JPH05279392A - ヒトヘモグロビン誘導体と、その合成方法と、それによって得られる物質と、この物質および誘導体の利用 - Google Patents
ヒトヘモグロビン誘導体と、その合成方法と、それによって得られる物質と、この物質および誘導体の利用Info
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- JPH05279392A JPH05279392A JP4239057A JP23905792A JPH05279392A JP H05279392 A JPH05279392 A JP H05279392A JP 4239057 A JP4239057 A JP 4239057A JP 23905792 A JP23905792 A JP 23905792A JP H05279392 A JPH05279392 A JP H05279392A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトヘモグロビン誘導体と、その合成方法
と、それによって得られる物質と、この物質および誘導
体の利用。 【構成】 ヘモグロビンテトラマーと少なくとも４つの
−ＣＯＯ- 基を有するポリカルボキシル化合物とを共有
カップリングさせて得られるヒトヘモグロビンテトラマ
ーの誘導体であって、上記ポリカルボキシル化合物はヘ
モグロビンの２つのダイマー間を内部架橋させ且つヘモ
グロビンの天然のアロステリックエフェクターが存在し
ない状態でも生体内で上記結合を利用できるような酸素
親和性をヘモグロビンに与えるものであることを特徴と
する誘導体。ポリカルボキシル化合物はベンゼンヘキサ
カルボキシレート、ベンゼンテトラカルボキシレートに
することができる。
と、それによって得られる物質と、この物質および誘導
体の利用。 【構成】 ヘモグロビンテトラマーと少なくとも４つの
−ＣＯＯ- 基を有するポリカルボキシル化合物とを共有
カップリングさせて得られるヒトヘモグロビンテトラマ
ーの誘導体であって、上記ポリカルボキシル化合物はヘ
モグロビンの２つのダイマー間を内部架橋させ且つヘモ
グロビンの天然のアロステリックエフェクターが存在し
ない状態でも生体内で上記結合を利用できるような酸素
親和性をヘモグロビンに与えるものであることを特徴と
する誘導体。ポリカルボキシル化合物はベンゼンヘキサ
カルボキシレート、ベンゼンテトラカルボキシレートに
することができる。
Description
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明は、血管内に良好に存続し
且つ天然のヘモグロビンよりも酸素親和性が低い新規な
ヘモグロビン誘導体に関するものであり、特に、インビ
ボでヘモグロビンの天然のアロステリックエフェクター
（２，３−ジホスホグリセレート、ＤＰＧ）の非存在下
でも酸素を運搬するのに利用可能なヘモグロビン誘導体
に関するものである。本発明はさらにこの誘導体の合成
方法と、それによって得られた物質と、この誘導体およ
び物質の酸素運搬剤、特に輸血における酸素運搬剤とし
ての利用に関するものである。
且つ天然のヘモグロビンよりも酸素親和性が低い新規な
ヘモグロビン誘導体に関するものであり、特に、インビ
ボでヘモグロビンの天然のアロステリックエフェクター
（２，３−ジホスホグリセレート、ＤＰＧ）の非存在下
でも酸素を運搬するのに利用可能なヘモグロビン誘導体
に関するものである。本発明はさらにこの誘導体の合成
方法と、それによって得られた物質と、この誘導体およ
び物質の酸素運搬剤、特に輸血における酸素運搬剤とし
ての利用に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】フランス国特許出願第 2,600,894号およ
び第 2,630,329号には、ポリアニオン部位、特にベンゼ
ンカルボキシレート部位、例えばポリカルボキシレート
部位を有する水溶性ポリマーは水溶性カルボジイミドの
存在下でヒトヘモグロビンに共有状態で結合できるとい
うこと、また、オキシ型ヘモグロビンと反応させた場合
でも、得られた結合体(conjugues) は（ＤＰＧの非存在
下で) 元の蛋白よりも酸素親和性が大幅に低くなるとと
いうことが示されている。
び第 2,630,329号には、ポリアニオン部位、特にベンゼ
ンカルボキシレート部位、例えばポリカルボキシレート
部位を有する水溶性ポリマーは水溶性カルボジイミドの
存在下でヒトヘモグロビンに共有状態で結合できるとい
うこと、また、オキシ型ヘモグロビンと反応させた場合
でも、得られた結合体(conjugues) は（ＤＰＧの非存在
下で) 元の蛋白よりも酸素親和性が大幅に低くなるとと
いうことが示されている。
【０００４】ベンゼンヘキサカルボキシレートに由来す
る部位をモノ置換したポリオキシエチレンをオキシヘモ
グロビンに結合して得られる結合体をさらに詳細に研究
した結果から、蛋白のアロステリックポケット（特にこ
のポケットにある末端βＮ−バリンのα−アミノ基）が
ポリマー固定用の特異な結合部位であるということが分
かっている〔デラシェリー(E. DELLACHERIE)とレオナー
ド(M. LEONARD)の "J.Protein Chem." 1991, (10)１、6
1-67 〕。ヘモグロビンのアロステリック部位付近に陰
イオン基が存在すると、ヘモグロビンの酸素に対する親
和性が低下し、ポリマーの存在によって分子サイズが大
きくなり、変成ヘモグロビンは天然型のヘモグロビンよ
りもインビボで血管内に長く存続する（生体膜を通して
の拡散が大幅に減少する）。
る部位をモノ置換したポリオキシエチレンをオキシヘモ
