JPH053784A - ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株 - Google Patents
ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株Info
- Publication number
- JPH053784A JPH053784A JP3183187A JP18318791A JPH053784A JP H053784 A JPH053784 A JP H053784A JP 3183187 A JP3183187 A JP 3183187A JP 18318791 A JP18318791 A JP 18318791A JP H053784 A JPH053784 A JP H053784A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- strain
- antibody
- cell
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトリンパ芽球細胞株（ＩＭ−９）のヒポキ
サンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損突然変異株かつウアバイン耐性突
然変異株から、免疫グロブリンを産生しないクローンを
分離し、これをヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親株と
して使用する。 【効果】 本発明の新規親細胞株は、ヒト抗体産生細胞
とのヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親株として利用で
き、ヒト抗体産生細胞との細胞融合により、各種疾患の
診断、予防、治療に用い得るヒトモノクローナル抗体の
作製が達成される。また、当該親株をヒトリンパ球また
はヒトリンパ芽球との融合に用いた場合、高い融合効率
を示し、その融合によって得られたハイブリドーマに高
い抗体産生能を与え、当該ハイブリドーマで産生される
抗体の活性を低下させない。
サンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損突然変異株かつウアバイン耐性突
然変異株から、免疫グロブリンを産生しないクローンを
分離し、これをヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親株と
して使用する。 【効果】 本発明の新規親細胞株は、ヒト抗体産生細胞
とのヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親株として利用で
き、ヒト抗体産生細胞との細胞融合により、各種疾患の
診断、予防、治療に用い得るヒトモノクローナル抗体の
作製が達成される。また、当該親株をヒトリンパ球また
はヒトリンパ芽球との融合に用いた場合、高い融合効率
を示し、その融合によって得られたハイブリドーマに高
い抗体産生能を与え、当該ハイブリドーマで産生される
抗体の活性を低下させない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト−ヒトハイブリド
ーマ作製用として有用な新規な親細胞株に関する。更に
詳しくは、ヒトリンパ芽球細胞株（ＩＭ−９）の突然変
異株に由来し、それ自体免疫グロブリンを産生せず、か
つ、ヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球と融合した場
合、高い融合効率を示し、その融合によって得られたハ
イブリドーマに高い抗体産生能を与え、当該ハイブリド
ーマで産生される抗体の活性を低下させないことを特徴
とするヒト−ヒトハイブリドーマ作製用の新規な親細胞
株に関する。
ーマ作製用として有用な新規な親細胞株に関する。更に
詳しくは、ヒトリンパ芽球細胞株（ＩＭ−９）の突然変
異株に由来し、それ自体免疫グロブリンを産生せず、か
つ、ヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球と融合した場
合、高い融合効率を示し、その融合によって得られたハ
イブリドーマに高い抗体産生能を与え、当該ハイブリド
ーマで産生される抗体の活性を低下させないことを特徴
とするヒト−ヒトハイブリドーマ作製用の新規な親細胞
株に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９７５年に、ケラーとミルスタイン
は、マウス骨髄腫細胞とマウス脾臓細胞を融合してハイ
ブリドーマを得、ＨＡＴ（ヒポキサン−アミノプテリン
−チミジン）選択培地にて培養することにより、初めて
マウスモノクローナル抗体を得る方法を確立した[Natur
e, 256, 495-497 (1975)参照] 。その後、ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの作製にあたり、
ヒト抗体産生細胞と融合する親細胞株として、マウス骨
髄腫細胞株、マウス骨髄腫細胞株とヒト細胞のハイブリ
ドーマであるヘテロ骨髄腫細胞株、ヒト骨髄腫細胞株あ
るいはヒトリンパ芽球細胞等が検討されてきた。
は、マウス骨髄腫細胞とマウス脾臓細胞を融合してハイ
ブリドーマを得、ＨＡＴ（ヒポキサン−アミノプテリン
−チミジン）選択培地にて培養することにより、初めて
マウスモノクローナル抗体を得る方法を確立した[Natur
e, 256, 495-497 (1975)参照] 。その後、ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの作製にあたり、
ヒト抗体産生細胞と融合する親細胞株として、マウス骨
髄腫細胞株、マウス骨髄腫細胞株とヒト細胞のハイブリ
ドーマであるヘテロ骨髄腫細胞株、ヒト骨髄腫細胞株あ
るいはヒトリンパ芽球細胞等が検討されてきた。
【０００３】しかしながら、マウス骨髄腫細胞株、ヘテ
ロ骨髄腫細胞株を親細胞株に用いてヒト抗体産生株と融
合した場合、作製されたハイブリドーマは、ヒト抗体と
共にマウスの蛋白質を合成、分泌し、これらはヒトにと
って異物と認識されるため、ヒトへ投与するモノクロー
ナル抗体の産生株として用いるには適当でない。
ロ骨髄腫細胞株を親細胞株に用いてヒト抗体産生株と融
合した場合、作製されたハイブリドーマは、ヒト抗体と
共にマウスの蛋白質を合成、分泌し、これらはヒトにと
って異物と認識されるため、ヒトへ投与するモノクロー
ナル抗体の産生株として用いるには適当でない。
【０００４】一方、ヒト染色体のみを有する親細胞株と
ヒト抗体産生株の融合によるヒト−ヒトハイブリドーマ
の作製の試みは、1980年にオルソンとカプラン、及びク
ローチェら[L.Olsson とH.S.Kaplan, Proc.Natl.Acad.S
ci., 77, 5429 (1980)及びC.M.Croce ら、Nature, 288.
488 (1980)]が報告し、その後、多くのヒト−ヒトハイ
ブリドーマの作製の報告があるが、ヒト−ヒトハイブリ
ドーマに高い抗体産生能を付与できるようなヒト−ヒト
ハイブリドーマ作製に適した親細胞株は、程度の差はあ
れ細胞自体がヒト免疫グロブリンを産生している。
ヒト抗体産生株の融合によるヒト−ヒトハイブリドーマ
の作製の試みは、1980年にオルソンとカプラン、及びク
ローチェら[L.Olsson とH.S.Kaplan, Proc.Natl.Acad.S
ci., 77, 5429 (1980)及びC.M.Croce ら、Nature, 288.
488 (1980)]が報告し、その後、多くのヒト−ヒトハイ
ブリドーマの作製の報告があるが、ヒト−ヒトハイブリ
ドーマに高い抗体産生能を付与できるようなヒト−ヒト
ハイブリドーマ作製に適した親細胞株は、程度の差はあ
れ細胞自体がヒト免疫グロブリンを産生している。
【０００５】例えば、ヒト骨髄腫細胞株、RPMI 8226 と
ヒトリンパ芽球細胞株KR-4とのハイブリドーマに選択特
性を付与したKR-12 は、現在数少ないヒトハイブリドー
マ作製に適した親細胞株であるが、それぞれの細胞株に
由来する重鎖 (ヒトガンマ鎖) 及び軽鎖（ヒトラムダ
鎖、ヒトカッパ鎖）を産生、分泌する（特開昭61−1288
86号公報）。
ヒトリンパ芽球細胞株KR-4とのハイブリドーマに選択特
性を付与したKR-12 は、現在数少ないヒトハイブリドー
マ作製に適した親細胞株であるが、それぞれの細胞株に
由来する重鎖 (ヒトガンマ鎖) 及び軽鎖（ヒトラムダ
鎖、ヒトカッパ鎖）を産生、分泌する（特開昭61−1288
86号公報）。
【０００６】その他、ヒト骨髄腫細胞あるいはヒトリン
パ芽球細胞に由来するヒト−ヒトハイブリドーマ作製用
親株としては、ATCC CRL 8032 及び ATCC CRL 8038（特
開昭57−126424号公報）、WI-L2-729 HF2 （特開昭57-2
08987 号公報）、ATCC CRL 8083 （特開昭58−501257号
公報）、ATCC CRL 8147 （特開昭59−66883 号公報）、
UC 7296 （US−4451570 号公報）、ATCC CRL 8221 （特
開昭59−198970号公報）LTR228（特開昭60-251881 号公
報）、HIH/T01 （特開昭62−155083号公報）、ATCC HB9
320 （特開平1-60373 号公報）が知られている。これら
親細胞株の一部は、ヒト免疫グロブリンを分泌していな
いが、いずれもヒト免疫グロブリンを細胞内で産生して
いる。
パ芽球細胞に由来するヒト−ヒトハイブリドーマ作製用
親株としては、ATCC CRL 8032 及び ATCC CRL 8038（特
開昭57−126424号公報）、WI-L2-729 HF2 （特開昭57-2
08987 号公報）、ATCC CRL 8083 （特開昭58−501257号
公報）、ATCC CRL 8147 （特開昭59−66883 号公報）、
UC 7296 （US−4451570 号公報）、ATCC CRL 8221 （特
開昭59−198970号公報）LTR228（特開昭60-251881 号公
