JPH05292974A - グアユールゴムノキゴム粒子蛋白のｄｎａクローン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ゴム粒子蛋白（ＲＰＰ）遺伝子とそのＤＮＡ
テンプレートの単離と解明、及びいろんな環境下におけ
る多くのグアユールゴムノキゴム粒子蛋白のＤＮＡクロ
ーンを複製する方法の提供。 【構成】 高度のゴム転移酵素（ＲｕＴ）活性をもつグ
アユールゴムノキゴム粒子は幾つもの特徴的な蛋白を含
んでいる。これらのうち最も豊富にあるものを調整ゲル
電気泳動法で精製した。このものはゴム粒子蛋白（ＲＰ
Ｐ）と称され、今日までに研究されたすべてのグアユー
ルゴムノキ系統に存在している。豊富なグアユールゴム
ノキＲＰＰの塩基配列をもつｃＤＮＡクローンをしら
べ、特徴づけ、そしてこのＲＰＰのアミノ酸配列を決定
した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生物工学に関するもの
で、更に詳しくはゴム粒子蛋白（ＲＰＰ）遺伝子とその
ＤＮＡテンプレートの単離と解明、及びいろんな環境下
における多くのグアユールゴムノキゴム粒子蛋白（以下
ＲＰＰと略す）のＤＮＡクローンを複製する方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】ゴムは２千種以上の植物中に見出される
が、科としては極めて少ない（Ｂａｃｋｈａｕｓ：Ｉｓ
ｒａｅｌ Ｊ．Ｂｏｔ、３４、２８３；及びＡｒｃｈｅ
ｒほか：（１９６３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐ
ｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｒｕｂｂｅｒｌｉｋｅ Ｓｕｂｓ
ｔａｎｃｅｓ，Ｌ．Ｂａｔｅｍａｎ編、ｐ．４１−７
２、ＭａｃＬａｒｅｎ、ロンドン参照）。ゴムの分子は
４００から３０，０００のインプレンモノマーが頭と尾
がつながった形で酵素的に結合したポリマーである。グ
アユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎ
ｔａｔｕｍ）は砂漠の灌木で、幹皮組織の柔軟細胞内に
蓄積する別々のゴム粒子の内に高分子量のゴム分子を生
産する。植物内のゴム形成を行うイソプレンの特異的な
シス−１，４−重合をおこす酵素であるところのゴムト
ランスフェラーゼ（ＲｕＴ）〔Ｅ．Ｃ．２．５．１．２
０〕は、このようなゴム粒子中に局在している（Ｃｏｒ
ｎｉｓｈ及びＢａｃｋｈａｕｓ：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．
２９：３８０９−３８１３、１９９０）。ほんの少数の
蛋白がＧＰＰに関係しており、そしてゴムの形成に必要
と認められてきた。そのひとつが恐らくはＲｕＴであ
る。

【０００３】ゴム粒子の中の最も豊富な蛋白が単離さ
れ、精製され、特徴づけられ、そしてＲＰＰと呼ばれて
いる。グアユールゴムノキの幹皮から単離されたゴム粒
子からの蛋白のドデシル硫酸ソーダーポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、簡単かつ効果
的なＲＰＰ精製法である。グアユールゴムノキゴム粒子
と関連する明瞭な蛋白のバンドの数は植物の年令、収穫
時期、遺伝子型又は分離方法に応じて１つから数コの範
囲で変動する。しかしどんな場合でも、単一のそして最
も多く存在する蛋白は、４８．５〜５２，０００ダルト
ンの分子量をもつＲＰＰである。３つの異なったグアユ
ールゴムノキ（５９３、１１５９１及びＡｚ１０１）を
しらべたところこの蛋白が最も多いことがわかった（上
に引用のＣｏｒｎｉｓｈ及びＢａｃｋｈａｕｓの文献参
照）。

【０００４】ＲＰＰはそのアミノ酸組成、ｐＩ、オリゴ
糖側鎖の化学及びゴム粒子内の相対的位置で特徴づけら
れる（Ｂａｃｋｈａｕｓほか：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．印
刷中、１９９１）。その予想される分子量から、ＲＰＰ
は約４４４コのアミノ酸残基を含有する。これは大きめ
の見積りかとも思われる。何故ならばＲＰＰのグリコシ
ル化された部分のサイズはまだ不明だからである。ＲＰ
Ｐのアミノ酸組成から予測した１５０電気点（ｐＩ）は
６．１７である。等電点電気泳動で求めたＲＰＰのｐＩ
実測値は６．２である。

【０００５】水性緩衝液中のＲＰＰの低溶解度及びゴム
粒子との強い会合性は、それが膜蛋白であることを示唆
する。いろんな洗剤や加熱処理を伴うゴム粒子のプロテ
アーゼ消化は、ＲＰＰがゴム粒子の内部で保護された位
置を占めることを示唆する。アミノ酸組成にもとづくＲ
ＰＰの平均ハイドロパシー（ＧＲＡＶＹ）は−０．１２
で、膜蛋白のＧＲＡＶＹ値範囲内である。ＲＰＰはまた
糖蛋白としても知られている（Ｂａｃｋｈａｕｓほか、
既出文献、１９９１）。