グロビンに結合して得られる結合体をさらに詳細に研究
した結果から、蛋白のアロステリックポケット（特にこ
のポケットにある末端βＮ−バリンのα−アミノ基）が
ポリマー固定用の特異な結合部位であるということが分
かっている〔デラシェリー(E. DELLACHERIE)とレオナー
ド(M. LEONARD)の "J.Protein Chem." 1991, (10)１、6
1-67 〕。ヘモグロビンのアロステリック部位付近に陰
イオン基が存在すると、ヘモグロビンの酸素に対する親
和性が低下し、ポリマーの存在によって分子サイズが大
きくなり、変成ヘモグロビンは天然型のヘモグロビンよ
りもインビボで血管内に長く存続する（生体膜を通して
の拡散が大幅に減少する）。
【０００５】これらのポリマー結合体を使用した場合に
は４つの大きな欠点、すなわち、反復使用した場合にア
ナフィラキシーショックの危険があり（デキストランで
観察される）、高分子量であるため服用できないという
問題（マルチテトラマーの形成）があり、これらの結合
体を含む溶液は粘性が高く、組織透過性が制限され、し
かも、ポリマーの価格が高いといった欠点がある。
は４つの大きな欠点、すなわち、反復使用した場合にア
ナフィラキシーショックの危険があり（デキストランで
観察される）、高分子量であるため服用できないという
問題（マルチテトラマーの形成）があり、これらの結合
体を含む溶液は粘性が高く、組織透過性が制限され、し
かも、ポリマーの価格が高いといった欠点がある。
【０００６】また、オキシヘモグロビンとフマル酸等の
カルボン酸でエステル化された，３，５−ジブロモサリ
チル酸とを反応させることも提案されている〔エストッ
プ(T. N. Estop)達およびブキ(E.Bucci) 達、Internati
onal Symposium on Red Cell Substitutes, Holiday In
n, Fisherman's Wharf, San Francisco, California,
ＵＳＡ，16〜19, May 1989〕。デボア(A. Desbois)達は
２〜６個のカルボキシル基を有するポリカルボキシレー
トの酸素に対するヘモグロビンの挙動を研究している
〔J. Mol. Biol. 1975,92 (3) 479〜49〕。これは共有
結合の問題ではなく、ポリカルボキシレートとヘモグロ
ビンとの単なる相互作用の問題である。
カルボン酸でエステル化された，３，５−ジブロモサリ
チル酸とを反応させることも提案されている〔エストッ
プ(T. N. Estop)達およびブキ(E.Bucci) 達、Internati
onal Symposium on Red Cell Substitutes, Holiday In
n, Fisherman's Wharf, San Francisco, California,
ＵＳＡ，16〜19, May 1989〕。デボア(A. Desbois)達は
２〜６個のカルボキシル基を有するポリカルボキシレー
トの酸素に対するヘモグロビンの挙動を研究している
〔J. Mol. Biol. 1975,92 (3) 479〜49〕。これは共有
結合の問題ではなく、ポリカルボキシレートとヘモグロ
ビンとの単なる相互作用の問題である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本出願人は、驚くべき
ことに、ある反応条件下では、遊離のベンゼンポリカル
ボン酸、好ましくはテトラ−ベンゼンヘキサカルボン酸
をオキシヘモグロビンに固定すると、天然のエフェクタ
ーが存在しない場合でも生体内で使用できる酸素親和性
を有し、しかも、ダイマーに分解しないヘモグロビン誘
導体ができるということを見出した。この後者の特性に
より、ヘモグロビンが血管および腎臓で失われるという
問題が解決され、従来用いられてきたポリマーが不要に
なり、従って、制御が困難な試薬での架橋を行わずに済
むようになる。本出願人はさらに、この現象を少なくと
も４つの−ＣＯＯ- 基を有する小さな分子のポリカルボ
キシル化合物にも適用することができることを見出し
た。すなわち、驚くべきことに、これらの分子はヘモグ
ロビンのαβダイマー間に分子間架橋(pont)を形成し
て、蛋白質を内部架橋させるということが分かった。こ
の架橋には２つの共有結合が関与するため、十分な効果
因子の役目をするためには少なくともさらに２つのカル
ボキシル基を持つ必要がある。
ことに、ある反応条件下では、遊離のベンゼンポリカル
ボン酸、好ましくはテトラ−ベンゼンヘキサカルボン酸
をオキシヘモグロビンに固定すると、天然のエフェクタ
ーが存在しない場合でも生体内で使用できる酸素親和性
を有し、しかも、ダイマーに分解しないヘモグロビン誘
導体ができるということを見出した。この後者の特性に
より、ヘモグロビンが血管および腎臓で失われるという
問題が解決され、従来用いられてきたポリマーが不要に
なり、従って、制御が困難な試薬での架橋を行わずに済
むようになる。本出願人はさらに、この現象を少なくと
も４つの−ＣＯＯ- 基を有する小さな分子のポリカルボ
キシル化合物にも適用することができることを見出し
た。すなわち、驚くべきことに、これらの分子はヘモグ
ロビンのαβダイマー間に分子間架橋(pont)を形成し
て、蛋白質を内部架橋させるということが分かった。こ
の架橋には２つの共有結合が関与するため、十分な効果
因子の役目をするためには少なくともさらに２つのカル
ボキシル基を持つ必要がある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の対象物は、ヘモ
グロビンテトラマーと少なくとも４つの−ＣＯＯ- 基を
