JPH05310603A - 固定化抗体カラムによる分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 二重結合に隣接するメチル基を有し、該メチ
ル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物の体内動態解
明に係る多成分含有試料の一斉分析法における試料の前
処理法において、該化合物のメチル基を蛋白で修飾して
抗原を得、次いで、該抗原を用いて得られる抗体で固定
化抗体カラムを作成し、該カラムで、二重結合に隣接す
るメチル基を有し、該メチル基が生体内で酸化的代謝を
受ける化合物、その代謝物および／または内部標準物質
を含む試料から、該化合物、その代謝物および／または
内部標準物質を選択的に、かつ定量的に、同時に分離す
る方法。 【効果】 上記前処理によって得られる試料を、ＨＰＬ
ＣあるいはＧＣ／ＭＳに付すことにより上記の各測定対
象物が一斉に分析できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は薬物の体内動態解明に係
る多成分含有試料の一斉分析法における試料の前処理法
に関する。さらに詳しくは、二重結合に隣接するメチル
基を有し、該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化
合物の体内動態解明に係る上記前処理法において、該化
合物のメチル基を蛋白で修飾して抗原を得、次いで、該
抗原を用いて得られる抗体で固定化抗体カラムを作成
し、該カラムで、二重結合に隣接するメチル基を有し、
該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物、その
代謝物および／または内部標準物質を含む試料から、該
メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物、その代
謝物および／または内部標準物質の混合物を選択的に、
かつ定量的に、同時に分離する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】医薬品を投与して、吸収、分布、代謝、
排泄について十分な検討を加えることは、その医薬品の
効果および持続時間ならびに作用機序等の予測に必要で
あるばかりでなく、生体内分布、貯留時間、濃度等を知
ることによりその医薬品の副作用発現の推定に係る情報
が得られる等極めて重要である。

【０００３】投与された被験物質が吸収され、体内に分
布して作用部位に到達し、また代謝され、未変化体また
は代謝物として体外へ排泄される全過程、すなわち薬物
の体内動態を明らかにするためには、感度、特異性に優
れる多成分含有試料の一斉分析法の確立が重要である。

【０００４】多成分含有試料の一斉分析には、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいはガスクロマト
グラフィー−質量分析（ＧＣ／ＭＳ）等が汎用されてい
るが、複雑なマトリックスである生体試料中の微量成分
の測定には、測定を妨害する物質を除き、測定対象物を
簡便かつ選択的に、同時に分離する前処理操作が必要で
ある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、薬物の
なかで、特に二重結合に隣接するメチル基を有し、該メ
チル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物の体内動態
解明において、上記目的に適う優れた前処理法を見い出
すべく種々検討を加えた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、薬物のな
かで、二重結合に隣接するメチル基を有する化合物は、
該メチル基が生体内で酸化的代謝を受け易いことに着目
し、該化合物のメチル基を蛋白で修飾して抗原を得、次
いで、該抗原を用いて該メチル基を有する化合物、その
代謝物および／または内部標準物質に対して特異性に優
れる抗体（代謝物をも対象に含めた巾広い親和性スペク
トルを有する抗体）を調製し、該抗体で固定化抗体カラ
ムを作成し、該カラムで、二重結合に隣接するメチル基
を有し、該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合
物、その代謝物および／または内部標準物質を含む生体
試料から、該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化
合物、その代謝物および／または内部標準物質の混合物
を選択的に、かつ定量的に、同時に分離することができ
ることを見い出し、該前処理法によって得られた試料を
用いて、ＨＰＬＣあるいはＧＣ／ＭＳに付すと二重結合
に隣接するメチル基を有し、該メチル基が生体内で酸化
的代謝を受ける化合物、その代謝物および／または内部
標準物質が一斉に分析できることを確かめて本発明を完
成させた。

【０００７】本発明は以下のようにして実施することが
できる。

【０００８】本発明の二重結合に隣接するメチル基を有
し、該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物と
は、トルメチン、メフェナム酸、ブクモロール、ブプラ
ノロール、アンチピリン、テトラヒドロカンナビノール
または４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベ
ンゾチアゾール等のように薬物の化学構造中に二重結合
（芳香環中の二重結合も含む）に隣接するメチル基を有
し、該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物で
ある。