【０００６】ＲＰＰがグアユールゴムノキＲｕＴであろ
うとする強力な外的証拠がある。ＣｏｒｎｉｓｈやＢａ
ｃｋｈａｕｓ（既出、１９９０）に記載のように、ゴム
粒子はそれが試験管内で酵素的ゴム生合成を行う能力が
ある、といったやり方でグアユールゴムノキ幹皮組織か
ら単離し精製することができる。このゴム生合成活性に
必要な酵素はＲｕＴとして、またゴムポリメラーゼ及び
ゴム・シス−１，４−ポリプレニル・トランスフェラー
ゼとして知られている。（Ｂａｃｋｈａｕｓ：Ｉｓｒａ
ｅｌ Ｊ．Ｂｏｔ．３４：２８３−２９３（１９８
５）；Ｂｅｒｎｔ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｔ．Ｒｅｓ．Ｒｅｐ
ｔ．ＡＤ−６０１、７２９（１９６３）；Ａｒｃｈｅｒ
及びＣｏｃｋｂａｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，１５：４７６−４８０（１９６９）；
Ａｒｃｈｅｒ及びＡｕｄｌｅｙ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．２９：２２１−２５７（１
９６７）及びＬｙｎｅｎ：Ｒｕｂｂｅｒ Ｒｅｓ．Ｉｎ
ｓｔ．Ｍａｌａｙａ，２１（４），３８９−４０６（１
９６９）参照）。

【０００７】ＲｕＴ活性は、グアユールゴムノキ幹皮組
織ホモジネートが重力の２４００倍以上で遠心される
と、浮遊しているゴム粒子と分離する。グアユールゴム
ノキ粒子の蛋白抽出物からのこの酵素の精製の証拠はＲ
ａｎｄａｌｌほか編のＣｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，第５巻、１８６（１９８６）中
のＢａｃｋ ｈａｕｓ及びＢｅｓｓの論文；Ｃｏｒｎｉ
ｓｈ及びＢａｃｋｈａｕｓ（既述のもの、１９９０）；
Ｂｅｎｅｄｉｃｔほか：Ｐｌａｕｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
９２、８１６−８２１（１９９０）；及びＢａｃｋｈａ
ｕｓほか（既述のもの、１９９１）に記載されている。
ＲｕＴ活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定によれば約４
８．５〜５２，０００で移動して大量のＲＰＰと会合す
る。ＲＰＰはグアユールゴムノキ中でのゴム合成に必須
である。その理由はそれがゴム合成酵素であるか、又は
ゴム形成に必要な構成蛋白だからである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ＲＰＰ遺伝子及びその
ＤＮＡテンプレートを単離し明瞭にすることであり、ま
た豊富なグアユールゴムＲＰＰのｃＤＮＡクローンを複
製することである。

【０００９】

【発明の構成】グアユールゴムノキＲＰＰの遺伝子暗号
はクローン化されている。この蛋白は、天然のゴム生合
成に必要なゴムトランスフェラーゼであると信じられて
いる。この蛋白は均質になるまで精製し、ＣＮＢｒで分
解し、そして断片をそのＮ−端末で分離する。公知の蛋
白配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってグアユールゴムノキ
幹皮ｃＤＮＡのプラス及びマイナスの鎖の増幅の開始に
用いる。これはＤＮＡの９２ｂｐのフラグメントを生
じ、それをくりかえすと公知のＲＰＰ蛋白配列に完全に
マッチングする。次いでこのものを、グアユールゴムノ
キ幹皮ラムダＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリーからの部分
的ｃＤＮＡクローンの単離に使用する。単離すると、Ｒ
ＰＰの全長に及ぶ遺伝子は形質発現ベクターにクローン
化されそしてゴムトランスファーゼ酵素活性のテストを
される。

【００１０】最初にグアユールゴムノキ幹皮ラムダＺＡ
Ｐ ｃＤＮＡライブラリーは、ＲＰＰのＣＮＢｒ発生フ
ラグメントの公知のアミノ酸配列に対応する特別の放射
能的にラベルされたオリゴヌクレオチド配列（プロー
ブ）でスクリーニングされる。陽性のクローンは再び放
射活性プローブでスクリーニングする。２８のクローン
が得られるが、これらはいろんな長さのＲＰＰ遺伝子配
列をもっている。最長のクローン（ｃ１７）は８２３塩
基対（ｂｐ）であり、これ以外の２７コの長さは８００
から４００ｂｐである。部分的ＤＮＡ配列は、すべての
クローンはオリゴヌクレオチドのプローブと同一の、そ
してもっと長い８２３ｋｂクローンをもつことを示す。
ヌクレオチド配列を分析すると、ｃ１７は３′領域のＲ
ＰＰを含む８２３ｂｐのｃＤＮＡを含むことがわかる。
挿入されたｃ１７は５′から３′方向から夫々ＣＮＢｒ
フラグメント＃２、＃１及び＃４のＤＮＡ配列暗号を含
む５０７ｂｐの転写解読枠を含有している。この５０７
ｂｐ転写解読枠は、２つのメチオニンと２つのシステイ
ンを含む１８，９５８ダルトン相当の１６９のアミノ酸
配列を暗号化する。ＲＰＰのこの領域にはＡｓｎ−Ｘ−
Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（たゞしＸは通常の２０コのアミノ酸の
いずれかを表わす）の配列との２つの活性化Ｎ−結合グ
リコシル化部分がある。さらにｃ１７は３１３ｂｐの
３′−非コドン化領域と停止コドン（ＴＡＡ）をもつ。