有するポリカルボキシル化合物との共有カップリングさ
せて得られるヒトヘモグロビンテトラマーの誘導体であ
って、上記ポリカルボキシル化合物はヘモグロビンの２
つのダイマー間を内部架橋させ且つヘモグロビンの天然
のアロステリックエフェクターが存在しない状態でも生
体内で上記結合を利用できるような酸素親和性をヘモグ
ロビンに与える、換言すれすば、血液が送られた組織で
酸素を放出できるように酸素と可逆的に結合可能な酸素
親和性をヘモグロビンに与えるものであることを特徴と
する誘導体にある。共有カップリングは酸素の存在下で
も不存在下でも起こり、従って、オキシヘモグロビンで
もデオキシヘモグロビンでも起こる。
グロビンテトラマーと少なくとも４つの−ＣＯＯ- 基を
有するポリカルボキシル化合物との共有カップリングさ
せて得られるヒトヘモグロビンテトラマーの誘導体であ
って、上記ポリカルボキシル化合物はヘモグロビンの２
つのダイマー間を内部架橋させ且つヘモグロビンの天然
のアロステリックエフェクターが存在しない状態でも生
体内で上記結合を利用できるような酸素親和性をヘモグ
ロビンに与える、換言すれすば、血液が送られた組織で
酸素を放出できるように酸素と可逆的に結合可能な酸素
親和性をヘモグロビンに与えるものであることを特徴と
する誘導体にある。共有カップリングは酸素の存在下で
も不存在下でも起こり、従って、オキシヘモグロビンで
もデオキシヘモグロビンでも起こる。
【０００９】ポリカルボキシル化合物(molecules polyc
arboxyliques) は４〜６つの−ＣＯＯ- 基を有するのが
好ましく、飽和または不飽和の単環状分子あるいは主鎖
に４〜６個の炭素原子を有する直鎖または側鎖を有する
分子であるのが好ましい。好ましいポリカルボキシル化
合物としてはポリカルボキシルベンゼン、特にヘキサま
たはテトラカルボキシルベンゼンと、ポリカルボキシル
シクロヘキサンとを挙げることができる。
arboxyliques) は４〜６つの−ＣＯＯ- 基を有するのが
好ましく、飽和または不飽和の単環状分子あるいは主鎖
に４〜６個の炭素原子を有する直鎖または側鎖を有する
分子であるのが好ましい。好ましいポリカルボキシル化
合物としてはポリカルボキシルベンゼン、特にヘキサま
たはテトラカルボキシルベンゼンと、ポリカルボキシル
シクロヘキサンとを挙げることができる。
【００１０】本発明の他の対象は、少なくとも一部に本
発明の誘導体を含むヒトヘモグロビンテトラマーをベー
スとした酸素運搬溶液にある。
発明の誘導体を含むヒトヘモグロビンテトラマーをベー
スとした酸素運搬溶液にある。
【００１１】本発明のさらに他の対象は、ヘモグロビン
分子のテトラマー、好ましくはオキシヘモグロビンと上
記のポリカルボキシル化合物とを、ヘモグロビン分子の
２つのダイマー間で架橋が形成されるような条件下で、
共有カップリングさせることを特徴とするヘモグロビン
テトラマー誘導体の合成方法にある。
分子のテトラマー、好ましくはオキシヘモグロビンと上
記のポリカルボキシル化合物とを、ヘモグロビン分子の
２つのダイマー間で架橋が形成されるような条件下で、
共有カップリングさせることを特徴とするヘモグロビン
テトラマー誘導体の合成方法にある。
【００１２】このカップリングは共有結合に適した試
薬、例えばＮ’−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミドクロロハイドレート（ＥＤＣ
Ｉ）あるいはペプチド合成で従来から用いられている他
の任意の試薬の存在下で行うのが好ましい。
薬、例えばＮ’−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミドクロロハイドレート（ＥＤＣ
Ｉ）あるいはペプチド合成で従来から用いられている他
の任意の試薬の存在下で行うのが好ましい。
【００１３】カップリングは架橋率が約50％以上、好ま
しくは80％以上となり且つ誘導体のＰ50が1000Pa以上、
好ましくは1300Pa以上となる条件で行うのが好ましい
（Ｐ50は温度25℃、pH 7.2の0.05Ｍトリスバッファー中
で測定）。
しくは80％以上となり且つ誘導体のＰ50が1000Pa以上、
好ましくは1300Pa以上となる条件で行うのが好ましい
（Ｐ50は温度25℃、pH 7.2の0.05Ｍトリスバッファー中
で測定）。
【００１４】ベンゼンヘキサカルボキシレート（ＢＨ
Ｃ）の場合には、ヘモグロビンとの共有カップリングを
モル比ＢＨＣ／HbおよびＥＤＣＩ／Hbをそれぞれ３およ
び８または５および６にすることができる。ベンゼンテ
トラカルボキシレート（ＢＴＣ）の場合には、モル比Ｂ
ＴＣ／HbおよびＥＤＣＩ／Hbをそれぞれ５および32にす
ることができる。本発明の有利な特徴の１つはカップリ
ングを塩化ナトリウムの存在下に行うことができる点に
ある。
Ｃ）の場合には、ヘモグロビンとの共有カップリングを
モル比ＢＨＣ／HbおよびＥＤＣＩ／Hbをそれぞれ３およ
び８または５および６にすることができる。ベンゼンテ
トラカルボキシレート（ＢＴＣ）の場合には、モル比Ｂ
ＴＣ／HbおよびＥＤＣＩ／Hbをそれぞれ５および32にす
ることができる。本発明の有利な特徴の１つはカップリ
ングを塩化ナトリウムの存在下に行うことができる点に
ある。
【００１５】本発明のさらに他の対象物は上記方法で得
られる安定化されたヘモグロビンテトラマー溶液、特
に、Ｐ50が1000Pa以上、好ましくは1300Pa以上であるヘ
モグロビン誘導体を50％以上、好ましくは80％以上含む
安定化されたヘモグロビンテトラマー溶液にある。
られる安定化されたヘモグロビンテトラマー溶液、特
に、Ｐ50が1000Pa以上、好ましくは1300Pa以上であるヘ