報）、HIH/T01 （特開昭62−155083号公報）、ATCC HB9
320 （特開平1-60373 号公報）が知られている。これら
親細胞株の一部は、ヒト免疫グロブリンを分泌していな
いが、いずれもヒト免疫グロブリンを細胞内で産生して
いる。
【０００７】このようにそれ自体がヒト免疫グロブリン
を産生する親細胞株を細胞融合に用いると、作製したヒ
トハイブリドーマはヒト抗体産生株由来の免疫グロブリ
ンと共に、親細胞株由来の免疫グロブリンを産生するた
め、時に、一部が組み換わった複数の抗体分泌する可能
性があり、不都合である。
を産生する親細胞株を細胞融合に用いると、作製したヒ
トハイブリドーマはヒト抗体産生株由来の免疫グロブリ
ンと共に、親細胞株由来の免疫グロブリンを産生するた
め、時に、一部が組み換わった複数の抗体分泌する可能
性があり、不都合である。
【０００８】そのため、ヒト−ヒトハイブリドーマ作製
に適した既存の親細胞株よりヒト免疫グロブリンを産生
しない細胞株を変異誘導することが試みられている。例
えば、L.B.Schook編著、Monoclonal Antibody Producti
on Techniques and Applications (1987), p.12, MARCE
L DEKKER, INC.には、KR−12より変異を誘導した細胞集
団に補体存在下に抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、細胞膜表面にヒト免疫グロブリンを発現している細
胞を死滅させた後、セルソーター及び限界希釈法による
クローニング操作をして細胞表面にヒト免疫グロブリン
が非発現な細胞を分離したが、ヒト免疫グロブリン非産
生細胞の取得には至らなかったことが記載されている。
に適した既存の親細胞株よりヒト免疫グロブリンを産生
しない細胞株を変異誘導することが試みられている。例
えば、L.B.Schook編著、Monoclonal Antibody Producti
on Techniques and Applications (1987), p.12, MARCE
L DEKKER, INC.には、KR−12より変異を誘導した細胞集
団に補体存在下に抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、細胞膜表面にヒト免疫グロブリンを発現している細
胞を死滅させた後、セルソーター及び限界希釈法による
クローニング操作をして細胞表面にヒト免疫グロブリン
が非発現な細胞を分離したが、ヒト免疫グロブリン非産
生細胞の取得には至らなかったことが記載されている。
【０００９】また、特開昭６３−１８５３７４号公報に
は、ヒトハイブリドーマ作製用親株として、ヒトリンパ
芽球細胞に由来するヒト免疫グロブリン非合成細胞株Ｈ
ＯＭＯ７の記載がある。しかし、これとリンパ球とを融
合した場合の融合効率が１×１０-5とあるが、作製した
ハイブリドーマの抗体産生量について実施例の記載はな
い。
は、ヒトハイブリドーマ作製用親株として、ヒトリンパ
芽球細胞に由来するヒト免疫グロブリン非合成細胞株Ｈ
ＯＭＯ７の記載がある。しかし、これとリンパ球とを融
合した場合の融合効率が１×１０-5とあるが、作製した
ハイブリドーマの抗体産生量について実施例の記載はな
い。
【００１０】さらに、特開平２−２４２６７１号公報に
おいても、ヒト免疫グロブリン非産生株をハイブリドー
マ作製用親株としたとあるが、本実施例においては親株
の抗体量の有無の確認を培養上清中においてのみしか行
っていない。よってヒト免疫グロブリン非分泌性を確認
しているのみで、細胞中の抗体の有無、即ちヒト免疫グ
ロブリン非産生性の確認にはなされていない。また、こ
れをリンパ芽球細胞と融合した場合、融合効率は最も高
いものでも２．６×１０-6しか示していない。
おいても、ヒト免疫グロブリン非産生株をハイブリドー
マ作製用親株としたとあるが、本実施例においては親株
の抗体量の有無の確認を培養上清中においてのみしか行
っていない。よってヒト免疫グロブリン非分泌性を確認
しているのみで、細胞中の抗体の有無、即ちヒト免疫グ
ロブリン非産生性の確認にはなされていない。また、こ
れをリンパ芽球細胞と融合した場合、融合効率は最も高
いものでも２．６×１０-6しか示していない。
【００１１】よって、ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用
親株としては、それ自体はヒト免疫グロブリンを産生せ
ず、しかもヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球と融合し
た場合、高い融合効率を示し、その融合によって得られ
たハイブリドーマに高い抗体産生能を与え、当該ハイブ
リドーマで産生される抗体の活性を低下させない等の条
件を兼ね備えるものが望まれている。
親株としては、それ自体はヒト免疫グロブリンを産生せ
ず、しかもヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球と融合し
た場合、高い融合効率を示し、その融合によって得られ
たハイブリドーマに高い抗体産生能を与え、当該ハイブ
リドーマで産生される抗体の活性を低下させない等の条
件を兼ね備えるものが望まれている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
事情に鑑み、作製したハイブリドーマに高い抗体産生能
を付与し、細胞自体は免疫グロブリンを産生しないヒト
−ヒトハイブリドーマ作製用親株を創製すべく、各種研
究を重ねてきた。その結果、リンパ芽球細胞株（ＩＭ−
９）の突然変異株から、免疫グロブリンを産生しないク
ローンを分離し、これをヒト−ヒトハイブリドーマ作製
用親株として使用したところ、抗体産生細胞との融合効
率の度合いが従来知られた水準に比べはるかに優れてお
り（リンパ球の場合、０．５〜１×１０-5、リンパ芽球
の場合２〜６×１０-5）、また作製したハイブリドーマ
に高い抗体産生能を与え、かつ産生される抗体の活性を
低下させないことを見出し、本発明を完成した。
事情に鑑み、作製したハイブリドーマに高い抗体産生能
を付与し、細胞自体は免疫グロブリンを産生しないヒト
−ヒトハイブリドーマ作製用親株を創製すべく、各種研
究を重ねてきた。その結果、リンパ芽球細胞株（ＩＭ−
９）の突然変異株から、免疫グロブリンを産生しないク
ローンを分離し、これをヒト−ヒトハイブリドーマ作製
用親株として使用したところ、抗体産生細胞との融合効
率の度合いが従来知られた水準に比べはるかに優れてお
り（リンパ球の場合、０．５〜１×１０-5、リンパ芽球
の場合２〜６×１０-5）、また作製したハイブリドーマ
に高い抗体産生能を与え、かつ産生される抗体の活性を
低下させないことを見出し、本発明を完成した。
【００１３】すなわち、本発明は、ヒトリンパ芽球細胞
株（ＩＭ−９）のヒポキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（以下ＨＧＰＲＴと略す）欠
損突然変異株かつウアバイン耐性突然変異株から、免疫
グロブリンを産生しないクローンを分離し、これをヒト
−ヒトハイブリドーマ作製用親株として使用することに
関する。
株（ＩＭ−９）のヒポキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（以下ＨＧＰＲＴと略す）欠
損突然変異株かつウアバイン耐性突然変異株から、免疫
グロブリンを産生しないクローンを分離し、これをヒト
−ヒトハイブリドーマ作製用親株として使用することに
関する。
【００１４】以下、これを詳述する。
〔Ｉ〕免疫グロブリン非合成細胞株の作製
親細胞株の出発材料としてヒトリンパ芽球細胞株ＩＭ−
９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）の突然変異細胞株を使用
する。ＩＭ−９を８−アザグアニン耐性変異処理および
ウアバイン耐性変異処理をしてＨＰＬＯを分離する。免
疫グロブリン非合成の細胞は細胞膜上に免疫グロブリン
が存在しないと考えられるので、ＨＰＬＯを蛍光色素
（ＦＩＴＣ）標識イムノグロブリンで染色し、非染色性
の細胞をセル・ソーターで濃縮し、更に限界希釈法でク
ローニングすることによってヒト免疫イムノグロブリン
非産生株の単離を行う。最後に８−アザグアニンとウア
バインを含む培地への適応を確認することによってヒト
免疫グロブリン非合成突然変異株を得ることができる。
得られた細胞株は、ＮＰ１０１、ＮＰ１９７と命名さ
れ、醗酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれ受入番号５０３４
０、５０３４１で寄託された。
９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）の突然変異細胞株を使用
する。ＩＭ−９を８−アザグアニン耐性変異処理および
ウアバイン耐性変異処理をしてＨＰＬＯを分離する。免
疫グロブリン非合成の細胞は細胞膜上に免疫グロブリン
が存在しないと考えられるので、ＨＰＬＯを蛍光色素
（ＦＩＴＣ）標識イムノグロブリンで染色し、非染色性
の細胞をセル・ソーターで濃縮し、更に限界希釈法でク
ローニングすることによってヒト免疫イムノグロブリン
非産生株の単離を行う。最後に８−アザグアニンとウア
バインを含む培地への適応を確認することによってヒト
免疫グロブリン非合成突然変異株を得ることができる。
得られた細胞株は、ＮＰ１０１、ＮＰ１９７と命名さ
れ、醗酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれ受入番号５０３４
０、５０３４１で寄託された。
【００１５】(i) 親株の免疫蛍光染色
親株（ＨＰＬＯ）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含
むＲＰＭＩ１６４０基礎培地に懸濁し、これを遠心分離
し、回収した細胞ペレットをＦＩＴＣ（蛍光色素）標識
抗ヒト免疫グロブリンまたは抗ヒト免疫グロブリン（Ｉ
ｇＧ）／ＰＢＳに溶液に懸濁する。
むＲＰＭＩ１６４０基礎培地に懸濁し、これを遠心分離