【００１１】ｃＤＮＡクローンｃ１７の開発のための蛋
白材料の出発源は、グアユールゴムノキ灌木の１１５９
１系統から得た幹皮組織である。この組織は天然のゴム
に富み、フェニックス都市圏内やその周辺に生育するグ
アユールゴムノキの野生研究農場から容易に入手でき
る。こゝで使用するラムダＺＡＰ ｃＤＮＡクローニン
グ系統は公知かつ一般に入手可能なラムダ・ファージ形
質発現ベクターである。その構成と制限エンドヌクレア
ーゼマップは次の文献に記載されている。Ｊ．Ｍ．Ｓｈ
ｏｒｔほか：Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７
５８３−７６００（１９８８）；Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅ及び
Ｃ．Ｈａｕｓｅｎ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，１：１−
３；Ｊ．Ｓｏｒｇｅ：Ｓｔｒａｆｅｇｉｅｓ，１：３−
７（１９８８）；Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ及びＢ．Ｊ．Ｈｏｆ
ｆｍａｎ：Ｇｅｎｅ，２５：２６３（１９８３）；Ｒ．
Ａ．Ｙｏｕｎｇ及びＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ：Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８０：１１９４−
１１９８（１９８３）；及びＣ．Ｊ．Ｗａｔｓｏｎ及び
Ｊ．Ｆ．Ｊａｃｋｓｏｎ：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏｃｈ ７９−８８（１
９８５）。

【００１２】ここに述べたようなＲＰＰのｃＤＮＡのク
ローニングや蛋白配列と構造領域の発展は構造−機能分
析を可能ならしめ、そしてグアユールゴムノキやその他
の生物体におけるゴムの生合成における役割や生合成規
則の研究の基礎をなすものである。自然のまたはその他
の寄主生物中のＲＰＰの形質発現は、適切な５′プロモ
ーター配列のＲＰＰ ｃＤＮＡ処理の実施ならびに得ら
れる組換えＲＰＰ遺伝子の該寄主動物のゲノムへの移し
換えによって定められる。次いでゴムの生合成に対する
ＲＰＰ遺伝子形質発現の効果が評価される。本発明は、
このように農学的、生物学的及び化学的に重要なもの
で、天然のゴム生産の基礎を提供すもので、組換えＤＮ
Ａ法による原核及び真核系の広範囲のものに応用可能で
ある。ＲＰＰを、またＲＰＰと実質的に同じ生物活性を
もつ蛋白を暗号化するＤＮＡ配列もこゝに開示される。
このＤＮＰ配列はｃＤＮＡやゲノムＤＮＡから得られ、
またＤＮＡ合成技術により製造できる。

【００１３】従って本発明の第一の目的はＲＰＰの暗号
をもつ組換えＤＮＡ分子及びＤＮＡ配列を提供すること
である。第二の目的はＤＮＡ配列からポリペプチドを製
造しまたそのような配列のための組換え形質発現系統を
製造するための新規かつ改良された方法を提供すること
である。第三の目的は、組換え蛋白を製造するための培
養及び適切なＤＮＡ配列を含むベクターを提供すること
である。これらの、及びその他の目的は本発明の記載、
実施例及び特に添付の図面から明白であろう。

【００１４】本発明を更にくわしく説明するために、用
語の定義を以下に掲げる。「ヌクレオチド」とは糖残基
（ペントーズ）、リン酸塩及び含窒素ヘテロ環塩基から
成るＲＮＡ又はＤＮＡのモノマー単位をあらわす。こゝ
に塩基はグリコシド炭素（ペントーズの１′炭素）によ
って糖残基と結合し、このような塩基と糖の結合をヌク
レオシドと称する。この塩基がヌクレオチドを特長づけ
る。こゝに４つの塩基はアデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）であり、４つ
のＲＮＡ塩基は、ＡとＧとＣとウラシル（Ｕ）である。
ＤＮＡヌクレオチド配列の構造表示の便宜上ふつうに行
われているように、たゞ１つのストランドのみを示すが
そこで、１つのストランドのＡはその補体上のＴをあら
わし、ＧはＣをあらわす。アミノ酸は次のように１文字
３文字の略号であらわす。 Ａ Ａｌａ アラニン Ｃ Ｃｙｓ システイン Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｇ Ｇｌｙ グリシン Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン Ｋ Ｌｙｓ リジン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン Ｒ Ａｒｇ アルギニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａｌ バリン Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン Ｙ Ｔｙｒ チロシン