【０００９】本発明の上記化合物のメチル基を蛋白で修
飾するとは、該メチル基をカルボキシル基に変換し、蛋
白のアミノ基とアミド結合を形成させるか、あるいは、
メチル基をヒドロキシル基、カルボニル基に変換して、
これらにカルボキシル基またはマレイミド基を有する架
橋剤を反応させた後に、架橋剤のカルボキシル基または
マレイミド基と蛋白のアミノ基またはチオール基を化学
結合させることを意味する。

【００１０】上記におけるメチル基のヒドロキシル基、
カルボニル基またはカルボキシル基への変換は常法の化
学的酸化反応により実施される［新実験化学講座，15
巻，酸化と還元（Ｉ−１），４〜６頁，1976，丸善株式
会社発行参照］。

【００１１】上記の蛋白には、種々の動物の血清アルブ
ミン、カサガイヘモシアニン、チログロブリン、オボア
ルブミン、フィブリノーゲンが、好ましくはウシ血清ア
ルブミンが使用される。

【００１２】上記におけるアミド結合の形成は、ペプチ
ド結合の形成に用いられる通常の手段、例えば、カルボ
ジイミド法、活性エステル法または混合酸無水物法で行
われる（石川栄治監訳，生化学実験法11 エンザイムイ
ムノアッセイ， 257頁，1989，株式会社東京化学同人発
行参照）。また、蛋白とマレイミド基との反応は、マレ
イミド基の二重結合への該蛋白のチオール基のマイケル
付加反応が利用される（北川常廣、南原利夫、辻章夫、
石川栄治編，蛋白核酸酵素 別冊No.31 ，酵素免疫測定
法，32頁，1987，参照）。上記架橋剤には、ヒドロキシ
ル基に適用するものとして、無水コハク酸のような酸無
水物、マレイミドアシルハライドのようなマレイミド基
を有するアシル化剤が、カルボニル基に適用されるもの
として、Ｏ−（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミ
ン、カルボキシメチルヒドラジンのようにカルボニル基
にオキシムの形でカルボキシル基を導入できるものが使
用される。

【００１３】上記架橋剤とヒドロキシル基またはカルボ
ニル基とを反応させる方法は常法により行われる（石川
栄治監訳，生化学実験法11 エンザイムイムノアッセ
イ， 256〜262 頁，1989，株式会社東京化学同人発行参
照）。

【００１４】例えば、上記において架橋導入のためにオ
キシム化反応を用いた場合、シン、アンチ異性体の存在
により抗体の認識は、該メチル基近傍に対しても弱くな
り、該メチル基の位置異性体に対しても親和性を示すこ
とが可能となる。従って、特に、ＧＣ／ＭＳの場合、重
水素標識体の水素置換の影響を回避するうえで、該メチ
ル基の位置異性体を内部標準物質として用いることがで
きる利点がある。

【００１５】本発明の抗体は、上記のようにして得られ
る抗原を用いて、常法によりウサギ等に免疫注射して抗
血清を得（続生化学実験講座，５巻，免疫化学研究法，
１〜10頁，1986，株式会社東京化学同人発行参照）、リ
バノール沈殿分画法、硫酸アンモニウム沈殿分画法、ポ
リエチレングリコールによる分画法、エタノール沈殿分
画法を用いてＩｇＧ画分を分画して調製される（続生化
学実験講座，５巻，免疫化学研究法，11〜17頁，1986，
株式会社東京化学同人発行参照）。次いで、酵素イムノ
アッセイ（ＥＩＡ）により、上記抗体の親和性スペクト
ルを調べる。すなわち、前記と同様にして本発明に係る
化合物のメチル基を例えばβ−ガラクトシダーゼで修飾
して製造できる酵素標識抗原と、本発明に係る化合物の
（測定対象の代謝物を含む）種々の近縁化合物を夫々競
合させ、第二抗体との結合により生ずる免疫沈降物の酵
素活性より調べる（石川栄治、河合忠、宮井潔編，酵素
免疫測定法 第二版，医学書院，1982，参照）。

【００１６】本発明の固定化抗体の調製に用いる担体
は、カラムとして一般に使用されているものであれば、
特に限定されないが、アガロース、ポリアクリルアミド
等が好適に用いられる。