モグロビン誘導体を50％以上、好ましくは80％以上含む
安定化されたヘモグロビンテトラマー溶液にある。
【００１６】本発明の変成ヘモグロビンテトラマーは、
人体組織または器官への酸素の運搬を改善したい全ての
場合、例えば大量出血の場合（代用血液として）、各種
の血管抵抗が生じた場合（赤血球よりも小さい酸素運搬
体として）あるいは代用血液を用いてシャントを作らな
ければならない血管形成術の場合の酸素運搬体として人
体の治療分野で利用することができる。従って、本発明
のさらに他の対象は、本発明の誘導体またはその溶液を
用いて調製した人体用の酸素運搬体にある。
人体組織または器官への酸素の運搬を改善したい全ての
場合、例えば大量出血の場合（代用血液として）、各種
の血管抵抗が生じた場合（赤血球よりも小さい酸素運搬
体として）あるいは代用血液を用いてシャントを作らな
ければならない血管形成術の場合の酸素運搬体として人
体の治療分野で利用することができる。従って、本発明
のさらに他の対象は、本発明の誘導体またはその溶液を
用いて調製した人体用の酸素運搬体にある。
【００１７】以下、図１〜５を参照して、Ｎ’−エチル
−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
クロロハイドレート（ＥＤＣＩ）の存在下で、ベンゼン
ヘキサカルボキシレート（ＢＨＣ）とベンゼンテトラカ
ルボキシレート（ＢＴＣ）とをヘモグロビンに共有カッ
プリングさせた本発明の実施例を詳細に説明する。
−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
クロロハイドレート（ＥＤＣＩ）の存在下で、ベンゼン
ヘキサカルボキシレート（ＢＨＣ）とベンゼンテトラカ
ルボキシレート（ＢＴＣ）とをヘモグロビンに共有カッ
プリングさせた本発明の実施例を詳細に説明する。
【００１８】図１は、未変成ヘモグロビンがダイマーに
解離することを示す、セファクリル(Sephacryl) Ｓ−10
0 ゲルを用いたサイズ排除クロマトグラフィーの結果を
示しており、実線のピークはテトラマーに相当し（0.05
Ｍリン酸バッファー）、テトラマーよりも後に見られる
破線のピークはダイマーに相当する（１Ｍ塩化マグネシ
ウム）。検出波長は 254 nm である。図２は、リン酸を
溶出液としたゲル濾過（ＴＳＫ Ｇ4000 ＳＷ）で得られ
る本発明の誘導体の代表的な溶出曲線 (クロマトグラ
ム) である。矢印は未変成へモグロビンおよびベンゼン
ポリカルボン酸（ＢＨＣおよびＢＴＣ）の溶出位置を示
している。検出波長 254 nm である。図３は、カチオン
交換カラム Mono Ｓで誘導体４（実施例４、表１）を溶
出した時の溶出曲線である。検出波長は 415 nm であ
る。図４と図５は、実施例４（表１）と実施例７（表
２）で得られた物質を MgCl2を溶出液としてセファクリ
ル(Sephacryl) Ｓ−100 でゲル濾過して得られた溶出曲
線である。検出波長は 254 nm である。
解離することを示す、セファクリル(Sephacryl) Ｓ−10
0 ゲルを用いたサイズ排除クロマトグラフィーの結果を
示しており、実線のピークはテトラマーに相当し（0.05
Ｍリン酸バッファー）、テトラマーよりも後に見られる
破線のピークはダイマーに相当する（１Ｍ塩化マグネシ
ウム）。検出波長は 254 nm である。図２は、リン酸を
溶出液としたゲル濾過（ＴＳＫ Ｇ4000 ＳＷ）で得られ
る本発明の誘導体の代表的な溶出曲線 (クロマトグラ
ム) である。矢印は未変成へモグロビンおよびベンゼン
ポリカルボン酸（ＢＨＣおよびＢＴＣ）の溶出位置を示
している。検出波長 254 nm である。図３は、カチオン
交換カラム Mono Ｓで誘導体４（実施例４、表１）を溶
出した時の溶出曲線である。検出波長は 415 nm であ
る。図４と図５は、実施例４（表１）と実施例７（表
２）で得られた物質を MgCl2を溶出液としてセファクリ
ル(Sephacryl) Ｓ−100 でゲル濾過して得られた溶出曲
線である。検出波長は 254 nm である。
【００１９】実施例で用いたヘモグロビン誘導体の分析
方法は以下の通りである。 (1) サイズ排除クロマトグラフィーではＴＳＫ Ｇ4000
ＳＷカラム(30cm)(Touzart and Matignon 社製、フラン
ス）を使用し、0.05Ｍのリン酸バッファー(pH 7.2)で
0.7ml／分で溶出して、変成ヘモグロビンのサイズ（特
に分子間架橋がないことを確認するため) を確認し且つ
ベンゼンポリカルボン酸の残留がないことを確認する。 (2) イオン交換クロマトグラフィーでは Mono Ｓカラム
(25cm)(Pharmacia製、スウェーデン）を用い、10ｍＭの
マロン酸バッファー(pH5.7) に０から0.3 ＭのLiCl濃度
勾配を付けて溶出し、未変成ヘモグロビンテトラマーの
比率を調べる（流速 2.5ml／分）。 (3) セファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 ゲル（1.6 ×40
cm）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーでは１Ｍの
MgCl2 を含む 0.1％のトリスバッファー(pH7.0)で50ml
／時で溶出して、変成ヘモグロビンのダイマーへの解離
を定量する。図１に示すように、この条件下では未変成
ヘモグロビンは完全にαβダイマーに解離する。 (4) Ｐ50（ヘモグロビンの50％が酸素と結合する時の酸
素分圧）の測定は0.05Ｍのトリスバッファー(pH7.2）で
25℃で行う。