【００１５】「ＤＮＡ配列」とは隣接ペントーズの３′
と５′炭素間のホスホジエステル結合によってひとつず
つ結合されたヌクレオチドの直線的な並びのことであ
る。「コドン」とはｍＲＮＡによってアミノ酸、翻訳開
始記号又は翻訳終止記号を暗号化する３つのヌクレオチ
ドのＤＮＡ配列（トリプレット）を意味する。たとえば
ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ及びＣＴＧの
ようなヌクレオチド・トリプレットはアミノ酸たるロイ
シン（Ｌｅｕ）をあらわし、ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡ
は翻訳停止記号をあらわし、ＡＴＣは翻訳開始信号をあ
らわす。

【００１６】「読取り枠」又は「解読枠」Ｒｅａｄｉｎ
ｇ Ｆｒａｍｅは、ｍＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳中
のコドンのグループ化をいう。翻訳中は適当な読取り枠
が保持されねばならぬ。たとえばＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡ
ＡＧというＤＮＡ配列は３つの読取り枠又はフェーズで
表わすことができ、その各々は異ったアミノ酸配列をも
つ。 ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＡＧ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（ＳＴＯＰ）

【００１７】「ポリペプチド」とは、隣接アミノ酸のα
−アミノとカルボキシル基の間のペプチド結合で１つま
た１つと結合したアミノ酸の線伏結合を意味する。「ゲ
ノム」とはウイルス又は細胞の全ＤＮＡをいう。就中、
オペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハ
ンサー及びリボソーム結合及び相互作用配列と同じく、
物質のポリペプチドの構造遺伝子暗号化を包含する。
「遺伝子」とは、テンプレート又はメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）によって特定のポリペプチドの特長をも
つアミノ酸配列を暗号化するところのＤＮＡ配列をあら
わす。

【００１８】「ｃＤＮＡ」とは逆転写酵素、適当なオリ
ゴヌクレオチドプライマー及びヌクレオチド混合物を用
いてＤＮＡの第１ストライドを合成するためのテンプレ
ートとしてｍＲＮＡを使用して作られた相補的又は複製
ＤＮＡをあらわす。「ＰＣＲ」とはポリメラーゼ連鎖反
応のことで、ゲノム的か又はｃＤＮＡの特異的なＤＮＡ
配列が合成のオリゴヌクレオチド転写及び非転写プライ
マー（それは標的配列をきめる）、ヌクレオチド混合物
及び温度熱サイクル養生により優先的に増幅され、プラ
イマー間の標的ＤＮＡの順次変性、アンニーリング及び
合成を可能ならしめる。

【００１９】「転写」とは遺伝子又はＤＮＡ配列からｍ
ＲＮＡを製造するプロセスをいう。「翻訳」とはｍＲＮ
Ａからポリペプチドを製造するプロセスをいう。「形質
発現」とは遺伝子又はＤＮＡ配列により行われるポリペ
プチド製造のプロセスのことで、転写と翻訳の結合を含
む。

【００２０】「プラスミド」とは非染色体性の二重鎖Ｄ
ＮＡ配列のことで、プラスミドが寄主細胞中で複製され
るような生レプリコンを含む。プラスミドが単細胞生物
中におかれると、その生物の特性は、プラスミドのＤＮ
Ａにより変化し又は変換する。たとえばアンピシリン耐
性（ＡＭＰ^Ｒ）の遺伝子をもつプラスミドは、元来がア
ンピシリンに感受性であった細胞を、抵抗性に変える。
プラスミドによって変換された細胞は形質転換体とよば
れる。

【００２１】「ファージ」又は「バクテリオファージ」
とは細菌的ウイルスのことで、それらの多くは蛋白包服
又は外皮で囲まれたＤＮＡ配列から成る（カプシド）。
「クローニング用運搬体」とはプラスミド、ファージＤ
ＮＡ、コスミド又はそれ以外のＤＮＡ配列で、寄主細胞
中で複製可能で、一つ又は少数のエンドヌクレアーゼ認
識部位で特徴づけられており、該部位において該ＤＮＡ
配列はＤＮＡの本質的生物学的機能の随伴損失なしに確
定しうる態様で切断（即ち複製、被服蛋白の生産又はプ
ロモーターや結合部位の損失）でき、そして該部位は形
質変換細胞たとえばアンピシリン耐生体の同定に用いる
に適したマーカーを含んでいる。クローニング用運搬体
は屡々ベクターとよばれる。

【００２２】「クローニング」とは非性的再生による生
物や配列から誘導される生物やＤＮＡ配列の集団をうる
プロセスをいう。「組換えＤＮＡ分子」又は「ハイブリ
ッドＤＮＡ」とは生体細胞外で末端から末端へと結合し
ておいて生体細胞中で保持しうる異なったゲノムからの
ＤＮＡセグメントから成る分子のことである。

【００２３】「形質発現コントロール配列」とは、遺伝
子に作動的に結合したときに遺伝子の形質発現をコント
ロールし調節するヌクレオチドの配列をあらわし、次の
ものが含まれる。即ち、ｌａｃ系、β−ラクタマーゼ
系、ｔｒｐ系、ｔａｃ及びｔｒｃ系、ファージラムダの
主要オペレータ及びプロモータ系、３５Ｓプロモーター
及びその他の配列で原核又は真核細胞の遺伝子の発現を
コントロールすることが知られているもの、及びそれら
のウイルスやその結合。