し、回収した細胞ペレットをＦＩＴＣ（蛍光色素）標識
抗ヒト免疫グロブリンまたは抗ヒト免疫グロブリン（Ｉ
ｇＧ）／ＰＢＳに溶液に懸濁する。
【００１６】(ii) 細胞選別分離
上記ＦＩＴＣ標識抗ヒト免疫グロブリンまたは抗ヒト免
疫グロブリン（ＩｇＧ）で免疫蛍光染色後、低温培養
し、これに血清を添加し、遠沈にて回収した細胞ペレッ
トを無血清培地に懸濁する。その後、さらに遠沈とそれ
により回収した細胞ペレットの無血清培地への懸濁操作
を数回繰り返した細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ(Fluorescenc
e Activated Cell Sorter)にかける。その染色パターン
を調べた上で非染色性画分を分離した後に継代培養す
る。さらにセルソーティングを数回繰り返し、免疫グロ
ブリン非合成の細胞を選別分離する。
疫グロブリン（ＩｇＧ）で免疫蛍光染色後、低温培養
し、これに血清を添加し、遠沈にて回収した細胞ペレッ
トを無血清培地に懸濁する。その後、さらに遠沈とそれ
により回収した細胞ペレットの無血清培地への懸濁操作
を数回繰り返した細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ(Fluorescenc
e Activated Cell Sorter)にかける。その染色パターン
を調べた上で非染色性画分を分離した後に継代培養す
る。さらにセルソーティングを数回繰り返し、免疫グロ
ブリン非合成の細胞を選別分離する。
【００１７】(iii) クローニング
上記で選別分離した細胞株のクローニングは、限界希釈
法により行うことができる。例えば、細胞を20％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地に分散し、マウス胸腺細胞
をフィーダー細胞として96ウェルマイクロプレートに
１．０ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、５％炭酸
ガス存在下37℃で培養する。単一のコロニーとして増殖
の認められたウェルについて培養上清中に分泌されるヒ
ト免疫グロブリン、及び細胞内に合成される免疫グロブ
リンの有無を調べる。
法により行うことができる。例えば、細胞を20％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地に分散し、マウス胸腺細胞
をフィーダー細胞として96ウェルマイクロプレートに
１．０ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、５％炭酸
ガス存在下37℃で培養する。単一のコロニーとして増殖
の認められたウェルについて培養上清中に分泌されるヒ
ト免疫グロブリン、及び細胞内に合成される免疫グロブ
リンの有無を調べる。
【００１８】(iv) 培養上清中に分泌されるヒト免疫グ
ロブリン量、細胞内に合成される免疫グロブリン量の測
定 培養上清中のヒト免疫グロブリンの測定は、一般のラジ
オイムノアッセイ法や酵素抗体法などにより行うことが
できる。例えば、サンドイッチELISA 法による場合は、
固相に抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ヒトＩｇＧ（ヒ
トγ鎖）抗体、抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を固定
し、培養上清の一部を反応させる。次に酵素標識抗ヒト
免疫グロブリン〔例えば、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト
ＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト
ＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応させ、基質を加え酵素
反応により生じる呈色割合により培養上清中のヒト免疫
グロブリンの検出および量を測定できる。一方、細胞内
に合成される免疫グロブリンの測定については、例えば
細胞をミリタイターＳＶ上でＰＢＳ（−）または生理食
塩水で数回洗浄後、0.3% H2O／メタノールで処理し、次
に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ペルオキシ
ダーゼ標識ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応させ、
基質を加え酵素反応により生じる呈色割合により測定す
ることができる。
ロブリン量、細胞内に合成される免疫グロブリン量の測
定 培養上清中のヒト免疫グロブリンの測定は、一般のラジ
オイムノアッセイ法や酵素抗体法などにより行うことが
できる。例えば、サンドイッチELISA 法による場合は、
固相に抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ヒトＩｇＧ（ヒ
トγ鎖）抗体、抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を固定
し、培養上清の一部を反応させる。次に酵素標識抗ヒト
免疫グロブリン〔例えば、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト
ＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト
ＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応させ、基質を加え酵素
反応により生じる呈色割合により培養上清中のヒト免疫
グロブリンの検出および量を測定できる。一方、細胞内
に合成される免疫グロブリンの測定については、例えば
細胞をミリタイターＳＶ上でＰＢＳ（−）または生理食
塩水で数回洗浄後、0.3% H2O／メタノールで処理し、次
に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ペルオキシ
ダーゼ標識ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応させ、
基質を加え酵素反応により生じる呈色割合により測定す
ることができる。
【００１９】[II] 細胞とヒトリンパ球との細胞融合
(i) 融合
本発明の免疫グロブリン非合成の親細胞株ＮＰ１０１、
ＮＰ１９７の培養は、１×１０5 個／ｍｌ〜５×１０5
個／ｍｌの細胞密度となるように培養液に分散し、適当
な細胞培養容器に播種した後、５％炭酸ガス存在下、37
℃、３〜４日に１度の継代培養で行うことができる。培
養は、無血清培地または血清培地で行い得る。無血清培
地としては、例えばイスコフ変法ダルベッコＭＥＭ培地
（ＩＭＤＭ）、ＲＩＴＣ５６−２等が例示される。また
血清培地としては、ＲＰＭＩ１６４０、ダルベッコの変
法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＩＴＣ５６
−２等の基礎培地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加
したものが例示される。
ＮＰ１９７の培養は、１×１０5 個／ｍｌ〜５×１０5
個／ｍｌの細胞密度となるように培養液に分散し、適当
な細胞培養容器に播種した後、５％炭酸ガス存在下、37
℃、３〜４日に１度の継代培養で行うことができる。培
養は、無血清培地または血清培地で行い得る。無血清培
地としては、例えばイスコフ変法ダルベッコＭＥＭ培地
（ＩＭＤＭ）、ＲＩＴＣ５６−２等が例示される。また
血清培地としては、ＲＰＭＩ１６４０、ダルベッコの変
法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＩＴＣ５６
−２等の基礎培地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加
したものが例示される。
【００２０】本発明の親細胞株は、ＨＧＰＲＴ欠損突然
変異株、ウアバイン耐性突然変異株である。このＨＧＰ
ＲＴ欠損株は、10μg/mlから20μg/ml濃度の８−アザグ
アニンを前述の培養液に添加して培養することにより維
持できる。また、ウアバイン耐性突然変異株は、１μM
から10μM 濃度のウアバインを含む培養液中で死滅しな
い細胞株を選択することにより得られる。これにより本
親細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミ
ジンを含む培養液（ＨＡＴ培地）、あるいはヒポキサン
チン及びアザセリンを含む培養液（ＨＡ培地）中で死滅
する。本選択性により本発明の親細胞株とヒト抗体産生
細胞とのヒト−ヒトハイブリドーマが作製でき、更に、
作製したハイブリドーマは実質的にヒト抗体産生細胞に
由来する抗体のみを培養液中に分泌する。
変異株、ウアバイン耐性突然変異株である。このＨＧＰ
ＲＴ欠損株は、10μg/mlから20μg/ml濃度の８−アザグ
アニンを前述の培養液に添加して培養することにより維
持できる。また、ウアバイン耐性突然変異株は、１μM
から10μM 濃度のウアバインを含む培養液中で死滅しな
い細胞株を選択することにより得られる。これにより本
親細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミ
ジンを含む培養液（ＨＡＴ培地）、あるいはヒポキサン
チン及びアザセリンを含む培養液（ＨＡ培地）中で死滅
する。本選択性により本発明の親細胞株とヒト抗体産生
細胞とのヒト−ヒトハイブリドーマが作製でき、更に、
作製したハイブリドーマは実質的にヒト抗体産生細胞に
由来する抗体のみを培養液中に分泌する。
【００２１】本発明の親細胞株は、前述の培養液を用い
継代培養を行うことができるとともに、一般に用いられ
る凍結保存液、例えば20％ＦＣＳ、10％ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を含む培地を用いて長期凍結保存が
できる。
継代培養を行うことができるとともに、一般に用いられ