方法は以下の通りである。 (1) サイズ排除クロマトグラフィーではＴＳＫ Ｇ4000
ＳＷカラム(30cm)(Touzart and Matignon 社製、フラン
ス）を使用し、0.05Ｍのリン酸バッファー(pH 7.2)で
0.7ml／分で溶出して、変成ヘモグロビンのサイズ（特
に分子間架橋がないことを確認するため) を確認し且つ
ベンゼンポリカルボン酸の残留がないことを確認する。 (2) イオン交換クロマトグラフィーでは Mono Ｓカラム
(25cm)(Pharmacia製、スウェーデン）を用い、10ｍＭの
マロン酸バッファー(pH5.7) に０から0.3 ＭのLiCl濃度
勾配を付けて溶出し、未変成ヘモグロビンテトラマーの
比率を調べる（流速 2.5ml／分）。 (3) セファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 ゲル（1.6 ×40
cm）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーでは１Ｍの
MgCl2 を含む 0.1％のトリスバッファー(pH7.0)で50ml
／時で溶出して、変成ヘモグロビンのダイマーへの解離
を定量する。図１に示すように、この条件下では未変成
ヘモグロビンは完全にαβダイマーに解離する。 (4) Ｐ50（ヘモグロビンの50％が酸素と結合する時の酸
素分圧）の測定は0.05Ｍのトリスバッファー(pH7.2）で
25℃で行う。
【００２０】
【実施例】実施例１〜５ （表１） 濃度 1.4ｍＭの自然に酸素と結合したヒトヘモグロビン
の溶液10mlに、予め0.1Ｍの水酸化ナトリウムを用いてp
H 5.8とした濃度7.8ｍＭのＢＨＣ水溶液 5.5ml（実施例
１、２および４）または 9.25ml(実施例３および５）を
添加する。この混合溶液のpHを 0.1Ｍの塩酸を用いて
6.5にし、蒸留水を用いて最終容積を30mlにする。次い
で、11mg（実施例１）、16.5mg（実施例２および３）ま
たは22mg（実施例４および５）のＥＤＣＩを攪拌しなが
ら加える。20℃で２時間反応を継続すると誘導体（架橋
ヘモグロビン）１〜５を得る。
の溶液10mlに、予め0.1Ｍの水酸化ナトリウムを用いてp
H 5.8とした濃度7.8ｍＭのＢＨＣ水溶液 5.5ml（実施例
１、２および４）または 9.25ml(実施例３および５）を
添加する。この混合溶液のpHを 0.1Ｍの塩酸を用いて
6.5にし、蒸留水を用いて最終容積を30mlにする。次い
で、11mg（実施例１）、16.5mg（実施例２および３）ま
たは22mg（実施例４および５）のＥＤＣＩを攪拌しなが
ら加える。20℃で２時間反応を継続すると誘導体（架橋
ヘモグロビン）１〜５を得る。
【００２１】実施例６（表１） 上記実施例と同様に操作するが、ヘモグロビン溶液は10
ml(1.4ｍＭ）とし、0.1 Ｍ−NaCl溶液を用いて調製した
ＢＨＣ溶液 5.5ml(7.8ｍＭ）と、ＥＤＣＩは22mg用い
た。溶液のpHを 0.1Ｍ−ＨClを用いて 6.5とし、最終濃
度を 0.1Ｍにするために塩化ナトリウム溶液を用いて最
終容積を30mlにする。誘導体（架橋ヘモグロビン）６を
得る。
ml(1.4ｍＭ）とし、0.1 Ｍ−NaCl溶液を用いて調製した
ＢＨＣ溶液 5.5ml(7.8ｍＭ）と、ＥＤＣＩは22mg用い
た。溶液のpHを 0.1Ｍ−ＨClを用いて 6.5とし、最終濃
度を 0.1Ｍにするために塩化ナトリウム溶液を用いて最
終容積を30mlにする。誘導体（架橋ヘモグロビン）６を
得る。
【００２２】実施例７〜９（表２） 濃度 1.4ｍＭのオキシヘモグロビン溶液10mlに、予め
0.1Ｍの水酸化ナトリウムを用いて pH 5.8 にした濃度1
5ｍＭのＢＴＣ水溶液それぞれ 4.7ml、 9.4ml、18.8ml
添加する。この混合液のpHを 0.1Ｍの塩酸を用いて 6.5
とし、蒸留水で最終容積を30mlにする。攪拌しながら、
ＥＤＣＩを各々22、44および88mg添加し、20℃で２時間
反応を継続すると誘導体（架橋ヘモグロビン）７、８お
よび９を得る。
0.1Ｍの水酸化ナトリウムを用いて pH 5.8 にした濃度1
5ｍＭのＢＴＣ水溶液それぞれ 4.7ml、 9.4ml、18.8ml
添加する。この混合液のpHを 0.1Ｍの塩酸を用いて 6.5
とし、蒸留水で最終容積を30mlにする。攪拌しながら、
ＥＤＣＩを各々22、44および88mg添加し、20℃で２時間
反応を継続すると誘導体（架橋ヘモグロビン）７、８お
よび９を得る。
【００２３】実施例10〜20（表２） 実施例７〜９と同じ操作を行うが、ＢＴＣ水溶液の量を
各々18.8ml, 4.7ml,4.7mlとし、ＥＤＣＩの量を各々6
6、44、88mgにする。誘導体（架橋ヘモグロビン）10、1
1および12を得る。
各々18.8ml, 4.7ml,4.7mlとし、ＥＤＣＩの量を各々6
6、44、88mgにする。誘導体（架橋ヘモグロビン）10、1
1および12を得る。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】 (注) (a) Mono S(カチオン交換）で得られたクロマトグラム
で求めた％。 (b) 1M-MgCl2媒体でセファクリル S-100を用いたクロマ
トグラムで求めた％。 (c) 温度25℃、pH 7.2の0.05Ｍトリスバッファー中で測
定。同一条件で測定した未変成ヘモグロビンのＰ50は 5
00Paであり、 DPGの存在下ではＰ50の最大値は1330Paで
ある。 (d) 本発明による架橋ヘモグロビン分子と、ポリカルボ
キシル分子が架橋を形成せずに結合しているヘモグロビ
ン分子（例えば蛋白の外側に結合しているもの）とを含