【００２４】「グアユールゴムノキ・ゴム粒子蛋白（Ｒ
ＰＰ）」とは、該植物中でのゴムの生成に必須のグアユ
ールゴムノキのゴム粒子中に局在しているポリペプチド
をいう。

【００２５】さて本発明はグアユールゴムノキＲＰＰの
遺伝子情報を指定するＤＮＡ配列や組換えＤＮＡ分子及
びそのようなポリペプチドの製法、それらの配列のため
の組換え形質発現系、それらを含むベクター、組換え蛋
白を生産する培養及びその生産に有用な物質に関するも
のである。グアユールゴムノキＲＰＰを暗号化するＤＮ
Ａ配列又はグアユールゴムノキＲＰＰと同じ生物活性を
実質的にもつ蛋白が示される。

【００２６】本発明のＤＮＡ配列の単離や複製のために
はいろんな選択やＤＮＡクローニング技術が活発に用い
られるけれども、精製ＲＰＰにもとづく選択手段が採用
される。

【００２７】ＲＰＰの精製とＣＮＢｒ分解。ＲＰＰの材
料は、Ｃｏｒｎｉｓｈ及びＢａｃｋｈａｕｓ（既出、１
９９０）及びＢａｃｋｈａｕｓほか（既出、１９９１）
に記載した方法でグアユールゴムノキ１１５９１系統の
幹皮組織から単離した精製ゴム粒子である。精製ゴム粒
子はＲＰＰの精製のために分取ＳＤＳ一ＰＡＧＥに付さ
れ、ゲル中で見かけ分子量が４８．５〜５２，０００ダ
ルトンと変化する蛋白質のバンドとして観察される。Ｒ
ＰＰは、メーカーの指示書に従って電気溶離器（Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）４２２モデル
を用いて電気溶離によるゲルバンドから精製される。少
くとも１，０００ｐｍｏｌｅに相当する精製ＲＰＰを凍
結乾燥し、エッペンドルフ管内で１５０μｌの７０％ギ
酸にとかす。７０％のギ酸にとかして７０μｇ／ｍｌＣ
ＮＢｒの１００μｌを加え、混合物を暗所で室温におい
て２４時間培養する。ＣＮＢｒで消化されたＲＰＰはト
リスートリシン中の１６％のアクリルアミドゲルを用
い、Ｓｃｈｕｇｇｅｒ及びＶｏｎ Ｊａｇｏｗ（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６、３６８−３７９、１９８
７）に記載の三層系でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なう。電気
泳動により蛋白フラグメントはＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）膜上にブロットされ、Ｐｌｏｕｇほか（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１、３３−３９、１９８９）
の方法によって可視化される。ペプチド含有のＰＶＤＦ
膜の部分を切りとりＮ−端末アミノ酸配列をしらべる
（Ｕｎｉｖ．Ｃａｌｉｆ．Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｌａｂ）。ＲＰＰの６つの顕著
なペプチド断片のアミノ酸配列を図１に示す。

【００２８】グアユールゴムノキ幹皮ｍＲＮＡの単離。
グアユールゴムノキ１０ｇを１ｃｍサイズに切断し、ポ
リトロン中で２倍量のグアニジン緩衝液（８Ｍ グアニ
ジンＨｃｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ７、２０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、５０ｍＭ メルカプトエタノール）で２分間ホ
モゲナイズする。ホモジネートを１容量部のフェノール
ー７００ホルムで抽出し、１５℃で４５分間１０，００
０ｒｐｍで遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌ，ＳＳ−３４ロ
ーター）。水相を新しいチューブに移し、１５℃で１
０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄液を新しいチ
ューブに移す。こゝへ０．７容量部の冷却した１００％
のエタノールと０．２容量部の１Ｍ酢酸を加える。これ
を−２０℃で一夜保存する。４℃で５，０００ｒｐｍで
１０分間遠心してＲＮＡを回収する。ペレットを室温
で、無菌の３Ｍ酢酸ソーダ（ｐＨ５．２）で洗い、１
０，０００ｒｐｍで５分間遠心する。ペレットを７０％
エタノールで洗い、減圧乾燥し、無菌水にとかす。Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋほか（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２
版、７．２６〜７．２９（１９８９））に記載の方法に
したがって、オリゴｄＴセルローズ上での分画によりＲ
ＮＡからポリーＡ＋ｍＲＮＡが精製される。

【００２９】 グアユールゴムノキ幹皮ｃＤＮＡライブラリーの構築 メーカーのプロトコールに従って、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ
ｅ社から入手できるキットのラムダＺＡＰ中のライブラ
リーの構築のためのｃＤＮＡの生成のために、グアユー
ルゴムノキ幹皮ｍＲＮＡを用いる。ラムダＺＡＰはＳｈ
ｏｒｔほか：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、７
５８３−７６００、１９８８に記載されている。