【００１７】担体に抗体を固定化する方法は、共有結合
させる方法が好ましく、アガロースゲルをシアノブロマ
イド等で活性化して抗体と反応させる方法や既に活性化
された市販のアフィニティー用担体を利用することがで
きる。例えば、バイオ−ラド社製のアフィゲル10は、活
性エステル型のアフィニティー用担体であり、４℃の緩
衝液中で抗体と混合するだけで反応させることができ
る。固定化された抗体は、カラムに充填し固定化抗体カ
ラムとして使用できる（生化学実験講座，１巻，タンパ
ク質の化学Ｉ， 140〜159 頁，1976，株式会社東京化学
同人）。本発明の固定化抗体カラムからの測定対象物の
同時分離は、次の工程で行われる。

【００１８】（１）上記固定化抗体カラムに、必要に応
じて内部標準物質を添加した被験試料を通し、固定化さ
れた抗体に被験試料中の目的とする化合物とその代謝物
および／または内部標準物質を保持させる。（２）固定
化抗体カラムに対して非特異的に結合している物質をカ
ラムから洗い流すために、目的とする化合物とその代謝
物および／または内部標準物質と抗体との親和力を弱め
ることないように例えば中性付近のｐＨの緩衝液に適宜
メチルアルコール等の有機溶媒を添加した溶液を流す。
（３）メチルアルコール，エチルアルコール，アセト
ン，アセトニトリル等の極性有機溶媒と水との混合溶媒
を固定化抗体カラムに流し、目的とする化合物とその代
謝物および／または内部標準物質を同時に溶出させる。

【００１９】本発明の内部標準物質としては、測定対象
化合物の近縁化合物であり、かつ固定化抗体カラムに対
して親和性を有する化合物が適宜用いられる。

【００２０】本発明の分離方法によって前処理して得ら
れた試料をＨＰＬＣあるいはＧＣ／ＭＳに付すことによ
り、二重結合に隣接するメチル基を有し、該メチル基が
生体内で酸化的代謝を受ける化合物、その代謝物および
／または内部標準物質を一斉に分析することができる。

【００２１】

【発明の効果】薬物の代謝は、一般に、投与された化合
物に極性の官能基を付与し、体外への排泄が容易になる
構造に変化させるように行われることから、薬物とその
代謝物の極性や疎水性の程度には、大きな差が生じ、溶
媒抽出法や固相抽出法を用いて定量的に薬物とその代謝
物を同時に抽出分離することが困難となる。

【００２２】しかしながら、本発明の固定化抗体カラム
による前処理を行うことにより、薬物、特に、二重結合
に隣接するメチル基を有し、該メチル基が生体内で酸化
的代謝を受ける化合物の場合、該化合物、その代謝物お
よび／または内部標準物質を選択的にかつ定量的に、同
時に分離することができる。

【００２３】従って、二重結合に隣接するメチル基を有
し、該メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物の
場合、本発明による前処理法によって得られた試料をＨ
ＰＬＣあるいはＧＣ／ＭＳに付すことにより、二重結合
に隣接するメチル基を有し、該メチル基が生体内で酸化
的代謝を受ける化合物、その代謝物および／または内部
標準物質を一斉に分析できる。

【００２４】

【実施例】以下に、実施例および参考例を挙げて本発明
を更に詳細に説明するが、本発明はこの実施例および参
考例によって限定されるものではない。

【００２５】実施例１ ４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチ
アゾール代謝物の同時分離分析 ４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチ
アゾールは、生体中での第一相代謝反応として２−（４
−メチルフェニル）のフェニル基上のメチル基の酸化と
４位アセチル基の加水分解を受けるとされている。そこ
で、以下の通り、（１）フェニル基上のメチル基を蛋白
で修飾して抗原を調製し、（２）該抗原を用いて抗体を
得、（３）次いでこの抗体で固定化抗体カラムを調製
し、（４）該カラムで４−アセトキシ−２−（４−メチ
ルフェニル）ベンゾチアゾールの各種代謝物を含む血清
から、４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベ
ンゾチアゾールの各種代謝物の混合物を同時に分離し定
量した。