む；(e) ＝ 100−(a) 。 Hb4 ＝常にテトラマーの形で存在するヘモグロビン（セ
ファクリル S-100を用いたクロマトグラフ−図４に見ら
れるように、MgCl2 のような解離媒体中でもテトラマー
の形で存在する）。
で求めた％。 (b) 1M-MgCl2媒体でセファクリル S-100を用いたクロマ
トグラムで求めた％。 (c) 温度25℃、pH 7.2の0.05Ｍトリスバッファー中で測
定。同一条件で測定した未変成ヘモグロビンのＰ50は 5
00Paであり、 DPGの存在下ではＰ50の最大値は1330Paで
ある。 (d) 本発明による架橋ヘモグロビン分子と、ポリカルボ
キシル分子が架橋を形成せずに結合しているヘモグロビ
ン分子（例えば蛋白の外側に結合しているもの）とを含
む；(e) ＝ 100−(a) 。 Hb4 ＝常にテトラマーの形で存在するヘモグロビン（セ
ファクリル S-100を用いたクロマトグラフ−図４に見ら
れるように、MgCl2 のような解離媒体中でもテトラマー
の形で存在する）。
【００２６】各実施例化合物を解析する際には架橋率と
誘導体のＰ50値とを同時に考慮しなければならない。適
当な溶液はＰ50値が少なくとも1000で架橋ヘモグロビン
を少なくとも50％（80％含むものは非常に好ましい）含
む必要がある。
誘導体のＰ50値とを同時に考慮しなければならない。適
当な溶液はＰ50値が少なくとも1000で架橋ヘモグロビン
を少なくとも50％（80％含むものは非常に好ましい）含
む必要がある。
【００２７】ポリカルボキシルベンゼンで得られる結果
にバラつきがあることから、反応条件、特にポリカルボ
キシル分子／Hbのモル比およびＥＤＣＩ／Hbのモル比
（ＥＤＣＩは共有結合を生じさせる役目をする）が重要
性であり、場合によっては、塩化ナトリウムの存在（実
施例６）が重要であるということが分かる。各ポリカル
ボキシル分子に対する最適条件は当業者が容易に見出す
ことができる。前記実施例では、実施例４、６および12
が非常に満足できるものであり、少し劣るのは実施例２
である。
にバラつきがあることから、反応条件、特にポリカルボ
キシル分子／Hbのモル比およびＥＤＣＩ／Hbのモル比
（ＥＤＣＩは共有結合を生じさせる役目をする）が重要
性であり、場合によっては、塩化ナトリウムの存在（実
施例６）が重要であるということが分かる。各ポリカル
ボキシル分子に対する最適条件は当業者が容易に見出す
ことができる。前記実施例では、実施例４、６および12
が非常に満足できるものであり、少し劣るのは実施例２
である。
【００２８】実施例４に基づく図３から、ＢＨＣとのカ
ップリング後に複数の生成物が観察される。これらの生
成物は互いに異なる酸性度を有している（アニオン交換
カラムにおいて未変成のテトラマーよりも早く溶出する
分子）。実施例４での未変成ヘモグロビンの割合は20％
である。変成生成物の酸性度の大小は、分子に結合した
ＢＨＣの酸性残留物の数に依存する。
ップリング後に複数の生成物が観察される。これらの生
成物は互いに異なる酸性度を有している（アニオン交換
カラムにおいて未変成のテトラマーよりも早く溶出する
分子）。実施例４での未変成ヘモグロビンの割合は20％
である。変成生成物の酸性度の大小は、分子に結合した
ＢＨＣの酸性残留物の数に依存する。
【００２９】図４と図５は実施例４（架橋率80％、Ｐ50
＝1200）と実施例７（架橋率13％、Ｐ50＝2025）での塩
化マグネシウム媒体を用いたゲル濾過の溶出曲線を示し
ている。これらの結果は架橋テトラマーとダイマーとの
比率を明確に示している（図１に示すように、塩化マグ
ネシウム媒体中ではヘモグロビンはダイマーへ完全に解
離する）。
＝1200）と実施例７（架橋率13％、Ｐ50＝2025）での塩
化マグネシウム媒体を用いたゲル濾過の溶出曲線を示し
ている。これらの結果は架橋テトラマーとダイマーとの
比率を明確に示している（図１に示すように、塩化マグ
ネシウム媒体中ではヘモグロビンはダイマーへ完全に解
離する）。
【００３０】誘導体１〜12間のサイズ分布および未変成
のヘモグロビンに対するサイズ分布を検討した。図２の
クロマトグラムは未変成ヘモグロビンと一致した単一の
ピークを示す。このことは、ヘモグロビン間に分子間架
橋がないという極めて結果を示している。しかも、ＢＨ
ＣおよびＢＴＣの溶出位置にピークは全く見られない。
のヘモグロビンに対するサイズ分布を検討した。図２の
クロマトグラムは未変成ヘモグロビンと一致した単一の
ピークを示す。このことは、ヘモグロビン間に分子間架
橋がないという極めて結果を示している。しかも、ＢＨ
ＣおよびＢＴＣの溶出位置にピークは全く見られない。
【００３１】本発明の他の重要な利点はオキシヘモグロ
ビンに適用できるという点にある。従って、取り扱いが
極めて容易である。デオキシヘモグロビンを用いた場合
でも当然同じ結果が得られる。実施例１〜12ではＥＤＣ
Ｉの存在下で共有カップリングを行ったが、ペプチド合
成で通常使用されている他のカップリング法を採用する
ことも可能である。
ビンに適用できるという点にある。従って、取り扱いが
極めて容易である。デオキシヘモグロビンを用いた場合
でも当然同じ結果が得られる。実施例１〜12ではＥＤＣ
Ｉの存在下で共有カップリングを行ったが、ペプチド合
成で通常使用されている他のカップリング法を採用する
ことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 未変成ヘモグロビンがダイマーに解離するこ
とを示す、セファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 ゲルを用
いたサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム。
とを示す、セファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 ゲルを用
いたサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム。
【図２】 リン酸を溶出液としたゲル濾過（ＴＳＫ Ｇ
G4000 ＳＷ）で得られる本発明の誘導体の溶出曲線 (ク
ロマトグラム) 。
G4000 ＳＷ）で得られる本発明の誘導体の溶出曲線 (ク
ロマトグラム) 。
【図３】 カチオン交換カラム Mono Ｓで誘導体４（実
施例４、表１）を溶出した時の溶出曲線。
施例４、表１）を溶出した時の溶出曲線。
【図４】 実施例４（表１）で得られた物質を MgCl2を
溶出液としてセファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 でゲル
濾過して得られた溶出曲線。
溶出液としてセファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 でゲル
濾過して得られた溶出曲線。
【図５】 実施例７（表２）で得られた物質を MgCl2を
溶出液としてセファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 でゲル
濾過して得られた溶出曲線。
溶出液としてセファクリル(Sephacryl) Ｓ−100 でゲル
濾過して得られた溶出曲線。
フロントページの続き (72)発明者 ダニエル サッコ フランス国 54000 ナンシー ブルバー ル シャルル サンク 11 (72)発明者 ミシェル グランジョルジュ フランス国 69670 ヴォーニュレー リ ュ ドュ ルクレ 12
Claims (18)
- 【請求項１】 ヘモグロビンテトラマーと少なくとも４
つの−ＣＯＯ- 基を有するポリカルボキシル化合物とを
共有カップリングさせて得られるヒトヘモグロビンテト
ラマーの誘導体であって、上記ポリカルボキシル化合物
はヘモグロビンの２つのダイマー間を内部架橋させ且つ
ヘモグロビンの天然のアロステリックエフェクターが存
在しない状態でも生体内で上記の結合を利用できるよう
な酸素親和性をヘモグロビンに与えるものであることを
特徴とする誘導体。 - 【請求項２】 ポリカルボキシル化合物が４〜６個の−
ＣＯＯ- 基を有する請求項１に記載のヘモグロビン誘導
体。 - 【請求項３】 ポリカルボキシル化合物が飽和または不
飽和の単環状分子あるいは主鎖に４〜６個の炭素原子を
有する直鎖または側鎖を有する分子である請求項１また
は２に記載のヘモグロビン誘導体。 - 【請求項４】 単環状分子が複数のカルボキシル基を有
するベンゼンである請求項３に記載のヘモグロビン誘導
体。 - 【請求項５】 ポリカルボキシル化合物が６つのカルボ
キシル基を有するベンゼンである請求項４に記載のヘモ
グロビン誘導体。 - 【請求項６】 ポリカルボキシル化合物が４つのカルボ
キシル基を有するベンゼンである請求項４に記載のヘモ
グロビン誘導体。 - 【請求項７】 ポリカルボキシル化合物が複数のカルボ
キシル基を有するシクロヘキサンである請求項３に記載
のヘモグロビン誘導体。 - 【請求項８】 少なくとも一部が請求項１〜７のいずれ
か一項に記載の誘導体で構成されるヒトヘモグロビンテ
トラマーをベースとした酸素運搬溶液。 - 【請求項９】 ヘモグロビン分子のテトラマー、好まし
くはオキシヘモグロビンと、請求項１〜７のいずれか一
項に記載のポリカルボキシル化合物とを、ヘモグロビン
分子の２つのダイマー間で架橋が形成されるような条件
下で、共有カップリングさせることを特徴とするヘモグ
ロビンテトラマー誘導体の合成方法。 - 【請求項１０】 カップリングを共有結合に適した試薬
の存在下で行う請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 上記試薬がＮ’−エチル−Ｎ−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドクロロハドレ
ート（ＥＤＣＩ）である請求項10に記載の方法。 - 【請求項１２】 架橋率が少なくとも約50％、好ましく
は約80％以上で、誘導体のＰ50値が約1000Pa以上、好ま
しくは約1300以上となるような条件下でカップリングを
行う請求項８〜10に記載の方法。 - 【請求項１３】 ヘモグロビンとベンゼンヘキサカルボ
キシレート（ＢＨＣ）との共有カップリングを、ＢＨＣ
／Hbのモル比およびＥＤＣＩ／Hbのモル比を各々３およ
び８または５および６の付近にして行う請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１４】 ヘモグロビンとベンゼンテトラカルボ
キシレート（ＢＴＣ）との共有カップリングを、ＢＴＣ
／HbおよびＥＤＣＩ／Hbのモル比を各々約５および32の
付近にして行う請求項９に記載の方法。 - 【請求項１５】 塩化ナトリウムの存在下でカップリン
グを行う請求項９〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項９〜15のいずれか一項に記載の
方法により得られる安定化されたヘモグロビンテトラマ
ー溶液。 - 【請求項１７】 Ｐ50値が1000Pa以上、好ましくは1300
以上であるヘモグロビン誘導体を50％、好ましくは80％
以上含む請求項16に記載の溶液。 - 【請求項１８】 請求項１〜８のいずれか一項に記載の
誘導体および請求項16または17に記載の溶液を用いて製