【００３０】グアユールゴムノキＲＰＰｃＤＮＡのＰＣ
Ｒ増幅。グアユールゴムノキ幹皮ｃＤＮＡライブラリー
はまず、グアユールゴムノキｃＤＮＡのＰＣＲ増幅で生
成した９２ｂｐのプロープ（配列 Ｐ５／６〔図２〕）
でスクリーニングする。最初の鎖ｃＤＮＡ合成はメーカ
ーの指示書に従ってＳｔｒａｔｅｇｅｎｅのｃＤＮＡ合
成キットを用いて行なった。グアユールゴムノキ幹皮ｍ
ＲＮＡ約１．５μｇをオリゴ−ｄＴ逆転写酵素とヌクレ
オチド混合物の存在下に３７℃で１時間培養する。一本
鎖ｃＤＮＡを、最終濃度０．５Ｍの酢酸アンモニウム
（ｐＨ４．５）を加え、次いで２容量部のエタノールを
加えることによって沈でんさせる。この混合物を室温で
１０分間、１４０００ｒｐｍでマイクロ遠心分離し、ペ
レットを７０％エタノール２００μｌで洗い、減圧乾燥
し、無菌水５０μｌに再びとかす。

【００３１】９２ｂｐ Ｐ５／６配列（図２）を生成さ
せるのに次のものを用いる。即ち配列Ｐ５（図２）、Ｃ
ＮＢｒフラグメント＃４及び配列６（図２）のセンスス
トランドＤＮＡに対応する同義性２０−ｍｅｒオリゴヌ
クレオチドプライマー及びＣＮＢｒフラグメント＃４
（図１）のアンチセンスストランドＤＮＡに対応する同
義性２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマー。各プ
ライマー１００ｐｍｏｌ、上述のｃＤＮＡ混合物１μ
ｌ、各ヌクレオチド０．２ｍＭ及び２０ｍＭの硫酸アン
モンと１．５ｍＭの酸化マグネシウムを含む５０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中のリプリナーゼ
（デュポン社）０．５μｌの反応混合物を、９４℃で１
分、５５℃で２分そして７２℃で３分の加熱サイクルで
３９回処理し次いで７２℃で１０分処理して増幅する。
得た混合物をアガローズのゲル上に流して９２ｂＰフラ
グメントをうる。このフラグメントのＤＮＡ配列は、図
２と図３に示すようにＣＮＢｒフラグメント＃４のアミ
ノ酸配列と正確にマッチしている。

【００３２】これに次いでＰ５／６の放射能的にラベル
した^３２Ｐプローブを、テンプレートＤＮＡとして精製
Ｐ５／６プロープを用いかつＰ５及びＰ６の各プライマ
ーを用いて再生成する。こゝにおいて、既出のＳａｍｂ
ｒｏｏｋほかの文献に示された方法に従ってラムダＺＡ
Ｐ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用
いる高特異活性のプローブが得られる。

【００３３】ｃ１７クローンの配列の決定〜次いで、Ｐ
５／６はＲＰＰ遺伝子（図３）の３′末端領域を暗号化
することが見出された。すなわちｃＤＮＡライブラリー
をＰ５／６でスクリーニングすると、ｃ１７のような部
分的ｃＤＮＡクローンのみが優先的に単離されることが
わかった。長いｃＤＮＡクローンを単離するために、新
しいＰＣＲ増幅プローブ（Ｐ１／９）が開発された。そ
れは約４５０ｂｐの長さであって、ＣＮＢｒフラグメン
ト＃５中に含まれるＤＮＡの遺伝情報を指定するプライ
マー配列Ｐ１（図２）同義性２０−ｍｅｒオリゴヌクレ
オチドセンスストランドと、ｃ１７の５′領域内とフラ
グメント＃２内に含まれるＤＮＡの遺伝情報を指定する
プライマー配列Ｐ９（図２及び図３）同義性２３−ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチドアンチセンスストランドの間の、
内部ＲＰＰ配列の遺伝情報を指定する。Ｐ１／９にｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いら
れ、ｃＤＮＡクローンの全長の同定に用いられる。Ｐ１
／９を得るためには、テンプレートとしては同様の幹皮
ｃＤＮＡが用いられるべきなので、Ｐ１／９を含有する
ｃＤＮＡクローンもまたライブラリー中に存在すべきで
あると考えられる。さらに、Ｐ１／９クローンの長さは
４５０ｂｐなので、約１２００〜１４００ｂｐの読取り
枠をもつと考えられるＲＰＰ遺伝子の予想される長さに
基づいて、ＲＰＰの推定５′末端まで延長させる。

【００３４】必要とあれば、ＲＰＰの残りの５′領域を
クローンとするためにＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎほ
か：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８５、８９９８−９００２、１９８８）から代替手段と
して用いうる。この方法は、現在はＲＰＰ遺伝子の正確
なＤＮＡ配列の大部分が知られているため、実施可能で
ある。

【００３５】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング。
組換えラムダＺＡＰ ｃＤＮＡを含むプラークをメンブ
レンフィルター（Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐａｇｕｅ Ｓｃｒｅ
ｅｎ，デュポン社）へ移し、６Ｘ ＳＳＰＣ、５Ｘデン
ハルト液、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、２０
０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ及び１０％デキストラン
サルフェート中で４２℃で１８時間、放射能的にラベル
されたＰ５／６にハイブリド化して最初のスクリーニン
グを行なう。洗液を２Ｘ ＳＳＣ中で１０分間ずつ２回
洗い、次いで２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で２０
分間ずつ２回洗う。最初のスクリーニングからの陽性プ
ラークを、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハルト液、０．５
％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で
４２℃で１８時間、放射線的にラベルされたＰ５／６に
ハイブリド化して、ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ）上で再スクリーニングす
る。次いで最初のスクリーニング物と同じように洗浄す
る。

