用３'−プライマー
(４)により約２００bpのＤＮＡ断片を、また、変異導入
用５'−プライマー(３)とＳalＩ部位を含む３'−プライ
マー(２)により約３４０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣ
Ｒ反応により増幅し、Ｈis⁶²をＰro⁶²に変換した変異rn
h遺伝子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧene Ａm
p Ｋit(Ｔakara)の説明書に従って行った。上記rnh遺伝
子断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、両
者を混合し、５'−プライマー(１)と３'−プライマー
(２)を添加して再度ＰＣＲ反応を行うことにより、Ｓph
Ｉ、ＳalＩ制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子断
片を得た。得られた約５００bpの変異rnh断片の両端に
あるＳphＩおよびＳalＩ部位を制限酵素ＳphＩおよびＳ
alＩで切断した後、消化物を１.５％アガロースゲル電
気泳動にかけ、約５００bpの変異rnhＳphＩ−ＳalＩ遺
伝子断片を切り出し抽出して精製した。

【００１４】次に、このようにして得られた変異遺伝子
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０
４(ドイツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで
消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動
により精製した後、上記約５００bpの変異rnh遺伝子Ｓp
hＩ−ＳalＩ断片とライゲーションすることにより環化
した。ライゲーションは市販のライゲーションキット
(Ｔakara)を用い、添付の説明書に正確に従って行っ
た。このようにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１
０１株を形質転換し、形質転換体より変異型リボヌクレ
アーゼＨ発現用プラスミドベクターpＪＨ６２Ｐを得
た。

【００１５】上記のようにして得られた形質転換菌エシ
エリシア・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＨ６２Ｐは工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工
研菌寄第１２３２０号、受託日：平成３年６月２１
日）。

【００１６】実施例２ 変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｈ
６２Ｐ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＨ６２Ｐを１００μg
／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２l中、３０℃で振
盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約８０まで生
育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に３.５時
間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この時のクレ
ット値は約１８０であった。

【００１７】得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含む１０
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)４０mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ−
５２カラム(１０ml)およびＰ−１１カラム(４ml)にこの
順序で通した。この条件下、変異型リボヌクレアーゼＨ
(Ｈ６２Ｐ)は、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１１
カラムに吸着する。ＴＥ(pＨ７.５)１０ml、次いで０.
１Ｍ ＮaＣlを含むＴＥ(pＨ７.５)１０mlを流した後、
ＮaＣl濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることによ
りＰ−１１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｈ６
２Ｐ)を溶出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｈ６２
Ｐ)を含むＰ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とし
た。精製標品は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを
与え、逆相ＨＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量
は２１.７mg／l培養液であった。精製標品の同定は、ア
クロモバクタープロテアーゼIにより消化して得られる
ペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして
各フラグメントピークの溶出位置を確認するとともに、
６２位のアミノ酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列
分析により行った。

【００１８】得られた精製標品の０．１Ｍ ＮaＣlを含
む１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における
２００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一で
あり、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変
化は見られなかった。また、以下の方法により酵素活性
を測定し、比活性を測定したところ、得られた変異型酵
素は２１Ｕ／mgの比活性を有しており、天然型酵素の約
１１０％の酵素活性を保持していた。得られた比較結果
を以下の表１に示す。

【００１９】活性は、[³Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮＡを
基質として用い、３７℃、１分間に１μmolの酸可溶性
物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義した。
タンパク量は変異型リボヌクレアーゼＨと天然型リボヌ
クレアーゼＨとが同じ吸光係数を持つという仮定のもと
にε₂₈₀＝１５７６Ｍ^-1・cm^-1を用いて２８０nmにおけ
る吸光度を測定することにより求めた。

【表１】 天然型と変異型リボヌクレアーゼＨの酵素活性の比較 酵素名 比活性(Ｕ／mg) 天然型リボヌクレアーゼＨ ２０ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｈ６２Ｐ) ２１

【００２０】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｓ
６８Ｖ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨと、変異型リボヌクレアーゼ
Ｈ(Ｈ６２Ｐ)の変性剤に対する安定性を測定し、比較し
た。変性剤としては０〜８Ｍの尿素を含む、２０mＭ酢
酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.０)を用い、２５℃での変性
の割合を２２０nmにおけるＣＤ値で測定した。測定は２
mm光路長のセルを用い、日本分光社製Ｊ−６００により
行った。測定により得られた変性曲線を図３に示す。両
酵素とも７Ｍの尿素でほぼ完全に変性した。変異型リボ
ヌクレアーゼＨ(Ｈ６２Ｐ)の変性曲線は天然型の変性曲
線よりも尿素濃度の高いほうへシフトしており、明らか
に変性剤に対する安定性が増加していた。全体の５０％
が変性するときの尿素濃度を比較すると変異型リボヌク
レアーゼＨ(Ｈ６２Ｐ)は天然型よりも約０.４７Ｍ大き
かった。得られた結果を以下の表２に示す。尚、尿素に
よる変性は、２０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)
中、２５℃で行った。