る凍結保存液、例えば20％ＦＣＳ、10％ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を含む培地を用いて長期凍結保存が
できる。
【００２２】本発明の親細胞株ＮＰ１０１、ＮＰ１９７
はヒトリンパ球およびヒトリンパ芽球等のヒト抗体産生
細胞との融合に利用できる。かかるヒト抗体産生細胞に
は、エプスタイン・バー・ウィルス（以下ＥＢＶと略
す）により形質転換した細胞集団、形質転換した細胞集
団からクローニングにより得た単一ＥＢＶ形質転換細
胞、生体内より分離したヒト抗体細胞を含むリンパ球画
分及びヒトＢ細胞画分等を用いることができる。これら
は、通常用いられる各種の分離手段により単離され、本
発明の親細胞との融合に供し得る。
はヒトリンパ球およびヒトリンパ芽球等のヒト抗体産生
細胞との融合に利用できる。かかるヒト抗体産生細胞に
は、エプスタイン・バー・ウィルス（以下ＥＢＶと略
す）により形質転換した細胞集団、形質転換した細胞集
団からクローニングにより得た単一ＥＢＶ形質転換細
胞、生体内より分離したヒト抗体細胞を含むリンパ球画
分及びヒトＢ細胞画分等を用いることができる。これら
は、通常用いられる各種の分離手段により単離され、本
発明の親細胞との融合に供し得る。
【００２３】本発明の親細胞株ＮＰ１０１、ＮＰ１９７
とヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球等のヒト抗体産生
細胞との融合反応は、基本的には公知の細胞融合方法と
同様であり、融合促進剤の存在下において適当な培地中
で行われる。融合促進剤としては、例えばポリエチレン
グリコール（以下、ＰＥＧと略す）が好適に使用され得
る。ＰＥＧとしては、平均分子量1000〜6000程度のもの
が好ましく、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｐ
ＢＳ等の溶液中に30〜50％（Ｗ／Ｖ）の濃度に添加され
るのが適当である。また、上記細胞融合培地には融合効
率を高めるための補助剤として例えばＤＭＳＯ等を添加
してもよい。また、細胞融合においては、本発明の親細
胞に対して１〜10倍、好ましくは２〜３倍の抗体産生細
胞を用いることが望ましい。
とヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球等のヒト抗体産生
細胞との融合反応は、基本的には公知の細胞融合方法と
同様であり、融合促進剤の存在下において適当な培地中
で行われる。融合促進剤としては、例えばポリエチレン
グリコール（以下、ＰＥＧと略す）が好適に使用され得
る。ＰＥＧとしては、平均分子量1000〜6000程度のもの
が好ましく、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｐ
ＢＳ等の溶液中に30〜50％（Ｗ／Ｖ）の濃度に添加され
るのが適当である。また、上記細胞融合培地には融合効
率を高めるための補助剤として例えばＤＭＳＯ等を添加
してもよい。また、細胞融合においては、本発明の親細
胞に対して１〜10倍、好ましくは２〜３倍の抗体産生細
胞を用いることが望ましい。
【００２４】細胞融合は例えば次のようにして行う。親
細胞株ＮＰ１０１、ＮＰ１９７とリンパ球またはリンパ
芽球とを基礎培地中で混合し、遠沈する。得られた細胞
ペレットに３７℃に加温したＰＥＧ溶液を添加する。添
加終了後、基礎培地を少しずつ加えＰＥＧ濃度を下げ
る。これを遠沈し、得られた細胞ペレットにハイブリド
ーマ選別用培地を加え、ハイブリドーマの分離を行う。
選別用培地は、親細胞は死滅し、ハイブリドーマのみが
増殖し得る培地であり、通常ＨＡＴ培地が例示できる。
細胞株ＮＰ１０１、ＮＰ１９７とリンパ球またはリンパ
芽球とを基礎培地中で混合し、遠沈する。得られた細胞
ペレットに３７℃に加温したＰＥＧ溶液を添加する。添
加終了後、基礎培地を少しずつ加えＰＥＧ濃度を下げ
る。これを遠沈し、得られた細胞ペレットにハイブリド
ーマ選別用培地を加え、ハイブリドーマの分離を行う。
選別用培地は、親細胞は死滅し、ハイブリドーマのみが
増殖し得る培地であり、通常ＨＡＴ培地が例示できる。
【００２５】(ii) 融合効率・抗体価及び比活性の評価
融合効率は、細胞融合後、ハイブリドーマのコロニー増
殖が認められたウェル数から次式により算出できる。
殖が認められたウェル数から次式により算出できる。
【００２６】
【数１】
【００２７】細胞の増殖が観察されたウェルの上清中の
抗体価の測定方法は、抗体の種類により異なるが、例え
ばＰＨＡ法、溶血反応、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等の方法で
測定できる。
抗体価の測定方法は、抗体の種類により異なるが、例え
ばＰＨＡ法、溶血反応、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等の方法で
測定できる。
【００２８】培養液中の抗体濃度は、一般に酵素抗体法
により行うことができる。例えば、サンドイッチELISA
法による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔例え
ば、ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、抗ヒトＩｇＭ（ヒト
μ鎖）抗体〕を固定し、培養上清の一部を反応させる。
次に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ペルオキ
シダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキ
シダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応さ
せ、基質を加え酵素反応により生じる呈色割合により培
養上清中のヒト免疫グロブリンの検出および量を測定で
きる。
により行うことができる。例えば、サンドイッチELISA
法による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔例え
ば、ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、抗ヒトＩｇＭ（ヒト
μ鎖）抗体〕を固定し、培養上清の一部を反応させる。
次に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ペルオキ
シダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキ
シダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応さ
せ、基質を加え酵素反応により生じる呈色割合により培
養上清中のヒト免疫グロブリンの検出および量を測定で
きる。
【００２９】また、抗体の比活性は、抗体価を抗体濃度
で割った値とした。
で割った値とした。
【００３０】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明は、これらによって何ら限定されるも
のではない。
挙げるが、本発明は、これらによって何ら限定されるも
のではない。
【００３１】実施例１ ヒト免疫グロブリン非合成株の
作製 親株（ヒトリンパ芽球細胞株／ＨＰＬＯ）を107 個細胞
／15ｍｌ遠沈管にとり、600rpmにて２分間遠心分離し、
遠沈により得られた細胞ペレットを１０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地10ｍｌに懸濁し、再び遠心分離
し、回収した細胞ペレットをＦＩＴＣ（蛍光色素）標識
抗ヒト免疫グロブリンまたは抗ヒトＩｇＧ／ＰＢＳ
（−）（Ｔａｇｏ社Ｎｏ．2193、又は4200を10倍希釈）
300 μｌに懸濁した。その後、これを氷中にて20分間培
養し、ＦＣＳ10ｍｌを添加し、600rpmにて２分間遠心分
離した。遠沈にて回収した細胞ペレットを氷冷した血清
不含ＲＰＭＩ１６４０培地10ｍｌに懸濁し、600rpmにて
２分間遠心分離した。さらに、この遠沈により回収した
細胞ペレットの血清不含培地への懸濁及び遠沈操作を２
回繰り返し行い、最終的に２ｍｌ血清不含培地に懸濁し
た。その後、当該細胞懸濁液を、ＦＡＣＳにかけ、セル
ソーティングを行った。その染色パターンを調べた上で
非染色性画分を継代培養してさらにセルソーティングを
４回繰り返し、免疫グロブリン非合成の細胞を選別分離
した。ソーティング回数に従って各段階の細胞をＳ１〜
Ｓ４と表示した。
作製 親株（ヒトリンパ芽球細胞株／ＨＰＬＯ）を107 個細胞
／15ｍｌ遠沈管にとり、600rpmにて２分間遠心分離し、
遠沈により得られた細胞ペレットを１０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地10ｍｌに懸濁し、再び遠心分離
し、回収した細胞ペレットをＦＩＴＣ（蛍光色素）標識
抗ヒト免疫グロブリンまたは抗ヒトＩｇＧ／ＰＢＳ
（−）（Ｔａｇｏ社Ｎｏ．2193、又は4200を10倍希釈）
300 μｌに懸濁した。その後、これを氷中にて20分間培
養し、ＦＣＳ10ｍｌを添加し、600rpmにて２分間遠心分
離した。遠沈にて回収した細胞ペレットを氷冷した血清
不含ＲＰＭＩ１６４０培地10ｍｌに懸濁し、600rpmにて
２分間遠心分離した。さらに、この遠沈により回収した
細胞ペレットの血清不含培地への懸濁及び遠沈操作を２
回繰り返し行い、最終的に２ｍｌ血清不含培地に懸濁し
た。その後、当該細胞懸濁液を、ＦＡＣＳにかけ、セル
ソーティングを行った。その染色パターンを調べた上で
非染色性画分を継代培養してさらにセルソーティングを
４回繰り返し、免疫グロブリン非合成の細胞を選別分離
した。ソーティング回数に従って各段階の細胞をＳ１〜
Ｓ４と表示した。
【００３２】また、各セルソーティング段階でのイムノ
グロブリン分泌量の変化を表１に示した。表１に示した
ように４回のセルソーティングによりＩｇＧ分泌量８ｎ
ｇ／ｍｌ、ＩｇＭ分泌量検出限界以下の細胞が得られ
た。
グロブリン分泌量の変化を表１に示した。表１に示した
ように４回のセルソーティングによりＩｇＧ分泌量８ｎ