【００２６】（１）抗原の調製 １−１）４−アセトキシ−２−（４−ジアセトキシメチ
ルフェニル）ベンゾチアゾールの調製 ４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチ
アゾール ３．３６ｇを酢酸４２ｍｌ、無水酢酸４２ｍ
ｌ、濃硫酸３．１６ｍｌの混合液に溶解し、−５℃以下
で三酸化クロム８．４ｇを添加した。−８℃以下で３時
間撹拌した後、この反応液を氷冷水８００ｍｌ中へ投入
した。生成した沈殿を濾取、水洗いし、酢酸エチルに溶
解した。酢酸エチル溶液を５％炭酸水素ナトリウム水溶
液と水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を留
去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロ
ホルム−酢酸エチル；２０：１）で精製後ジクロロメタ
ン−メタノール混液で再結晶し、無色針状晶の４−アセ
トキシ−２−（４−ジアセトキシメチルフェニル）ベン
ゾチアゾール １．２８ｇを得た（融点：１３５−１３
７℃）。

【００２７】１−２）４−（４−ヒドロキシベンゾチア
ゾ−ル−２−イル）ベンズアルデヒドの調製 ４−アセトキシ−２−（４−ジアセトキシメチルフェニ
ル）ベンゾチアゾール２．６６ｇを４５％メタノール水
溶液１２１ｍｌ中に懸濁し、２〜３分間窒素ガスを通導
させた。ついで、濃塩酸５．４ｍｌを添加し、３０分間
還流した。室温まで冷やした後水を加え、析出した結晶
を濾取した。この結晶を水洗し、酢酸エチルで再結晶し
て淡黄色針状晶の４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ−
ル−２−イル）ベンズアルデヒド１．６６ｇを得た（融
点 １８５−１８７℃）。

【００２８】１−３）４−（４−ヒドロキシベンゾチア
ゾ−ル−２−イル）ベンズアルデヒドＯ−（カルボキシ
メチル）オキシムの調製 ４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ−ル−２−イル）ベ
ンズアルデヒド７９７ｍｇ、Ｏ−（カルボキシメチル）
ヒドロキシアミン８２２ｍｇ、および無水酢酸ナトリウ
ム９２５ｍｇを３４ｍｌのエタノール中に加えて混合
し、室温で９０分間撹拌した。５％水酸化ナトリウム水
溶液で反応液のｐＨを１０以上にし、エーテルで数回洗
浄した。ついで、濃塩酸でｐＨを２以下にし、酢酸エチ
ルで抽出後水洗した。この抽出液を無水硫酸ナトリウム
で乾燥し、溶媒を留去した。残渣をジオキサン水溶液で
再結晶し、無色針状晶の４−（４−ヒドロキシベンゾチ
アゾ−ル−２−イル）ベンズアルデヒド Ｏ−（カルボ
キシメチル）オキシム７４０ｍｇを得た（融点：２１４
−２１６℃）。

【００２９】１−４）４−（４−ヒドロキシベンゾチア
ゾ−ル−２−イル）ベンズアルデヒドＯ−（カルボキシ
メチル）オキシム ｐ−ニトロフェニルエステルの調製 ４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ−ル−２−イル）ベ
ンズアルデヒド Ｏ−（カルボキシメチル）オキシム２
００ｍｇを９０％ジオキサン水溶液に溶解し、ｐ−ニト
ロフェノール８５ｍｇおよび１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩１４０ｍ
ｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応液に５％炭酸水
素ナトリウムを加え、酢酸エチルで抽出し、５％炭酸水
素ナトリウムと水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（クロロホルム−酢酸エチル；５：１）で精製
後、アセトン−ｎ−ヘキサン混液で再結晶し、無色針状
晶の４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ−ル−２−イ
ル）ベンズアルデヒド Ｏ−（カルボキシメチル）オキ
シム ｐ−ニトロフェニルエステル２８ｍｇを得た〔融
点：１４６−１５９℃（分解）〕。

【００３０】１−５）抗原の調製 ４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ−ル−２−イル）ベ
ンズアルデヒド Ｏ−（カルボキシメチル）オキシム
ｐ−ニトロフェニルエステル３８ｍｇをピリジン１ｍｌ
に溶解し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ｍｇを
含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を添加し、
４℃で３日間撹拌した。反応液にアセトンを加え、生成
した沈殿を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、さ
らに、アセトンで数回洗浄した。得られた沈殿を５０％
ピリジン水溶液中に溶解し、１リットルの水に対して８
時間以上の透析を３回行った。ついで、凍結乾燥を行な
い、抗原を得た。４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ−
ル−２−イル）ベンズアルデヒド Ｏ−（カルボキシメ
チル）オキシム（すなわち、ハプテン）とＢＳＡとの結
合モル比を３２３ｎｍにおける吸光度から求めたとこ
ろ、ＢＳＡ１モルに対してハプテン１１モルが結合して
いた。

【００３１】（２）抗体の調製 抗原１ｍｇを生理食塩水０．５ｍｌに溶解し、同量のフ
ロイントの完全アジュバントとよく混和し、雄性家兎
［日本白色，２羽使用（夫々家兎ａ、家兎ｂと呼ぶ）、
体重各１．５Ｋｇ］の背部皮内に少量ずつ数カ所に分け
て投与した。追加免疫は２週間隔で行い、初回免疫の６
か月後に全採血した。得られた血液を数時間放置し、
３，０００ｒｐｍで１０分間遠心して抗体溶液（抗血
清）を得た（家兎ａから得られた抗体を抗体−１、家兎
ｂから得られた抗体を抗体−２と呼ぶ）。各抗体溶液に
０．１％となるようにアジ化ナトリウムを添加し、４℃
で保存した。

【００３２】各抗体の４−アセトキシ−２−（４−メチ
ルフェニル）ベンゾチアゾール、４−ヒドロキシ−２−
（４−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、４−（４−
ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）ベンジルアル
コール、４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−
イル）ベンズアルデヒドおよび４−（４−ヒドロキシベ
ンゾチアゾール−２−イル）ベンゾイック アシッドに
対する交差反応性を測定した。結果を表１に示す。

【００３３】

【表１】 なお、交差反応性は以下の（ａ）〜（ｂ）により測定し
た。 （ａ）酵素標識抗原の調製 ４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）ベ
ンズアルデヒド Ｏ−（カルボキシメチル）オキシム
ｐ−ニトロフェニルエステル３３．３μｇをジオキサン
０．１ｍｌに溶解し、β−ガラクトシダーゼ５００μｇ
を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）０．２ｍ
ｌを添加し、混合後、４℃で３日間放置した。ついで、
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．３）１リットルに
対して８時間以上の透析を３回行い、１ｍｌにメスアッ
プの後、ＢＳＡ５ｍｇを添加し酵素標識抗原溶液を得
た。なお、酵素標識抗原溶液は４℃で保存する。 （ｂ）交差反応性の測定 ０．９％塩化ナトリウムと０．１％ゼラチンを含む０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（以下、緩衝液Ａと
呼ぶ）に正常家兎血清を加え、正常家兎血清の０．５％
溶液を調製した。この溶液で上記の酵素標識抗原溶液を
希釈し、酵素標識抗原希釈液（βガラクトシダーゼとし
て０．１μｇ，０．１ｍｌ）を調製した。酵素標識抗原
希釈液、被検化合物、すなわち、４−アセトキシ−２−
（４−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、４−ヒドロ
キシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）ベ
ンジルアルコール、４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾ
ール−２−イル）ベンズアルデヒドまたは４−（４−ヒ
ドロキシベンゾチアゾール−２−イル）ベンゾイック
アシッドの緩衝液Ａ溶液０．１ｍｌおよび１０，０００
倍に希釈した抗体溶液０．１ｍｌとをよく混合した後、
４℃で４時間放置した。

【００３４】０．３％エチレンジアミンテトラアセチッ
クアシッド（ＥＤＴＡ）を含む緩衝液Ａで３０倍希釈し
たヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清０．１ｍｌを添加し、良く
混合した後、４℃で１６時間放置した。これを、０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）１．５ｍｌで希釈し、
３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し沈
降物を、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）１．５
ｍｌで洗浄し、免疫沈降物を得た。

【００３５】次いで、免疫沈降物を、０．１２％のｏ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、０．２
％塩化マグネシウムおよび０．７％メルカプトエタノー
ルを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中に懸
濁させ、３７℃で１時間インキュベートした。１Ｍ炭酸
ナトリウム２ｍｌを加え、混合した後、遊離したｏ−ニ
トロフェノールの４２０ｎｍにおける吸光度を測定する
ことによりβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。

【００３６】被検化合物の交差反応性は、免疫沈降物中
のβ−ガラクトシダーゼ活性を５０％減少させる４−ヒ
ドロキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチアゾー
ルの量（ｘ）と、免疫沈降物中のβ−ガラクトシダーゼ
活性を５０％減少させる各被検化合物の量（ｙ）とか
ら、ｘ÷ｙ×１００（％）として算出した。

【００３７】（３）固定化抗体カラムの調製 抗体−１溶液と抗体−２溶液の約等量混合液３５．８ｍ
ｌと０．４（Ｗ／Ｖ）％リバノール水溶液１２５ｍｌを
混合し、１０分間ゆっくり撹拌した。ついで、４℃，
３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。得られた上清１
５１ｍｌに活性炭３．６ｇを添加し、１０分間撹拌し
た。活性炭を遠心分離後、濾過膜（孔径：０．３５μ
ｍ，ウォーターズ社）を通し、凍結乾燥し、ＩｇＧ画分
を乾燥品として得た。ＩｇＧ画分を０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．３）１５ｍｌに溶解後、アフィゲル−１
０（活性エステル基が導入されたアガロースゲル、バイ
オ−ラド社製）２２ｍｌを添加し、４℃で５２時間ゆる
やかに撹拌した。ついで、ガラスフィルターを用いてゲ
ルを濾取し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）２
０ｍｌに懸濁させ、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）
２．２ｍｌを加えて４℃で２時間撹拌し、アフィゲル−
１０の未反応活性エステル基を不活性化した。再度、ガ
ラスフィルターを用いてゲルを濾取し、０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．３）２００ｍｌで洗浄し、固定化抗
体を得た。この固定化抗体で、ＩｇＧ画分のアガロース
ゲルへの結合率は、８８％である。なお、固定化抗体
は、０．０２％アジ化ナトリウム含有０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．３） 中に懸濁し４℃で保存した。次
いで、固定化抗体をガラスカラム（内径６ｍｍ）にベッ
ドボリウム１ｍｌとして充填し、固定化抗体カラムを調
製した。

【００３８】（４）４−アセトキシ−２−（４−メチル
フェニル）ベンゾチアゾールの代謝物の同時分離と分析 上記で得た固定化抗体カラムを蒸留水（５ｍｌ×２）、
９０％メタノール水溶液（５ｍｌ×２）、蒸留水（５ｍ
ｌ×２）、０．９％塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．３，５ｍｌ×２）で順次洗浄し
た。ついで、４−ヒドロキシ−２−（４−メチルフェニ
ル）ベンゾチアゾール、４−（４−ヒドロキシベンゾチ
アゾール−２−イル）ベンジルアルコール、４−（４−
ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）ベンズアルデ
ヒドおよび４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２
−イル）ベンゾイックアシッド混合物溶液（各化合物濃
度５０ｎｇ／ｍｌ、溶媒：ヒト血清を、０．９％塩化ナ
トリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で４倍
に希釈した溶液）５ｍｌを負荷し、１Ｍ塩化ナトリウム
を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３，５ｍｌ×
２），蒸留水５ｍｌで順次洗浄した。ついで９０％メタ
ノール水溶液５ｍｌでカラムに吸着した化合物を同時に
溶出した。溶出液を窒素気流下乾固し、以下の高速液体
カラムクロマトグラフィーで定量したところ、各化合物
の定量が可能であった。各化合物の濃度を、それぞれ２
５０ｎｇ、５００ｎｇに変えて上記と同様にして試験し
た場合も各化合物が一斉に定量できた。 高速液体クロマトグラフィーの条件 装置：ウオーターズ社製 ６０００Ａポンプ、４４０型
ＵＶ検出器（３１３ｎｍ）、Ｕ６Ｋインジェクター カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（ＧＬサイエン
ス社，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ） 移動相：０．０２Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４−ＣＨ_３ＣＮ混液ま
たは０．１Ｍ ＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４（ｐＨ３）−ＣＨ_３
ＣＮ（１：１） 流速、１ｍｌ／分。

【００３９】参考例１ ４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチ
アゾールの代謝物の一斉分析（ガスクロマトグラフィー
−質量分析法による定量） ４−ヒドロキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチ
アゾール、４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２
−イル）ベンジルアルコール、４−（４−ヒドロキシベ
ンゾチアゾール−２−イル）ベンゾイック アシッドお
よび内部標準物質として各化合物の３−メチル誘導体
［４−ヒドロキシ−２−（３−メチルフェニル）ベンゾ
チアゾール、３−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−
２−イル）ベンジルアルコール、３−（４−ヒドロキシ
ベンゾチアゾール−２−イル）ベンゾイック アシッ
ド］を添加したヒト血漿１ｍｌ（各化合物濃度、０．５
〜 ２．０ｎｇ／ｍｌ）を、０．９％塩化ナトリウムを
含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で５倍希釈
し、実施例１と同様にしてこれら化合物の混合物を固定
化抗体カラムで同時に分離した。これを、ガスクロマト
グラフィー−質量分析法で分析したところ、ヒト血漿に
添加した、４−ヒドロキシ−２−（４−メチルフェニ
ル）ベンゾチアゾール、４−（４−ヒドロキシベンゾチ
アゾール−２−イル）ベンジルアルコール、４−（４−
ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）ベンゾイック
アシッドが一斉に定量可能であった。

【００４０】なお、固定化抗体カラムを用いて同時に分
離した試料中の化合物のカルボキシル基は、常法により
５％塩酸−メタノール中で７０℃で３０分間反応するこ
とによりメチルエステルとし、ついでヘキサメチルジシ
ラザン−トリメチルクロロシラン−ピリジン（１：１：
１）と６０℃にて４５分間反応させることによりシリル
エーテルとしてから、下記条件のガスクロマトグラフィ
ー−質量分析法で分析した。

【００４１】ガスクロマトグラフの条件 機種：ヒューレットパッカード５８９０シリーズII、ム
ービングニードル型ソル ベントカッタインジェクタを
装着 インジェクタ温度：２７０℃ カラム温度：２００℃で１分間保持した後、７．５℃／
分で２５０℃まで昇温 キャリアガス：ヘリウム。

【００４２】質量分析条件 質量分析装置：四重極型 ＶＧ ＴＲＩＯ １ イオン化法：イオン化電圧２５ｅＶの電子衝撃イオン化
法、イオン源温度２５０℃ 検出法：セレクティック・イオン・モニタリング法で検
出 モニタリングイオン：４−ヒドロキシ−２−（４−メチ
ルフェニル）ベンゾチアゾールと４−ヒドロキシ−２−
（３−メチルフェニル）ベンゾチアゾールはｍ／ｚ２９
８、４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イ
ル）ベンジルアルコールと３−（４−ヒドロキシベンゾ
チアゾール−２−イル）ベンジルアルコールはｍ／ｚ３
８６、４−（４−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イ
ル）ベンゾイック アシッドと３−（４−ヒドロキシベ
ンゾチアゾール−２−イル）ベンゾイック アシッドは
ｍ／ｚ３４２を選択した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 二重結合に隣接するメチル基を有し、該
   メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物の該メチ
   ル基を蛋白で修飾して抗原を得、次いで、該抗原を用い
   て得られる抗体で固定化抗体カラムを作成し、該カラム
   で、二重結合に隣接するメチル基を有し、該メチル基が
   生体内で酸化的代謝を受ける化合物、その代謝物および
   ／または内部標準物質を含む試料から、該メチル基が生
   体内で酸化的代謝を受ける化合物、その代謝物および／
   または内部標準物質の混合物を選択的に、かつ定量的
   に、同時に分離する方法。
2. 【請求項２】 二重結合に隣接するメチル基を有し、該
   メチル基が生体内で酸化的代謝を受ける化合物が、トル
   メチン、メフェナム酸、ブクモロール、ブプラノロー
   ル、アンチピリン、テトラヒドロカンナビノールまたは
   ４−アセトキシ−２−（４−メチルフェニル）ベンゾチ
   アゾールである請求項１の分離方法。