造したヒトの酸素運搬体。 【０００１】
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9110342A FR2680369B1 (fr) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | Derives d'hemoglobine humaine, leur procede de preparation, produits en derivant et utilisation de ces derives et produits. |
| FR9110342 | 1991-08-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05279392A true JPH05279392A (ja) | 1993-10-26 |
Family
ID=9416211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4239057A Withdrawn JPH05279392A (ja) | 1991-08-14 | 1992-08-14 | ヒトヘモグロビン誘導体と、その合成方法と、それによって得られる物質と、この物質および誘導体の利用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5514780A (ja) |
| EP (1) | EP0528716A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05279392A (ja) |
| AU (1) | AU661325B2 (ja) |
| CA (1) | CA2076064A1 (ja) |
| FR (1) | FR2680369B1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994021682A1 (en) * | 1993-03-16 | 1994-09-29 | Hemosol Inc. | Selective crosslinking of hemoglobins by oxidized, ring-opened saccharides |
| US6458762B1 (en) | 1994-03-28 | 2002-10-01 | Baxter International, Inc. | Therapeutic use of hemoglobin for preserving tissue viability and reducing restenosis |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2600894B1 (fr) * | 1986-07-02 | 1989-01-13 | Centre Nat Rech Scient | Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications |
| FR2630329B1 (fr) * | 1988-04-20 | 1991-07-05 | Merieux Inst | Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications |
| US5349054A (en) * | 1991-08-15 | 1994-09-20 | Duke University | Activated benzenepentacarboxylate-crosslinked low oxygen affinity hemoglobin |
-
1991
- 1991-08-14 FR FR9110342A patent/FR2680369B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-08-05 EP EP19920402237 patent/EP0528716A1/fr not_active Withdrawn
- 1992-08-10 US US07/926,673 patent/US5514780A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-08-10 AU AU20915/92A patent/AU661325B2/en not_active Ceased
- 1992-08-13 CA CA002076064A patent/CA2076064A1/en not_active Abandoned
- 1992-08-14 JP JP4239057A patent/JPH05279392A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2680369A1 (fr) | 1993-02-19 |
| AU661325B2 (en) | 1995-07-20 |
| AU2091592A (en) | 1993-02-18 |
| FR2680369B1 (fr) | 1993-11-05 |
| CA2076064A1 (en) | 1993-02-15 |
| EP0528716A1 (fr) | 1993-02-24 |
| US5514780A (en) | 1996-05-07 |
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|---|---|---|---|
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