ｇ／ｍｌ、ＩｇＭ分泌量検出限界以下の細胞が得られ
た。
【００３３】
【表１】
【００３４】上記の４回のセルソーティングにより選別
分離したＨＰＬＯ−Ｓ４について、細胞を20％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、マウス胸腺細胞を
フィーダー細胞として９６ウェルマイクロプレートに
１．０ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、５％炭酸
ガス存在下37℃で培養する。４〜６週間後、単一のクロ
ーンとしてコロニーの増殖の認められたウェルは、２３
８／３８４（６２．０％）であった。それら増殖陽性ウ
ェルについて、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＭ）
の分泌、及び産生の有無を調べた。上清中のヒト免疫グ
ロブリンの有無は、ＥＩＡ用９６ウェルマイクロプレー
トを用い、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔（抗ヒトＩｇ
Ｇ（γ）（Ｔａｇｏ社製４１００）または、抗ヒトＩｇ
Ｍ（μ）（Ｔａｇｏ社製４１０２）〕を固定し、酵素標
識抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（γ）（Ｔａｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）
を使用したＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。以下、
ＥＬＩＳＡ法の手技等は常法に従って行った。その結
果、細胞増殖の認められた２３８ウェルの内１６２ウェ
ルの培養上清については、免疫グロブリン分泌陰性（測
定限界以下）であった。
分離したＨＰＬＯ−Ｓ４について、細胞を20％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、マウス胸腺細胞を
フィーダー細胞として９６ウェルマイクロプレートに
１．０ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、５％炭酸
ガス存在下37℃で培養する。４〜６週間後、単一のクロ
ーンとしてコロニーの増殖の認められたウェルは、２３
８／３８４（６２．０％）であった。それら増殖陽性ウ
ェルについて、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＭ）
の分泌、及び産生の有無を調べた。上清中のヒト免疫グ
ロブリンの有無は、ＥＩＡ用９６ウェルマイクロプレー
トを用い、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔（抗ヒトＩｇ
Ｇ（γ）（Ｔａｇｏ社製４１００）または、抗ヒトＩｇ
Ｍ（μ）（Ｔａｇｏ社製４１０２）〕を固定し、酵素標
識抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（γ）（Ｔａｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）
を使用したＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。以下、
ＥＬＩＳＡ法の手技等は常法に従って行った。その結
果、細胞増殖の認められた２３８ウェルの内１６２ウェ
ルの培養上清については、免疫グロブリン分泌陰性（測
定限界以下）であった。
【００３５】一方、細胞内に合成される免疫グロブリン
の測定については、ミリタイターＳＶ（ミリボアー社Ｎ
ｏ．ＳＴＳＶ０９６１０，口径５μｍ）を用いて行っ
た。ミリタイターＳＶを、２％スキムミルクで室温、30
分間ブロックした後、ＰＢＳ（−）または生理食塩水で
３回吸引洗浄を行い、細胞懸濁液を50〜200 μｌ／ｗｅ
ｌｌ添加し、再びＰＢＳ（−）または生理食塩水で３回
吸引洗浄後、0.3 ％H2O2／メタノール50μｌ／ｗｅｌｌ
添加し、室温で30分間静置させた。続いてＰＢＳ（−）
または生理食塩水で３回吸引洗浄を行い、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社製４５００）
または、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔ
ａｇｏ社製４５０２）の各5000倍希釈液（１％ＢＳＡ／
ＰＢＳ（−））を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時
間静置させた。0.05％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で
５回吸引洗浄し、基質液（ＯＰＤ １ｍｇ／ｍｌ，H2O2
0.02 ％）を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、10〜20分間反応
させ、４ＮH2SO4 を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、反応停止
させた。反応液をＥＩＡ用プレート（コースタ社製Ｎ
ｏ．３５９０）に移し492 nmの吸光度を測定した。表２
にその結果を前述の培養上清中のイムノグロブリン分泌
有無と併せて示した。表２に示すように、免疫グロブリ
ン非産生のもの２クローン、及び産生量の少ないもの４
クローンが得られた。その他のサブクローンの殆どは、
免疫グロブリンを分泌しないが産生していた。得られた
サブクローンについて親株としての評価を行った。
の測定については、ミリタイターＳＶ（ミリボアー社Ｎ
ｏ．ＳＴＳＶ０９６１０，口径５μｍ）を用いて行っ
た。ミリタイターＳＶを、２％スキムミルクで室温、30
分間ブロックした後、ＰＢＳ（−）または生理食塩水で
３回吸引洗浄を行い、細胞懸濁液を50〜200 μｌ／ｗｅ
ｌｌ添加し、再びＰＢＳ（−）または生理食塩水で３回
吸引洗浄後、0.3 ％H2O2／メタノール50μｌ／ｗｅｌｌ
添加し、室温で30分間静置させた。続いてＰＢＳ（−）
または生理食塩水で３回吸引洗浄を行い、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社製４５００）
または、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔ
ａｇｏ社製４５０２）の各5000倍希釈液（１％ＢＳＡ／
ＰＢＳ（−））を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時
間静置させた。0.05％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で
５回吸引洗浄し、基質液（ＯＰＤ １ｍｇ／ｍｌ，H2O2
0.02 ％）を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、10〜20分間反応
させ、４ＮH2SO4 を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、反応停止
させた。反応液をＥＩＡ用プレート（コースタ社製Ｎ
ｏ．３５９０）に移し492 nmの吸光度を測定した。表２
にその結果を前述の培養上清中のイムノグロブリン分泌
有無と併せて示した。表２に示すように、免疫グロブリ
ン非産生のもの２クローン、及び産生量の少ないもの４
クローンが得られた。その他のサブクローンの殆どは、
免疫グロブリンを分泌しないが産生していた。得られた
サブクローンについて親株としての評価を行った。
【００３６】
【表２】
【００３７】実施例２ 親株としての評価
実施例１で得られた免疫グロブリンが検出限界以下の２
つのサブクローン（ＮＰ１０１，ＮＰ１９７）を親株と
して評価した。融合相手として、ＴＡＰＣ（抗ＨＢｓＩ
ｇＧ抗体産生ＥＢＶ形質転換細胞）及びＣ５（TK- )
（抗ＳＲＢＣＩｇＭ抗体産生ＥＢＶ形質転換細胞）を用
いた。上記親株（ＮＰ１０１，ＮＰ１９７）と抗体産生
細胞をそれぞれ別々に無血清ＲＰＭＩ１６４０で３回洗
浄し、１：１の割合で細胞融合を行った。まず、これら
の細胞を５０ｍｌの遠心管に移し、混合し、1000ｒｐｍ
で５分間遠心分離し、上清を吸引除去した。得られた細
胞ペレットに、37℃の44％ＰＥＧ（平均分子量4000）及
び５％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌをゆ
っくり添加した。さらに室温で１分間ゆるやかに振盪し
て反応させた。次いで、計３０ｍｌの血清不含ＩＭＤＭ
培地をゆっくり加えた後、1000ｒｐｍで５分間遠心分離
し、得られた細胞ペレットを20％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培
地〔０．２μM のウアバインを含むＨＡＴ培地（１００
μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６
μＭチミジン添加）を添加〕に懸濁し、０．５〜１．０
×１０6 個／ｍｌの細胞懸濁液とし、９６ウェルプレー
トに０．５〜１．０×１０5 個／ウェルずつ播きこみ、
５％炭酸ガス存在下、３７℃でＮａｐｃｏインキュベー
ターで培養した。１週間後に０．２μＭのウアバインを
含むＨＡＴ培地を１００μｌ添加した。以後、増殖の様
子を見ながら、４日〜１週間毎に同培地で半量ずつ培地
交換した。
つのサブクローン（ＮＰ１０１，ＮＰ１９７）を親株と
して評価した。融合相手として、ＴＡＰＣ（抗ＨＢｓＩ
ｇＧ抗体産生ＥＢＶ形質転換細胞）及びＣ５（TK- )
（抗ＳＲＢＣＩｇＭ抗体産生ＥＢＶ形質転換細胞）を用
いた。上記親株（ＮＰ１０１，ＮＰ１９７）と抗体産生
細胞をそれぞれ別々に無血清ＲＰＭＩ１６４０で３回洗
浄し、１：１の割合で細胞融合を行った。まず、これら
の細胞を５０ｍｌの遠心管に移し、混合し、1000ｒｐｍ
で５分間遠心分離し、上清を吸引除去した。得られた細
胞ペレットに、37℃の44％ＰＥＧ（平均分子量4000）及
び５％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌをゆ
っくり添加した。さらに室温で１分間ゆるやかに振盪し
て反応させた。次いで、計３０ｍｌの血清不含ＩＭＤＭ
培地をゆっくり加えた後、1000ｒｐｍで５分間遠心分離
し、得られた細胞ペレットを20％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培
地〔０．２μM のウアバインを含むＨＡＴ培地（１００
μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６
μＭチミジン添加）を添加〕に懸濁し、０．５〜１．０
×１０6 個／ｍｌの細胞懸濁液とし、９６ウェルプレー
トに０．５〜１．０×１０5 個／ウェルずつ播きこみ、
５％炭酸ガス存在下、３７℃でＮａｐｃｏインキュベー
ターで培養した。１週間後に０．２μＭのウアバインを
含むＨＡＴ培地を１００μｌ添加した。以後、増殖の様
子を見ながら、４日〜１週間毎に同培地で半量ずつ培地
交換した。
【００３８】（融合効率）細胞融合後、増殖してきたウ
ェルの数と、それより算出した融合効率を表３及び表４
に示した。表３及び表４に見られるように、ＮＰ１０１
はＨＰＬＯ以上の融合効率を示し、２．４×１０-5と優
れた値が得られた。一方、ＮＰ１９７はその１／３程度
であったが、いずれの場合も従来レベルの数十倍の融合
効率が得られた。
ェルの数と、それより算出した融合効率を表３及び表４
に示した。表３及び表４に見られるように、ＮＰ１０１
はＨＰＬＯ以上の融合効率を示し、２．４×１０-5と優
れた値が得られた。一方、ＮＰ１９７はその１／３程度
であったが、いずれの場合も従来レベルの数十倍の融合
効率が得られた。
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】（抗体価・比活性測定）得られたハイブリ
ドーマを10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養
し、培養上清中の抗体量、抗体価を調べるための測定検
体とした。
ドーマを10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養
し、培養上清中の抗体量、抗体価を調べるための測定検
体とした。
【００４２】抗ＨＢｓ抗体価の測定は、ヘブスゲンセル
を用いて行った。培養上清（キットに添付のバッファー
で連続２倍希釈）25μｌに、キットに添付のＨＢｓ抗原
固定ヒツジ赤血球液２５μｌを添加して室温で２時間静
置後、凝集像を観察する。凝集の観察される検体の標準
最大希釈率を抗ＨＢｓ抗体価とした。また、抗ＳＲＢＣ
抗体価の測定は、生の羊赤血球に対する溶血反応により
測定した。まず、培養上清（ＧＶＢ+ で連続 2倍希釈）
25μｌに0.5 ％ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ／ＧＶＢ+ ）25
μｌを添加して37℃で30分間静置後、モルモット補体
（極東製薬社製No5008をＧＶＢ+ で40倍希釈)25 μｌを
添加し、さらに37℃で30分間静置した。次に、マイクロ
ミキサーにて30秒間振盪し、37℃で30分間静置後、さら
に室温で一晩静置し、溶血像を観察した。溶血像の観察
される検体の最大希釈率を抗ＳＲＢＣ抗体価とした。
を用いて行った。培養上清（キットに添付のバッファー
で連続２倍希釈）25μｌに、キットに添付のＨＢｓ抗原
固定ヒツジ赤血球液２５μｌを添加して室温で２時間静
置後、凝集像を観察する。凝集の観察される検体の標準
最大希釈率を抗ＨＢｓ抗体価とした。また、抗ＳＲＢＣ
抗体価の測定は、生の羊赤血球に対する溶血反応により
測定した。まず、培養上清（ＧＶＢ+ で連続 2倍希釈）
25μｌに0.5 ％ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ／ＧＶＢ+ ）25
μｌを添加して37℃で30分間静置後、モルモット補体
（極東製薬社製No5008をＧＶＢ+ で40倍希釈)25 μｌを
添加し、さらに37℃で30分間静置した。次に、マイクロ
ミキサーにて30秒間振盪し、37℃で30分間静置後、さら
に室温で一晩静置し、溶血像を観察した。溶血像の観察
される検体の最大希釈率を抗ＳＲＢＣ抗体価とした。
【００４３】培養上清中の抗体量の測定は、サンドイッ
チＥＬＩＳＡ法により行った。ＥＩＡ用９６ウェルマイ
クロプレート（コースタ社製）を用い、固相に抗ヒト免
疫グロブリン〔（抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社製４
１００）または、抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４
１０２）〕の１００倍希釈液を50μｌ／ｗｅｌｌ入れ、
４℃にて一晩反応させた。スキムミルクでブロックした
後、測定検体を50μｌずつ入れて37℃で１時間反応さ
せ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳにて洗浄
後、１万倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（γ）（Ｔａｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）
を50μｌ入れて、さらに37℃で１時間反応させた。０．
０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄後、基質液を加え室温に
て10分発色させ、４Ｎ硫酸で反応を停止させた。ヒトＩ
ｇＧ、ＩｇＭの標準曲線はヘキスト社の標準ヒト血清を
用いて作製した。
チＥＬＩＳＡ法により行った。ＥＩＡ用９６ウェルマイ
クロプレート（コースタ社製）を用い、固相に抗ヒト免
疫グロブリン〔（抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社製４
１００）または、抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４
１０２）〕の１００倍希釈液を50μｌ／ｗｅｌｌ入れ、
４℃にて一晩反応させた。スキムミルクでブロックした
後、測定検体を50μｌずつ入れて37℃で１時間反応さ
せ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳにて洗浄
後、１万倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
（γ）（Ｔａｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）
を50μｌ入れて、さらに37℃で１時間反応させた。０．
０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄後、基質液を加え室温に
て10分発色させ、４Ｎ硫酸で反応を停止させた。ヒトＩ
ｇＧ、ＩｇＭの標準曲線はヘキスト社の標準ヒト血清を
用いて作製した。
【００４４】上記で測定したハイブリドーマの培養上清
中の抗体価とその比活性を表５、表６及び表７に示し
た。各親株とＣ５とのハイブリドーマでは、ＮＰ１０１
を親株とした場合にはＨＰＬＯを親株とした場合よりも
高い比活性の抗体を分泌するハイブリドーマが多く生じ
る傾向にあった。また、各親株とＴＡＰＣとのハイブリ
ドーマでは、ＮＰ１０１、ＮＰ１９７を親株とした場
合、ＨＰＬＯを親株とした場合より高い比活性の抗体を
分泌した。
中の抗体価とその比活性を表５、表６及び表７に示し
た。各親株とＣ５とのハイブリドーマでは、ＮＰ１０１
を親株とした場合にはＨＰＬＯを親株とした場合よりも
高い比活性の抗体を分泌するハイブリドーマが多く生じ
る傾向にあった。また、各親株とＴＡＰＣとのハイブリ
ドーマでは、ＮＰ１０１、ＮＰ１９７を親株とした場
合、ＨＰＬＯを親株とした場合より高い比活性の抗体を
分泌した。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
【表７】
【００４８】実施例３ ヒト−ヒトハイブリドーマの作
製−１ 実施例１で得た本発明親株であるＩｇＧ非生産株（ＮＰ
１０１）の融合相手として、ＣＭＶに対する抗体（Ｉｇ
Ｇ）を産生するリンパ芽球様形質転換細胞Ｋ６３３を用
いた。ＮＰ−１０１と抗ＣＭＶ産生細胞とを１×１０7
ずつ１：１の割合で細胞融合を行った。まず、これらの
細胞を５０ｍｌの遠心管に移し、混合し、1000ｒｐｍで
５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットをほぐした
後、これを37℃の44％ＰＥＧ（平均分子量4000)１ｍｌ
を１分間かけて添加した。さらに37℃で１分間ゆるやか
に振盪して反応させた。次いで、1000ｒｐｍで５分間遠
心分離し、得られた細胞ペレットをＨＴ培地に懸濁し、
96ウェルプレートに１×104 個／100 μｌ／ウェルずつ
播きこみ、培養した。２日後に２×10-7M のウアバイン
を含むＨＡＴ培地（100 μＭヒポキサンチン、0.4 μＭ
アミノプテリン、16μＭチミジン添加）を100 μｌ添加
した。以後、増殖の様子を見ながら、３日〜１週間毎に
半量ずつ同培地で培地交換し、ハイブリドーマを得た。
親株としてＮＰ−１０１の代わりにマウスミエローマ×
６３−Ａｇ８−６．５．３（以下、単に６５３）、ヒト
親株ＨＰＬＯを用いて上記同様の操作で融合を行った。
製−１ 実施例１で得た本発明親株であるＩｇＧ非生産株（ＮＰ
１０１）の融合相手として、ＣＭＶに対する抗体（Ｉｇ
Ｇ）を産生するリンパ芽球様形質転換細胞Ｋ６３３を用
いた。ＮＰ−１０１と抗ＣＭＶ産生細胞とを１×１０7
ずつ１：１の割合で細胞融合を行った。まず、これらの
細胞を５０ｍｌの遠心管に移し、混合し、1000ｒｐｍで
５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットをほぐした
後、これを37℃の44％ＰＥＧ（平均分子量4000)１ｍｌ
を１分間かけて添加した。さらに37℃で１分間ゆるやか
に振盪して反応させた。次いで、1000ｒｐｍで５分間遠