【００３６】第２のスクリーニングに陽性の反応を示す
クローンを、次いでラムダＺＡＰプロトコールに従って
切除する。標準的な少量製造方法によってプラスミドＤ
ＮＡを単離し、アガローズゲル上で分離する。最大のｃ
ＤＮＡ挿入を含むブルースクリプトプラスミドを生ずる
これらのコロニーは、さらにＤＮＡ配列決定により特徴
づけられる。

【００３７】ＤＮＡ配列決定 ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（Ｕ．Ｓ．Ｂｏｃｈｅｍｉｃａｌ
社）を、メーカーの指示書に従って操作し、ジデオキシ
連鎖終止法を用いてＤＮＡ配列決定を行なう。ＲＰＰを
ＣＮＢｒで分解すると、Ｎ末端から配列しうる少くとも
６コの明瞭なペプチドフラグメントが得られる（図
１）。アミノ酸配列は、長さでいえば１２から３６の残
基の範囲にある。このうち＃２、４、５及び６のペプチ
ドフラグメントは、低同義性の少くとも１７ｂｐの推論
されるＤＮＡストレッチを生ずる（図２）。これらの部
分に対応するオリゴヌクレオチド酸を合成し、ＰＣＲ増
幅化によって、より大きなグアユールゴムノキｃＤＮＡ
を製造するのに使用する。このうち２つのＰＣＲ生産物
がうまく作られた。即ち公知のＣＮＢｒフラグメント＃
４（図２）とマッチしたＰ５／６たる９２ｂｐ配列、及
びＣＮＢｒフラグメント＃２と＃５を架橋するＲＰＰ配
列の５′領域を含むＰ１／９たる４５０ｂｐ配列であ
る。Ｐ５／６の配列はＲＰＰ遺伝子の３′末端に情報を
伝える８２３ｂｐ挿入物を含む大きなｃＤＮＡクローン
ｃ１７をうまく単離すうプローブとして用いる（図
３）。ＡＶＨＮ（こゝにＡは１、Ｖは２等々）に情報を
伝えるヌクレオチドＧＣＴ ＧＴＧ ＣＡＣ ＡＡＴか
ら出発して、１８，９５８ダルトンに相当する分子量の
１６９のアミノ酸のポリペプチドを暗号化する５０７ｂ
ｐの読取り枠をこのＣ１７はもっている。このポリペプ
チドは、５′から３′の方向への６コのＣＮＢｒフラグ
メントのうちの３コ（＃２、１及び４）とぴったり一致
している。予期されたように、これらのフラグメントの
各々は、ＣＮＢｒ消化の分裂側であるところのメチオニ
ンよりも先行する。しかしＡＶＨＮから上流の領域は、
ＣＮＢｒフラグメント＃２の公知の配列から推論され、
ｃ１７中には現れない。より大きいｃＤＮＡ挿入物を次
いでクローニングすると、正にその配列がわる。さら
に、ｃ１７は１０の位置及び最末端のｃすなわち１６８
の位置に、２コのシステインを含有している。ｃ１７は
また、ＡＶＨＮ側から５３及び８９の位置に２つの恐ら
くはＮ−結合したグリコシル化側をもっている。このこ
とは、糖蛋白として知られているグアユールゴムノキＲ
ＰＰの構造と一致している。このｃ１７ＲＰＰ領域は、
約２．２のｐＫａで負に帯電している。ｃ１７クローン
の残部は、末端配列として予想されるＡＴに富んだ３１
３ｂｐの３′の暗号とならぬ配列とＴＡＡ停止コドンを
もっている。

【００３８】ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ及びＮＢＲＦの
電算機調査は、ｃ１７の読みとり枠内の１６９のアミノ
酸配列に対応するいかなる既存のＤＮＡ又はアミノ酸配
列との同等性を与えない。これらの配列は、ＲＥＦやＦ
ＰＰ合成酵素（Ｄｅｎｎｉｓ及びＬｉｇｈｔ：Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１８６０８；Ｌｉｇｈｔ及び
Ｄｅｎｎｉｓ：同誌１８５８９、１９８９）を含むゴム
生化学と多分かゝわり合うＨｅＶｅａ蛋白の公知の配列
のいかなるものともマッチしない。グアユールゴムノキ
ＲＰＰの真の役割は未決定である。

【００３９】上述のように、本発明はグアユールゴムノ
キＲＰＰを精製しその蛋白のいろんなフラグメントのア
ミノ酸配列を決定するというところの、グアユールゴム
ノキＲＰＰにもとづいた選択戦略に基づくものである。
これらの蛋白配列に基づき、最少のヌクレオチド同義性
をもつＲＰＰのこれらの領域に対応するいくつかのオリ
ゴヌクレオチドＤＮＡプローブが合成される。次いでこ
れらのプローブは、ファージクローニングベクター中に
挿入されたグアユールゴムノキｃＤＮＡ配列を含む大腸
菌細胞から成るグアユールゴムノキ樹皮ｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングに用いられる。