【表２】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの塩酸グアニジンに対する安定性の比 較 酵 素 名 ５０％変性に要する尿素濃度（Ｍ） 天然型リボヌクレアーゼＨ ４.９９ 変異型リボヌクレアーゼ(Ｈ６２Ｐ) ５.４６

【００２１】天然型リボヌクレアーゼＨと変異型リボヌ
クレアーゼＨ（Ｈ６２Ｐ）の熱安定性についても測定
し、比較した。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０
nmにおけるＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行
った。熱変性実験は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸
グアニジンおよび１mＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）
を含む２０mＭ酢酸ナトリウム（pＨ５.５）中で行っ
た。測定により得られた変性曲線を図４に示す。変異型
リボヌクレアーゼＨ（Ｈ６２Ｐ）の熱変性曲線は天然型
の熱変性曲線よりも高温側へシフトしており、明らかに
熱安定性が増加していた。全体の５０％が変性するとき
の温度を比較すると変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｈ６２
Ｐ）は天然型よりも４.１℃安定化していた。得られた
結果を以下の表３に示す。

【表３】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの熱安定性の比較 酵 素 名 ５０％変性するときの温度（℃） 天然型リボヌクレアーゼＨ ５１.８ 変異型リボヌクレアーゼ(Ｈ６２Ｐ) ５５.９

【００２２】以上の結果から、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第６２番目のＨisをＰroに変換することによ
り、変性剤および熱に対する安定性が向上することが確
認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpＪＨ６２Ｐの構築を示す模式図
である。

【図２】 部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は突然変異部位に対応する塩基（Ｐ
ro⁶²に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。

【図３】 天然型リボヌクレアーゼＨおよび変異型リボ
ヌクレアーゼＨ(Ｈ６２Ｐ)の尿素による変性曲線を示す
グラフである。

【図４】 天然型リボヌクレアーゼＨおよび変異型リボ
ヌクレアーゼＨ(Ｈ６２Ｐ)の熱変性曲線を示すグラフで
ある。

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【手続補正書】

【提出日】平成３年９月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｈ
６２Ｐ）の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨと、変異型リボヌクレアーゼ
Ｈ（Ｈ６２Ｐ）の変性剤に対する安定性を測定し、比較
した。変性剤としては０〜８Ｍの尿素を含む、２０ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、２５℃で
の変性の割合を２２０ｎｍにおけるＣＤ値で測定した。
測定は２ｍｍ光路長のセルを用い、日本分光社製Ｊ−６
００により行った。測定により得られた変性曲線を図３
に示す。両酵素とも７Ｍの尿素でほぼ完全に変性した。
変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｈ６２Ｐ）の変性曲線は天
然型の変性曲線よりも尿素濃度の高いほうへシフトして
おり、明らかに変性剤に対する安定性が増加していた。
全体の５０％が変性するときの尿素濃度を比較すると変
異型リボヌクレアーゼＨ（Ｈ６２Ｐ）は天然型よりも約
０．４７Ｍ大きかった。得られた結果を以下の表２に示
す。尚、尿素による変性は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）中、２５℃で行った。

【表２】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの塩酸グアニジンに対する安定性の比 較 酵素名 ５０％変性に要する尿素濃度（Ｍ） 天然型リボヌクレアーゼＨ ４．９９ 変異型リボヌクレアーゼ（Ｈ６２Ｐ） ５．４６

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミ
   ノ酸配列において、第６２番目のヒスチジンをプロリン
   で置換されたアミノ酸配列を有する変異型大腸菌リボヌ
   クレアーゼＨ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の変異型大腸菌リボヌク
   レアーゼＨを暗号化している変異型大腸菌リボヌクレア
   ーゼＨ構造遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の変異型大腸菌リボヌク
   レアーゼＨ構造遺伝子を大腸菌の遺伝子発現系制御下に
   含有している組換え体プラスミド。
4. 【請求項４】 pＪＨ６２Ｐである請求項３に記載の組
   換え体プラスミド。
5. 【請求項５】 請求項３または４のいずれかに記載の組
   換え体プラスミドで形質転換された大腸菌株。
6. 【請求項６】 ＨＢ１０１／pＪＨ６２Ｐである請求項
   ５に記載の大腸菌株。
7. 【請求項７】 請求項５または６のいずれかに記載の大
   腸菌株を培養し、得られた培養液から変異型大腸菌リボ
   ヌクレアーゼＨを回収することを特徴とする変異型大腸
   菌リボヌクレアーゼＨの製造方法。