心分離し、得られた細胞ペレットをＨＴ培地に懸濁し、
96ウェルプレートに１×104 個／100 μｌ／ウェルずつ
播きこみ、培養した。２日後に２×10-7M のウアバイン
を含むＨＡＴ培地（100 μＭヒポキサンチン、0.4 μＭ
アミノプテリン、16μＭチミジン添加）を100 μｌ添加
した。以後、増殖の様子を見ながら、３日〜１週間毎に
半量ずつ同培地で培地交換し、ハイブリドーマを得た。
親株としてＮＰ−１０１の代わりにマウスミエローマ×
６３−Ａｇ８−６．５．３（以下、単に６５３）、ヒト
親株ＨＰＬＯを用いて上記同様の操作で融合を行った。
【００４９】（融合効率）細胞融合後、増殖してきたウ
ェルの数と、抗ＣＭＶ産生ウェルの数を表８に示した。
増殖細胞の出現比率は、ＮＰ１０１が最も優れており、
次にＨＰＬＯ、６５３の順であった。また融合効率も、
ＮＰ１０１が最も優れており、５〜７×１０-5の値が得
られた。
ェルの数と、抗ＣＭＶ産生ウェルの数を表８に示した。
増殖細胞の出現比率は、ＮＰ１０１が最も優れており、
次にＨＰＬＯ、６５３の順であった。また融合効率も、
ＮＰ１０１が最も優れており、５〜７×１０-5の値が得
られた。
【００５０】
【表８】
【００５１】（抗ＣＭＶ抗体価・比活性測定）得られた
ハイブリドーマを10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地で培養し、培養上清中の抗体量、抗体価を調べるため
の測定検体とした。
ハイブリドーマを10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地で培養し、培養上清中の抗体量、抗体価を調べるため
の測定検体とした。
【００５２】エンザイグノストＣＭＶプレート（ヘキス
ト社製）を用いて培養上清中の抗ＣＭＶ抗体価を測定し
た。プレートの各ウェルに検体を100 μｌ加え、室温で
２時間反応させた後、洗浄し、4000倍希釈したペルオキ
シダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＭを50μｌ加
えた。室温で１時間反応させた後に基質液を加え室温で
20分間発色させて４Ｎ硫酸で反応を停止させた。抗ＣＭ
Ｖ高力価血清（中和抗体価1:50000)の５万倍希釈液の49
2 ｎｍにおける吸光度を示す検体の希釈倍数を、その検
体の抗ＣＭＶ力価した。
ト社製）を用いて培養上清中の抗ＣＭＶ抗体価を測定し
た。プレートの各ウェルに検体を100 μｌ加え、室温で
２時間反応させた後、洗浄し、4000倍希釈したペルオキ
シダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＭを50μｌ加
えた。室温で１時間反応させた後に基質液を加え室温で
20分間発色させて４Ｎ硫酸で反応を停止させた。抗ＣＭ
Ｖ高力価血清（中和抗体価1:50000)の５万倍希釈液の49
2 ｎｍにおける吸光度を示す検体の希釈倍数を、その検
体の抗ＣＭＶ力価した。
【００５３】培養上清中の抗体量の測定はＥＬＩＳＡ法
により常法に従って行った。ＥＩＡ用９６ウェルマイク
ロプレート（コースタ社製）を用い、固相に抗ヒト免疫
グロブリン〔（抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社製４１
００）または、抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４１
０２）〕の１００倍希釈液を50μｌ／ｗｅｌｌ入れ、４
℃にて一晩反応させた。スキムミルクでブロックした
後、測定検体を50μｌずつ入れて37℃で１時間反応さ
せ、0.05％Tween 20を含むＰＢＳにて洗浄後、１万倍希
釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａ
ｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダーゼ標識抗ヒ
トＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）を50μｌ入れ
て、さらに37℃で１時間反応させた。0.05％Tween 20を
含むＰＢＳで洗浄後、基質液を加え室温にて10分発色さ
せ、４Ｎ硫酸で反応を停止させた。ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ
の標準曲線はヘキスト社の標準ヒト血清を用いて作製し
た。
により常法に従って行った。ＥＩＡ用９６ウェルマイク
ロプレート（コースタ社製）を用い、固相に抗ヒト免疫
グロブリン〔（抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社製４１
００）または、抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４１
０２）〕の１００倍希釈液を50μｌ／ｗｅｌｌ入れ、４
℃にて一晩反応させた。スキムミルクでブロックした
後、測定検体を50μｌずつ入れて37℃で１時間反応さ
せ、0.05％Tween 20を含むＰＢＳにて洗浄後、１万倍希
釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａ
ｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダーゼ標識抗ヒ
トＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）を50μｌ入れ
て、さらに37℃で１時間反応させた。0.05％Tween 20を
含むＰＢＳで洗浄後、基質液を加え室温にて10分発色さ
せ、４Ｎ硫酸で反応を停止させた。ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ
の標準曲線はヘキスト社の標準ヒト血清を用いて作製し
た。
【００５４】上記で測定したハイブリドーマの培養上清
中の抗体価とその比活性を表９に示した。Ｋ６３３と各
親株とのハイブリドーマにおいて、６５３、ＮＰ−１０
１とのハイブリドーマは抗体価、比活性にもとの株（Ｋ
６３３）との差は見られないが、ＨＰＬＯとのハイブリ
ドーマは、抗体価が１／２から１／３に低下していた。
中の抗体価とその比活性を表９に示した。Ｋ６３３と各
親株とのハイブリドーマにおいて、６５３、ＮＰ−１０
１とのハイブリドーマは抗体価、比活性にもとの株（Ｋ
６３３）との差は見られないが、ＨＰＬＯとのハイブリ
ドーマは、抗体価が１／２から１／３に低下していた。
【００５５】
【表９】
【００５６】（ハイブリドーマの安定性）抗体活性の認
められたウェルの細胞を拡大培養し、その抗体産生能の
安定性を調べた。ランダムに選んだ抗体陽性ウェルの細
胞を96ウェルプレートから24ウェルプレート、あるいは
12ウェルプレートまで拡大した後の、抗体活性の有無で
安定性を評価した。表１０にその結果を示した。抗体産
生能の安定性でもＮＰ−１０１が最も優れており、以下
ＨＰＬＯ、６５３の順であった。
められたウェルの細胞を拡大培養し、その抗体産生能の
安定性を調べた。ランダムに選んだ抗体陽性ウェルの細
胞を96ウェルプレートから24ウェルプレート、あるいは
12ウェルプレートまで拡大した後の、抗体活性の有無で
安定性を評価した。表１０にその結果を示した。抗体産
生能の安定性でもＮＰ−１０１が最も優れており、以下
ＨＰＬＯ、６５３の順であった。
【００５７】
【表１０】
【００５８】実施例４ ヒト−ヒトハイブリドーマの作
製−２ 実施例１で得た本発明親株であるＩｇＧ非生産株（ＮＰ
１０１及びＮＰ１９７）の融合相手として、癌患者リン
パ球（ＴＫ：63才, 男性, 胃癌、ＹＦ：48才,男性, 胃
癌) を用いた。かかるヒトリンパ球は、癌患者脾臓をほ
ぐして脾臓細胞を得、凍結保存しておいたものを用い
た。凍結から溶解したリンパ球を107/mlに10％ＦＣＳ含
有ＩＭＤＭ培地に懸濁し、pokeweed mitogen (GIBCO)を
0.025% (W/V)、Stapyhlococcus aureus (Zymed) を0.01
% (W/V) 添加し、６ウェルプレートに３ｍｌずつ分注し
た。ＣＯ2 インキュベーター中で４日間培養し、新鮮培
地（10％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培地）３ｍｌを追加し、さ
らに２日培養後、細胞を回収して融合に供した。
製−２ 実施例１で得た本発明親株であるＩｇＧ非生産株（ＮＰ
１０１及びＮＰ１９７）の融合相手として、癌患者リン
パ球（ＴＫ：63才, 男性, 胃癌、ＹＦ：48才,男性, 胃
癌) を用いた。かかるヒトリンパ球は、癌患者脾臓をほ
ぐして脾臓細胞を得、凍結保存しておいたものを用い
た。凍結から溶解したリンパ球を107/mlに10％ＦＣＳ含
有ＩＭＤＭ培地に懸濁し、pokeweed mitogen (GIBCO)を
0.025% (W/V)、Stapyhlococcus aureus (Zymed) を0.01
% (W/V) 添加し、６ウェルプレートに３ｍｌずつ分注し
た。ＣＯ2 インキュベーター中で４日間培養し、新鮮培
地（10％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培地）３ｍｌを追加し、さ
らに２日培養後、細胞を回収して融合に供した。
【００５９】活性化したリンパ球と、ＮＰ１０１あるい
は及びＮＰ１９７とを２：１の割合で細胞融合を行っ
た。まず、これらの細胞を50ｍｌの遠心管に移し、混合
し、1500ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞ペ
レットをほぐした後、これを３７℃の50％ＰＥＧ（平均
分子量１５００）１ｍｌを１分間かけて添加した。さら
に３７℃で２分間ゆるやかに振盪して反応させた。次い
で、計30mlの血清不含培地をゆっくり加えた後、1500ｒ
ｐｍで５分間遠心分離し、得られた細胞ペレットをＨＡ
Ｔ（100 μＭヒポキサンチン、0.4 μＭアミノプテリ
ン、16μＭチミジン添加）を培地に懸濁し、９６ウェル
プレートに５×104 個／100μｌ／ウェルずつ播きこ