【００４０】本発明のｃＤＮＡ配列は、形質発現コント
ロール配列に作動的に結合し、いろんな真核が原核寄主
細胞に用いられ、それらによって情報を伝達するポリペ
プチドが製造される。本発明のｃＤＮＡ配列は、またポ
リペプチド情報を伝えるゲノムＤＮＡ配列スクリーニン
グ用のプローブとしても有用である。本発明の上記のｃ
ＤＮＡ配列と同様、これらのゲノム配列はまたそれらに
よって情報を伝えるポリペプチドの製造のためにも有用
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】豊富にあるグアユールゴムノキＲＰＰのシアノ
ゲンプロマイド消化から得られるフラグメントのアミノ
酸配列である。

【図２】本発明で得られたところの化学的合成によるオ
リゴヌクレオチドＤＮＡプローブ及び／又はプライマー
を示す。

【図３】ＲＰＰのｃ１７クローンのｃＤＮＡ挿入物のヌ
クレオチド配列を示す。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図３に示すような８２３の塩基対挿入を
   含有するグアユールゴムＲＰＰクローンｃ１７
2. 【請求項２】 図３に示すアミノ酸配列をもつグアユー
   ルゴムＲＰＰを暗号化するところの、図３に示すような
   ヌクレオチド配列をもつｃＤＮＡ配列
3. 【請求項３】 図３のアミノ酸配列をもつグアユールゴ
   ムＲＰＰを暗号化するヌクレオチド配列から成るｃＤＮ
   Ａ配列
4. 【請求項４】 グアユールゴムＲＰＰのｃＤＮＡ配列に
   ハイグリド化するＤＮＡ配列
5. 【請求項５】 ＲＰＰがＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈ
   ｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
   −Ｖａｌ−から成るアミノ酸配列を含有するところのグ
   アユールゴムＲＰＰを暗号化する単離されたＤＮＡ配列
6. 【請求項６】 ＲＰＰがＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅ
   ｒ−Ｘ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
   ｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈ
   ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
   −から成るアミノ酸配列を含有するグアユールゴムＲＰ
   Ｐを暗号化する、単離されたＤＮＡ配列
7. 【請求項７】 ＲＰＰがＴｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈ
   ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
   −Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−
   Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−から成るアミノ酸配列を含有
   するグアユールゴムＲＰＰを暗号化する、単離されたＤ
   ＮＡ配列
8. 【請求項８】 第２項の組換えＤＮＡ分子において、該
   ＤＮＡ配列が分子中で形質発現コントロール配列に有効
   に結合しているもの
9. 【請求項９】 第５項の組換えＤＮＡ分子において、該
   ＤＮＡ配列が分子中で形質発現コントロール配列に有効
   に結合しているもの
10. 【請求項１０】 第６項の組換えＤＮＡ分子において、
    該ＤＮＡ配列が分子中で形質発現コントロール配列に有
    効的に結合しているもの
11. 【請求項１１】 第７項の組換えＤＮＡ分子において、
    該ＤＮＡ配列が分子中で形質発現コントロール配列に有
    効的に結合しているもの
12. 【請求項１２】 第８項の組換えＤＮＡ分子において、
    該形質発現コントロール配列がｌａｃ系、β−ラクタマ
    ーゼ系、ｔｒｐ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主オペ
    レーター及びプロモーター領域、ＮＯＳプロモーター及
    びターミネーター系、３５Ｓプロモーター、及び原核又
    は真核細胞の遺伝子発現をコントロールするところのそ
    の他の配列より成る群から選ばれたものである場合
13. 【請求項１３】 第９項の組換えＤＮＡ分子において、
    該形質発現コントロール配列がｌａｃ系、β−ラクタマ
    ーゼ系、ｔｒｐ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主オペ
    レーター及びプロモーター領域、ＮＯＳプロモーター及
    びターミネーター系、３５Ｓプロモーター、及び原核又
    は真核細胞の遺伝子発現をコントロールするところのそ
    の他の配列より成る群から選ばれたものである場合
14. 【請求項１４】 第１０項の組換えＤＮＡ分子におい
    て、該形質発現コントロール配列がｌａｃ系、β−ラク
    タマーゼ系、ｔｒｐ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主
    オペレーター及びプロモーター領域、ＮＯＳプロモータ
    ー及びターミネーター系、３５Ｓプロモーター、及び原
    核又は真核細胞の遺伝子発現をコントロールするところ
    のその他の配列より成る群から選ばれたものである場合
15. 【請求項１５】 第１１項の組換えＤＮＡ分子におい
    て、該形質発現コントロール配列がｌａｃ系、β−ラク
    タマーゼ系、ｔｒｐ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主
    オペレーター及びプロモーター領域、ＮＯＳプロモータ
    ー及びターミネーター系、３５Ｓプロモーター、及び原
    核又は真核細胞の遺伝子発現をコントロールするところ
    のその他の配列より成る群から選ばれたものである場合