み、培養した。３日後に上記ＨＡＴ培地を100 μｌ添加
した。以後、増殖の様子を見ながら、２回／週の頻度で
半量ずつ同培地で培地交換を行った。
は及びＮＰ１９７とを２：１の割合で細胞融合を行っ
た。まず、これらの細胞を50ｍｌの遠心管に移し、混合
し、1500ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞ペ
レットをほぐした後、これを３７℃の50％ＰＥＧ（平均
分子量１５００）１ｍｌを１分間かけて添加した。さら
に３７℃で２分間ゆるやかに振盪して反応させた。次い
で、計30mlの血清不含培地をゆっくり加えた後、1500ｒ
ｐｍで５分間遠心分離し、得られた細胞ペレットをＨＡ
Ｔ（100 μＭヒポキサンチン、0.4 μＭアミノプテリ
ン、16μＭチミジン添加）を培地に懸濁し、９６ウェル
プレートに５×104 個／100μｌ／ウェルずつ播きこ
み、培養した。３日後に上記ＨＡＴ培地を100 μｌ添加
した。以後、増殖の様子を見ながら、２回／週の頻度で
半量ずつ同培地で培地交換を行った。
【００６０】（融合効率）細胞融合後、増殖してきたウ
ェルの数を表１１に示した。融合効率は、ＮＰ１０１で
は、０．５〜１×１０-5と優れた値が得られた。一方、
ＮＰ１９７では０．１×１０-5程度であり、ＮＰ１０１
には劣るものの、従来レベルの数十倍の融合効率が得ら
れた。
ェルの数を表１１に示した。融合効率は、ＮＰ１０１で
は、０．５〜１×１０-5と優れた値が得られた。一方、
ＮＰ１９７では０．１×１０-5程度であり、ＮＰ１０１
には劣るものの、従来レベルの数十倍の融合効率が得ら
れた。
【００６１】
【表１１】
【００６２】
【発明の効果】本発明の新規親細胞株は、ヒト抗体産生
細胞とのヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親株として利
用でき、ヒト抗体産生細胞との細胞融合により、各種疾
患の診断、予防、治療に用い得るヒトモノクローナル抗
体の作製が達成される。本発明の親細胞株は、それ自体
免疫グロブリンを産生しないので、それとヒト抗体産生
細胞との細胞融合により作製されたヒト−ヒトハイブリ
ドーマは、目的とする抗体に親細胞由来の免疫グロブリ
ンが組み換わった抗体を産生する可能性がなく、抗体が
安定に産生され、かつ目的とする抗体の精製が容易とな
る。また、本発明の親細胞株はヒトリンパ球またはヒト
リンパ芽球と融合した場合、高い融合効率を示し、その
融合によって得られたハイブリドーマに高い抗体産生能
を与え、当該ハイブリドーマで産生される抗体の活性を
低下させない。従って作製したヒト−ヒトハイブリドー
マを大量に培養してヒトモノクローナル抗体を製造する
場合に培養期間の短縮化と製造コストの低減をもたらす
ことができる。
細胞とのヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親株として利
用でき、ヒト抗体産生細胞との細胞融合により、各種疾
患の診断、予防、治療に用い得るヒトモノクローナル抗
体の作製が達成される。本発明の親細胞株は、それ自体
免疫グロブリンを産生しないので、それとヒト抗体産生
細胞との細胞融合により作製されたヒト−ヒトハイブリ
ドーマは、目的とする抗体に親細胞由来の免疫グロブリ
ンが組み換わった抗体を産生する可能性がなく、抗体が
安定に産生され、かつ目的とする抗体の精製が容易とな
る。また、本発明の親細胞株はヒトリンパ球またはヒト
リンパ芽球と融合した場合、高い融合効率を示し、その
融合によって得られたハイブリドーマに高い抗体産生能
を与え、当該ハイブリドーマで産生される抗体の活性を
低下させない。従って作製したヒト−ヒトハイブリドー
マを大量に培養してヒトモノクローナル抗体を製造する
場合に培養期間の短縮化と製造コストの低減をもたらす
ことができる。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ
8828−4Ｂ Ｃ
(72)発明者 平間 稔
大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１
株式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒトリンパ芽球細胞株（ＩＭ−９）のヒ
ポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損突然変異株かつウアバイン耐性突然変異株。 - 【請求項２】 ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞
株として有用な請求項１記載の細胞株。 - 【請求項３】 免疫グロブリンを産生しないことを特徴
とする請求項１記載の細胞株。 - 【請求項４】 抗体産生細胞としてヒトリンパ球または
ヒトリンパ芽球を用いた場合に高い融合効率を与える請
求項１記載の細胞株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3183187A JPH053784A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3183187A JPH053784A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH053784A true JPH053784A (ja) | 1993-01-14 |
Family
ID=16131294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3183187A Pending JPH053784A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH053784A (ja) |
-
1991
- 1991-06-26 JP JP3183187A patent/JPH053784A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2640463B2 (ja) | ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 | |
| EP0182467B1 (en) | Human hybridoma fusion partner for production of human monoclonal antibodies | |
| CA1315715C (en) | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom | |
| US4634664A (en) | Process for the production of human mono-clonal antibodies | |
| JPH05276983A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JP2002507398A (ja) | ヒト・モノクローナル抗体およびそのための使用の開発 | |
| US8173425B2 (en) | Fusion partner cells | |
| Schwaber et al. | Human-human hybrids secreting pneumococcal antibodies | |
| US4647535A (en) | Human nonsecretory plasmacytoid cell line | |
| JP2004502454A (ja) | ヒト骨髄腫細胞系 | |
| JPH053784A (ja) | ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株 | |
| AU2001269300A1 (en) | Human myeloma cell line | |
| CN109748963A (zh) | 一种抗lag-3的单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| US4833077A (en) | Method for producing human antibody | |
| JP2764101B2 (ja) | ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株 | |
| JP3043023B2 (ja) | ハイブリドーマ | |
| Kudo et al. | Highly efficient procedure for production of human monoclonal antibodies: establishment of hybrids between Epstein-Barr virus-transformed B lymphocytes and heteromyeloma cells by use of GIT culture medium | |
| JPH02113896A (ja) | ヒト抗リシンモノクローナル抗体およびそれを分泌するハイブリドーマ | |
| JP2838127B2 (ja) | 抗体産生細胞の製法及び抗体の製法 | |
| JP4185880B2 (ja) | 花粉アレルゲンに対するヒトモノクローナル抗体 | |
| JPH04281798A (ja) | ヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体及びそれを産生するハイブリドーマ | |
| JPH0679553B2 (ja) | 新規な雑種細胞 | |
| JPS63185374A (ja) | ヒト−ヒトハイブリド−マ作製用親細胞株 | |
| JPH02245186A (ja) | Ｇ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体、その産生細胞、製造法及び製剤 | |
| JPS61242574A (ja) | ウアバイン耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞 |