JPH05276936A - セルプリナ ハイオディセンテリアワクチン - Google Patents

セルプリナ ハイオディセンテリアワクチン

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JPH05276936A
JPH05276936A JP4355540A JP35554092A JPH05276936A JP H05276936 A JPH05276936 A JP H05276936A JP 4355540 A JP4355540 A JP 4355540A JP 35554092 A JP35554092 A JP 35554092A JP H05276936 A JPH05276936 A JP H05276936A
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hemolysin
serpulina
hyodysenteriae
ile
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Huurne Agnes Ter
テル ヒュルン アグネス
Susie Jane Muir
ジェーン ミューア スージー
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Duphar International Research BV
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 セルプリナ ハイオディセンテリア感染のた
めのワクチン及びそのようなワクチンの調製のための組
換えポリヌクレオチドに関する。 【構成】 生物学的に活性な溶血素の生成が遺伝子工学
技法により停止されるセルプリナ ハイオディセンテリ
ア変異体及びその変異体を含むワクチンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、セルプリナ（トレポネーマ）ハ
イオディセンテリア感染のためのワクチン及びそのよう
なワクチンの調製のための組換えポリヌクレオチド及び
セルプリナ ハイオディセンテリア変異体に関する。
【０００２】セルプリナ ハイオディセンテリア、すな
わちブタ赤痢の主要な病因物質は、ブタの大腸に見出さ
れる嫌気性β−溶血性スピロヘータ（spirochete）であ
る。この疾病は、粘膜出血性下痢により特徴づけられ
る。これは管腔性上皮内層及びリーベルキューン陰窩の
集中的な表面壊死に関連すると思われる。
【０００３】この疾病は、脱水、体重の損失及び結果的
に死を導びく。この病原体は、病気の病因において不可
欠な役割を演じると思われる溶血素を分泌する。
【０００４】セルプリナ ハイオディセンテリアは、血
液寒天プレート上でのその溶血性パターンにより、又は
ブタ又はマウスにおける腸病原性を試験することによっ
て非病原性の弱いβ−溶血性セルプリナ イノセンス
（Serpulina innocens）から分化される。
【０００５】インビボにおいては、急性疾患の間、現在
までは、溶血素により誘発される免疫原性応答は血清学
的に示されていない。
【０００６】スピロヘータ感染の病因を引き起こすため
の遺伝的アプローチは、スピロヘータ細胞中への遺伝子
の導入を可能にする遺伝子交換システムが不在であるの
で、妨げられて来た。形質転換又は一般的なトランスダ
クション方法はこれまで記載されたことはない。
【０００７】本発明によれば、生物学的に活性な溶血素
の生成を欠いている変異体セルプリナ ハイオディセン
テリアを含むワクチンが調製され得る。
【０００８】セルプリナ ハイオディセンテリアが生物
学的に活性な溶血素の生成において欠陥にされる突然変
異は、遺伝子工学的技法により確立される。そのような
突然変異は、たとえば溶血素及び／又は溶血素の生成を
制御するヌクレオチド配列をコードする一部の又は完全
な遺伝子の欠失、又は溶血素及び／又は溶血素の生成を
制御するヌクレオチド配列をコードする遺伝子中への外
部のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの挿入、又は前
記欠失及び挿入の組合せを含んで成る。前記挿入に使用
される外部ポリヌクレオチドは、セルプリナ ハイオデ
ィセンテリア又は他の生物由来の天然のポリヌクレオチ
ド フラグメント又は天然でないポリヌクレオチドのい
づれかであり得る。外部ポリヌクレオチドは、トレポネ
ーマにより発現され、そして変異体の選択において有用
なタンパク質である外来性タンパク質をコードし、そし
て／又はセルプリナ ハイオディセンテリア又は他の生
物のための特徴的な及びそれに対する免疫性を提供する
タンパク質であり得る。他方、外部ヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドは、溶血素遺伝子におけるフレームシフ
トを引き起こすように単に作用し、従って生物学的に活
性な溶血素の生成の停止をもたらす。
【０００９】溶血素生成の停止をもたらすセルプリナ
ハイオディセンテリアにおける変異を確立することに適
用され得る遺伝子工学的方法は、他の生物における類似
するアプローチのために当業界においては既知である。
【００１０】挿入は、たとえばセルプリナ ハイオディ
センテリアの溶血素をコードする遺伝子をまず単離し、
前記遺伝子のコード部分又は制御部分の適切な領域中に
外部ヌクレオチド又はポリヌクレオチドを挿入し、そし
て前記変異誘発された遺伝子によりセルプリナ ハイオ
ディセンテリアを形質転換し、それによって、セルプリ
ナ ハイオディセンテリアの染色体と単離された遺伝子
の少なくとも部との組換えを確立することによって確立
され得る。その後、溶血素生成が欠陥にされるセルプリ
ナ ハイオディセンテリア細菌が選択される。
【００１１】好ましくは、溶血素を有する自己複製構造
体（プラスミド、ファージ、等）が使用される。外部ヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドの挿入の前、溶血素を
コードする遺伝子は、好ましくは構造体においてユニー
クである制限部位のための特異性を有する制限エンドヌ
クレアーゼにより処理される。溶血素遺伝子中に効果的
に連結されるためには、その挿入体は、相補的であり、
又は挿入の部位で溶血素遺伝子における２つの末端に対
して相補的にされる３′及び／又は５′末端を有すべき
である。セルプリナ ハイオディセンテリアの形質転換
は、エレクトロポレーションにより確立され得る。
【００１２】本発明の遺伝的に構築されたセルプリナ
ハイオディセンテリアは、敏感な個人、特にブタにおけ
るセルプリナ感染の防御又は攻撃において有用である。
この目的のためには、適切なキャリヤー、たとえば緩衝
液又は細胞の培養培地に生存形又は不活性化された形で
前記遺伝的に構築されたセルプリナの免疫学的に適切な
量及び場合によっては、１又は複数の保存成分を含むワ
クチンが使用される。貯蔵においてより安定したワクチ
ン形を調製するためには、セルプリナは、場合によって
は１又は複数の安定化成分の存在下で凍結乾燥され得
る。使用の前、その凍結乾燥されたワクチンは、キャリ
ヤー、たとえば水又は緩衝液の添加により再構成され得
る。
【００１３】ワクチンはさらに、ブタのための他の免疫
原、たとえばウィルス、たとえば狂犬病ウィルス、イン
フルエンザウィルス、侵入性胃腸炎ウィルス、パルボウ
ィルス、ブタ経皮性下痢ウィルス、ブタコレラウィルス
の特徴的な免疫原性物質又はマイコプラスマ、たとえば
マイコプラスマ ハイオプネウモニアエ（Mycoplasmahy
poneumoniae）及びマイコプラスマ ライオリニス（Myc
oplasma lyorhinis）の特徴的な免疫原性物質、又は細
菌、Ｅ．コリ、ボルダテラ ブロンキセプチカ(Bordete
lla bronchiseptica）、レプトスピラ（Leptospira）、
アクチノバシラス プルウロプネウモニアエ(Actinobac
cilus pleuropneumoniae）、パステウレラ ムルトシダ
(Pusteurella multocida）、ストレプトコーカス スイ
ス（Streptococcus suis）の特徴的な免疫原性材料を含
むことができる。
【００１４】
【実施例】例１ セルプリナ ハイオディセンテリアの溶血性遺伝子のク
ローニング材料及び方法細菌及び培養条件 １２４回の連続的継代を通して弱毒化されたセルプリナ
ハイオディセンテリア株Ｂ２０４（血清型２）を使用
した。そのセルプリナを、Halter and Joens (1988；In
fec. Immun. 56, 3152〜3156）により記載されるように
して、５％ＦＣＳ（Flow）により補充されたトリプチカ
ーゼ ダイズ培地(Difco Laboratories,Detroit, Mic
h., USA）において増殖した。細菌細胞ペレットを、Ｔ
Ｅにより洗浄し、そして−７０℃で凍結した。プラスミ
ドｐＵＣ１９及びｐｈａｒｇｅ−ｍｉｄｓ ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ｐＫＳ＋及びｐＳＫ＋(Stratageme Clon
ingSystems, La Jolla, California, USA）を、クロー
ニング方法のために用いた。Ｅ．コリ(E. coli) Ｋ１２
株ＤＨ５−α（Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA）
を、それらのベクターのための宿主として使用した。
【００１５】セルプリナ ハイオディセンテリア染色体
ＤＮＡの調製 分子品種の化学薬品及び酵素を、Sigma Chemical Co.
(St. Louis, Mo. USA）から得た。１ｌの培養物からの
凍結された細菌細胞ペレットを、１００ｍモル／ｌのト
リス−ＨＣｌ，pH８．０，１００ｍモル／ｌのＥＤＴ
Ａ，１５０ｍモル／ｌのＮａＣｌ及び１０mg／mlのリゾ
チームを含む緩衝液２５mlに融解した。３７℃での１時
間のインキュベーションの後、０．５mlのＲＮＡアーゼ
Ａを細胞に添加し、次にそれを７０℃でさらに１５分間
インキュベートした。細胞溶解を、３０％Ｓａｒｋｏｓ
ｙｌ２．５mlの添加、軽い混合、及び７０℃で２０分間
のインキュベーション、続く３７℃で１時間のインキュ
ベーションにより完結した。予備消化されたプロナーゼ
（１０mg／mlの最終濃度）を添加し、そしてインキュベ
ーションを３７℃で４時間続けた。溶解物を透析管に移
し、そして６ｌのＴＥ（１０ｍモル／ｌのトリス−ＨＣ
ｌ），１ｍモル／ｌのＥＤＴＡ，pH８．０において一晩
透析した。次にＤＮＡをＴＥ飽和フェノールにより一
度、軽く抽出し、クロロホルム：イソアミルアルフール
（２４：１）により抽出し、ＴＥ中で６時間透析し、そ
してエタノール沈殿せしめた。染色体ＤＮＡを１mg／ml
の濃度でＴＥに再懸濁した。この態様で調製されたＤＮ
Ａを、ライブラリー構成及びサザンブロット分析のため
に使用した。
【００１６】セルプリナ ハイオディセンテリアゲノム
ライブラリィーの構成 制限酵素、ウシ腸オスファターゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ、ＲＮＡアーゼＡ、及びクレノウフラグメントを、Bo
ehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, In,
USA)から得た。すべての酵素は、製造業者により特定さ
れた条件下で使用した。標準のクローニング方法（Mani
atis, T.E.F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molec
ular Cloning：a laborarory manual. Cold Spring Har
bor Laboratory Cold Spring Harbor, N.Y., USA) に従
って、すべてのＤＮＡ操作を行なった。セルプリナ ハ
イオディセンテリアＤＮＡを制限酵素Ｍｂｏｌにより消
化し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにより、ＢａｍＨＩ
制限された脱リン酸化ｐＵＣ１９に連結した。Ｅ．コリ
ＤＨ５−α細胞をその連結混合物により形質転換し、そ
して組換え体を溶血素生成についてスクリーンした。
【００１７】溶血性クローンのスクリーニング 組換え体を、４％の脱フィブリン化された羊赤血球細胞
（ＳＲＢＣ)(ColoradoSerum Co., Denver, Co., USA）
及び１００μｇ／mlのカルベニシリン（ＴＳＡ血液プレ
ート）を含むトリピカーゼ ダイス寒天上にプレートし
た。プレートを３７℃で２４〜３６時間インキュベート
し、溶血性コロニーを検出した。ｐＳＭＬ２と命名され
た単一の溶血性クローンを追加の分析のために選択し
た。このクローンから、サブクローンを構成した。
【００１８】サザンブロット 染色体ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＶにより消化し、
０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動し、そしてナ
イロン膜に移した。ｐＪＢＡからの１．５Kbp のＳｃａ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメント、すなわち活性溶血素を含
むｐＳＭＬ２の最少のサブクローンを、32Ｐによりラン
ダムプライマーラベルした（Feinborg, A.P., and B. V
ogelstein. 1983. A technique for radiolabelling DN
A restriction endonuclease fragments to high speci
ficity ; Anal. Biochem. 132 : ６〜13）。膜のプレハ
イブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗
浄は記載されるように実質的に６０℃で行なわれた（Ma
niatis, T.,E.F. Fritsch and J. Sambrook. Molecular
Cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., USA）。膜を
Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに−７０℃で
２〜１８時間、暴露した。
【００１９】組換え溶血素の浸透性開放 組換え溶血素を特徴づけるために、Ｅ．コリＤＨ５α
（ｐＪＢＡ）細胞を、Heppel (Heppel, L.A. 1967. Sel
ectiue release of onzynes from bacteria. Science 1
56：1451〜1455）により記載されるようにして浸透ショ
ックにゆだねた。
【００２０】溶血素アッセイ 浸透ショック上清液のアリコートを、１４０ｍモル／ｌ
のＮａＣｌの最終濃度に調整し、そして羊赤血球細胞
（ＳＲＢＣ）に添加し、それを洗浄し、そして１４０ｍ
モル／ｌのＮａＣｌに１０％で再懸濁した。その混合物
を３７℃で１時間インキュベートし、そして赤血球細胞
からのヘモグロビン開放を、５４０nmでの上清液の光学
密度を読み取ることによって決定した。
【００２１】天然の生物からの溶血素の抽出 溶血素を、ＲＮＡコア抽出方法（Kent. K.A., R.M. Lem
eke, and R.J. Jysons. 1988. Production, Purificati
on and molecular weight determination of the haemo
lysin of Serpulina hyodysenteriae. J. Mod. Microbi
ol. 27 : 215〜224)を用いてＢ２０４株から抽出し、そ
して濃縮した。
【００２２】細胞毒性アッセイ Ｅ．コリＤＨ５α（ｐＪＢＡ），ＤＨ５α（ｐＳＭＬ
５）及びＤＨ５α（ｐＵＣ１９）からの浸透ショック上
清液及びＲＮＡコアー溶血素をフィルター殺菌し、そし
て５×１０4 個のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞／ウェルに１：２〜１：１６０の２倍希釈とし
て添加した。細胞をＣＯ2 インキュベーターにおいて３
７℃で２４時間インキュベートし、そして細胞変性効果
（ＣＰＥ）について種々の時間で試験した。ＣＰＥを、
個々のウェルに溶血素を添加した後、１，１２及び２４
時間で、ＣＨＯ単層の直接的な眼での観察により決定し
た。
【００２３】ＤＮＡ配列決定 ｐＪＢＡにおける１．５Kbp のＳｃａＩ／ＢａｍＨＩ挿
入体をＭＢｍｐ１８及びＭＢｍｐ１９中にサブクローン
した。両株を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット(United Stat
e Biochemical, Cleveland, Ohio）を用いてデオキシヌ
クレオチド鎖終結により配列決定した。−４０Ｍ１３配
列決定プライマーを用いて、挿入の部位及び遺伝子の
３′及び５′領域での初めの１００個の塩基を確かめ
た。続いて、前の配列に基づいて、Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐ
ｌｕｓ ＤＮＡ合成機(Millipore Corp., Bedford, MA,
USA) 上で合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて完全な溶血素遺伝子を配列決定した。
【００２４】結果 溶血素遺伝子のクローニング プラスミド ベクターｐＵＣ１９を用いて、セルプリナ
ハイオディセンテリア株Ｂ２０４のライブラリィーを
調製した。溶血性クローンからのプラスミド、ｐＳＭＬ
２のＤＮＡはセルプリナ ハイオディセンテリアの５Kb
フラグメントを含んだ。ＥｃｏＲ１（Ｅ）サブクロー
ン、ｐＳＭＬ４は３．３Kbのフラグメントを含み、そし
て親プラスミドｐＳＭＬ２と同じように溶血性であっ
た。ＳｃａＩ／ＢａｍＨＩ（Ｓ：ＳｃａＩ）によるｐＳ
ＭＬ４の消化は、１．５Kbのフラグメントを生成し、こ
れは、ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ制限されたｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ｐｈａｇｅｍｉｄ ｐＫＳ＋又はｐＳＫ＋
中にサブクローンされる場合、プラスミドｐＪＢＡを生
成し、そしてそのプラスミドはｐＳＭＬ２又はｐＳＭＬ
４のいづれかと同じように溶血性であった。Ｅ．コリＪ
Ｍ１０５におけるプラスミドｐＪＢＡKSを、寄託番号第
５１２．９１号としてCentraalbureau voor Schimmelec
ultures at Baarn, The Netherlandに寄託した。
【００２５】溶血素の配列 溶血素遺伝子は、セルプリナの病原性及び非病原性株に
ついて報告されたように、ひじょうにアデノシン−及び
−チミジンに富んでいた（７５％)(Miao, R.M., A.H. H
ieldsteel, and D.L. Harris. 1970. Genetic of Trepo
nema : Characterization of Treponema hyodysenteria
e and its relationship to Treponemapallidum. Infe
c. Immun. 22 : 736〜739)。その配列は、配列番号１に
示される。
【００２６】例２ セルプリナ ハイオディセンテリア挿入変異体の調製材
料及び方法細菌株及びプラスミド セルプリナ ハイオディセンテリアＣ５（寄託番号ＣＢ
Ｓ８３７．９１としてCentraalbureau voor Schimmelcu
ltures at Baarn, the Netherland で１９９年１２月１
８日に寄託された）を、株Ｂ２０４について例１に記載
されているのと同じ条件下で培養した。ベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ（＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ（La Jolla, CA）から購入し、そしてＥ．コリとして
ＤＨ５α中で増殖せしめた。マウスの盲腸含有物を、前
記のようにして培地上にプレートした。
【００２７】耐カナマイシン性遺伝子を含む溶血素遺伝
子の構成 溶血素陰性変異体の構成のために、ユニークＢｇｌII部
位と共にセルプリナハイオディセンテリアＢ２０４の溶
血素遺伝子（さらにｔｌｙとして示される）を含む１．
５KbのＳｃａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを含むプラス
ミドｐＪＢＡKSを使用した。１．３Kbの耐カナマイシン
性ＧｅｎＢｌｏｃｋ（ＥｃｏＲＩ)(Pharmacia)を制限酵
素ＢａｍＨＩにより消化し、そしてＢｇｌII部位中に挿
入した。その得られたｐＪＢＡKS誘導体をｐＴｌｙ−と
命名した。
【００２８】エレクトロポレーション セルプリナ ハイオディセンテリアＣＳを、５％ウシ胎
児血清及び０．０５％のＲＮＡコアーにより補充された
２００mlのトリプチカーゼ ダイズブイヨン（ＴＳＢ）
において４２℃で嫌気性条件下で増殖せしめた。細胞を
遠心分離し、洗浄し、そして５０mlの氷冷却された１５
％グリセロール−２７２mMスクロースに収穫し、遠心分
離し、そして同じ培地において１０10個の細胞／mlに再
懸濁した。アリコートを凍結し、そして使用されるま
で、−８０℃で保持した。５０μｌの細胞懸濁液を５μ
ｇのＤＮＡと共に水において混合した。エレクトロポレ
ーションを、０．６KV，２５μＦ及び２００Ωで、０．
５６mmのギャップキュベット(Biotechnologies and Exp
erimental Research Inc., San Diego, CA) において、
パルスコントローラーを備えたＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎ
ｅ Ｐｕｌｓｅｒにより行なった。これは３．５〜４ms
の範囲の時間定数を導びく。細胞を１mlのＴＳＢに回収
し、そしてml当たり４００μｇのスペクチノマイシン及
び５％羊血液により補充されたトリプチカーゼ ダイズ
寒天プレート上に注いだ（ＴＳＡＢ＋）。嫌気性条件下
で４２℃での８〜１４時間の再生の後、細胞を収穫し、
３０又は１５０μｇ／mlのカナマイシンにより補充され
たＴＳＡＢ＋寒天プレート上にプレートし、そして嫌気
性条件下で４２℃で４日間増殖した。コロニーを減じら
れた溶血素についてスクリーンした。このエレクトロポ
レーション実験は２度行なわれた。
【００２９】ポリメラーゼ鎖反応 エレクトロポレーションの後に検出された、減じられた
溶血を有するコロニー、及び野生型（Ｗｔ）セルプリナ
ハイオディセンテリアＣ５を、ポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）によりスクリーンした。Ｔａｑポリメラーゼ
及びＴａｑポリメラーゼ緩衝液(Promega) によるＤＮＡ
の増幅を、ｐＪＢＡ配列番号１のヌクレオチド４７１〜
４８６及び１４４９〜１４３１に対応するプライマーに
より行なった。これは、ＢｇｌII部位を含む０．９８Kb
のｔｌｙ遺伝子の増幅された生成物をもたらした。Ｗｔ
Ｃ５のために、０．５μｇのＤＮＡを用いた。変異体の
コロニーを、殺菌したツマヨージにより触れ、そしてＰ
ＣＲ緩衝液に移した。その混合物を９５℃で３分間、予
備加熱した後、３５の増幅サイクルを、次のようにして
ＤＮＡ Ｉｎｃａｂａｔｏｒ Ｐｒｅｍで行なった：９
５℃で１分、４０℃で１分及び７２℃で２分。最終サイ
クルの後、混合物を７２℃で１０分間インキュベート
し、最後のポリメラーゼ反応を完結した。反応混合物を
前記のようにしてアガロースゲル電気泳動により分析し
た。
【００３０】ＤＮＡの単離及びサザンブロット分析 プラスミドＤＮＡを、Birnboim and Doly (Nucleic Aci
ds Research ７, 1513〜1523；1989）の方法によりＥ．
コリ及びセルプリナ ハイオディセンテリアから単離し
た。セルプリナ ハイオディセンテリアの染色体ＤＮＡ
をイソプロパノール沈殿及びフェノール抽出により単離
した。ＤＮＡを、供給者（ＢＲＬ）により示されるよう
にＥｃｏＲＶにより消化した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＫＳ（＋）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ
（＋）／耐カナマイシン性Ｇｅｎｂｌｏｃｋ構成体のＥ
ｃｏＲＩ消化物を対照として取った。Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ
（Amersham) 上でのハイブリダイゼーション及び洗浄を
前記のようにして行なった。ｐＪＢＡKS（Ｔｌｙプロー
ブ）の１．５KbＳｃａＩ／ＢａｍＨＩフラグメント、
１．３Kbの耐カナマイシン性Ｇｅｎｂｌｏｃｋ（Pharma
cia) (Ｋａｎａプローブ）及び完全ベクターＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ（ＢＳプローブ）を放射性ラベルし、そして
プローブとして使用した。
【００３１】マウスにおけるビルレンス試験 マウス挑戦研究を上記のようにして行なった。生後４週
目の雌のＯＦ−１マウス（Iffa Credo）を、調節された
条件下で維持した。飼料を、最初の挑戦の１４時間前に
除去し、そして４０時間、飼料を与えずに保持した。次
のセルプリナの対数相培養物０．５mlによる胃への管挿
入により２回の連続的用量（２４時間別れて）をマウス
に投与した：１０6 又は１０8 ＣＦＵセルプリナ ハイ
オディセンテリアＷｔＣ５，１０6 又は１０8 ＣＦＵセ
ルプリナ ハイオディセンテリアＣ５ｔｌｙ−又は１０
8 ＣＦＵセルプリナ イノセンス ＡＴＣＣ ２９７９
６。三匹の対照マウスを、０．５mlのＴＳＢにより接種
した。マウスを１２日後、検死し、盲腸におけるセルプ
リナ ハイオディセンテリア感染の次の徴候を評価し
た：カタル炎症、過剰管内粘液、水腫、充血及び萎縮。
盲腸含有物を培養し、セルプリナの分散を検出した。
【００３２】結果エレクトロポレーション ｐＴｌｙ構造体に関しての２つの別々の実験において、
減じられた溶血性を有する合計５つの耐カラマイシン性
コロニーを回収した。最初の実験においては、細胞が３
０μｇ／mlのみのカナマイシンを有するＴＳＡＢ＋プレ
ート上にプレートされる場合、多くの強い溶血性コロニ
ーの中から、たった１つの溶血性コロニー（ＭｕｔＩ）
を回収した。第２の実験においては、細胞が１５０μｇ
／mlのカナマイシンを有するＴＳＡＢ＋プレート上にプ
レートされる場合、減じられた溶血性を有する４つのコ
ロニー（ＭｕｔII−Ｖ）が見出された。
【００３３】ポリメラーゼ鎖反応 アガロースゲル電気泳動によるセルプリナ ハイオディ
センテリアＷｔＣ５及びＭｕｔＩ−ＭｕｔＶのＰＣＲ生
成物の分析に基づいて、ＷｔＣ５及びＭｕｔIVはたった
０．９８Kbのフラグメントを示し、これは、使用された
ｐＪＢＡのプライマーにより増幅されたｔｌｙ遺伝子の
フラグメントの予測される大きさであった。ＭｕｔＩ，
ＭｕｔII，ＭｕｔIII 及びＭｕｔＶは、２．２８Kbのフ
ラグメントを示した（ｔｌｙ遺伝子の０．９８Kb及びカ
ナマイシン遺伝子ブロックの１．３０Kb)(図１；キロ塩
基対（Kb）での分子サイズマーカーがこの図の右側に与
えられている）。
【００３４】ＤＮＡ単離及びサザンブロット分析 プラスミドＤＮＡは変異体ＭｕｔＩ−Ｖから単離され得
なかった。セルプリナハイオディセンテリアＷｔＣ５及
びＭｕｔＩ−Ｖの染色体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＶにより消
化し、ブロットし、そしてそれぞれＴｌｙプローブ、Ｋ
ａｎａプローブ及びＢＳプローブによりハイブリダイズ
した。株ＷｔＣ５においては、Ｔｌｙプローブは４．８
Kbのフラグメントとハイブリダイズした。ＭｕｔＩにお
いては、このプローブは６．１Kbのフラグメントとハイ
ブリダイズした（すなわち４．８Kb＋１．３Kbのカナマ
イシン遺伝子挿入)(図２，Ａ）。株ＷｔＣ５はＫａｎａ
プローブとハイブリダイズしなかった。ＭｕｔＩにおけ
る６．１KbのフラグメンがＫａｎａプローブとハイブリ
ダイズした（図２，Ｂ）。ＭｕｔＩもＷｔＣ５も、ＢＳ
プローブとハイブリダイズしなかった（図２，Ｃ）。
【００３５】マウスにおけるＭｕｔＩのビルレンス試験 ＯＦ−１マウスの６種のグループを、１０6 又は１０8
ＣＦＵのセルプリナハイオディセンテリアＷｔＣ５，１
０6 又は１０8 ＣＦＵのＭｕｔＩ，１０8 ＣＦＵのセル
プリナ イノセンス ＡＴＣＣ ２９７９６又はＴＳＢ
（対照）により挑戦せしめた。マウスを、盲腸の病変
（カタル炎症、過剰管内粘液、水腫、充血及び萎縮）及
びセルプリナによるコロニー化の評価のために１２日目
に殺害した。盲腸の評点は表１に示される。顕微鏡によ
る盲腸の病変を次のようにして評点を付与した：重度の
病変、３；中ぐらいの病変、２；弱い病変、１；病変な
し、０。ＭｕｔＩにより感染されたマウスは、セルプリ
ナ ハイオディセンテリアＷｔＣ５により感染されたマ
ウスにおいてよりも、顕微鏡による盲腸の病変に関して
は、重くなかった（両者とも接種量）。セルプリナ イ
ノセンスにより感染された又はＴＳＢにより接種された
マウスは、いづれの盲腸病変も示さなかった。陽性とし
て培養されたマウスの数がまた、表１に示される。セル
プリナ イノセンスにより感染されたグループにおいて
は、マウスは陽性に培養しなかった。
【００３６】
【表１】
【００３７】ａ：セルプリナ ハイオディセンテリアＣ
５野生型 ｂ：セルプリナ ハイオディセンテリアＣ５の溶血素ｔ
ｌｙ−変異体 ｃ：セルプリナ イノセンスAmerican Type Cultune Co
llection (ATCC)29796 ｄ：ＴＳＢ＝トリプチカーゼ ダイズブイヨン ｅ：雌のＳＰＦ ＯＦ−１マウス（iffa credo) ｆ：ｎ＝グループ当たりのマウスの数 ｇ：盲腸の評点：顕微鏡による盲腸の病変を次の通りに
評価した：重度の病変、３；中ぐらいの病変、２；弱い
病変、１；病変なし、０。
【００３８】
【配列表】 配列番号１についての情報 配列特徴： （Ａ）配列の長さ：１５０１個の塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源： （Ａ）生物名：セルプリナ ハイオディセンテリア （Ｂ）株名：Ｂ２０４ 直接の起源 直接の起源：Ｅ．コリＪＭ１０５（ｐＪＢＡ）〔ＣＢＳ
５１２．９１〕 特徴１： （Ａ）位置：１〜４５６の塩基対 （Ｂ）他の情報：読み取り枠 性質：未知のタンパク質 特徴２： （Ａ）位置：４５７〜４７０の塩基対 （Ｂ）他の情報：非コード領域 性質： 特徴３： （Ａ）位置：４７１〜１１４２の塩基対 （Ｂ）他の情報：読み取り枠 性質：溶血素タンパク質 特徴４： （Ａ）位置：１１４３〜１５０１の塩基対 （Ｂ）他の情報：非コード領域 配列：配列番号１ GAT CCT AAT GCT GAT ACT GAT GAA TCT CCT GCT TTA TTG ATT TCT 45 Asp Pro Asn Ala Asp Thr Asp Glu Ser Pro Ala Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 GCT TCT ATA ACT GAT ACT GAT ACA GTT AAA GTA ATA TTA CAG GCA 90 Ala Ser Ile Thr Asp Thr Asp Thr Val Lys Val Ile Leu Gln Ala 20 25 30 TTT GCT GAA GAT GTT ACT GAT GAT ATT TAT ACA ATT GGC GGT AAT 135 Phe Ala Glu Asp Val Thr Asp Asp Ile Tyr Thr Ile Gly Gly Asn 35 40 45 TTA TGC TAT ATA AAA GAT TCT ATA TTA TAT ATT TCT GAT AAT TCT 180 Leu Cys Tyr Ile Lys Asp Ser Ile Leu Tyr Ile Ser Asp Asn Ser 50 55 60 AAT GTT ATA GAT TCT ATA ATT AAT GGT GAA AAG CCA GCA ACA GCA 225 Asn Val Ile Asp Ser Ile Ile Asn Gly Glu Lys Pro Ala Thr Ala 65 70 75 TTA TCT GCT GAT AAA GTT GAA ATA GCT AAA AAT AAT ACT ATG GCT 270 Leu Ser Ala Asp Lys Val Glu Ile Ala Lys Asn Asn Thr Met Ala 80 85 90 TTA TAT TTA GAG TTT AAT TCT AAT TTA TCA TTA TAT GGT ATT GGA 315 Leu Tyr Leu Glu Phe Asn Ser Asn Leu Ser Leu Tyr Gly Ile Gly 95 100 105 GAT GAA TAT ACT GAA ACT TTT GAA TCA GTT TAT ATA ACT TCA AAT 360 Asp Glu Tyr Thr Glu Thr Phe Glu Ser Val Tyr Ile Thr Ser Asn 110 115 120 ATA TTA GAA AGC AAT CAT ACT CAA ATG CTT TTA AAA GTA AAT ATG 405 Ile Leu Glu Ser Asn His Thr Gln Met Leu Leu Lys Val Asn Met 125 130 135 AGA GAT AAA GAA AGA AAT TCT CTT TCT ATA ATA AAA TCT TTC CTT 450 Arg Asp Lys Glu Arg Asn Ser Leu Ser Ile Ile Lys Ser Phe Leu 140 145 150 GGA TTA TAATACTAAT ATAA ATG CGA TTA GAT GAA TAT GTG CAT AGT 497 Gly Leu Met Arg Leu Asp Glu Tyr Val His Ser 1 5 GAA GGC TAT ACA GAA AGC AGA TCT AAA GCA CAG GAT ATA ATA CTA 542 Glu Gly Tyr Thr Glu Ser Arg Ser Lys Ala Gln Asp Ile Ile Leu 10 15 20 GCC GGT TGT GTT TTT GTT AAT GGA GTA AAG GTA ACT TCT AAG GCT 587 Ala Gly Cys Val Phe Val Asn Gly Val Lys Val Thr Ser Lys Ala 25 30 35 CAT AAA ATA AAA GAT ACT GAT AAT ATA GAA GTT GTT CAG AAT ATA 632 His Lys Ile Lys Asp Thr Asp Asn Ile Glu Val Val Gln Asn Ile 40 45 50 AAA TAT GTA TCA AGA GCT GGA GAA AAA TTA GAA AAG GCG TTT GTA 677 Lys Tyr Val Ser Arg Ala Gly Glu Lys Leu Glu Lys Ala Phe Val 55 60 65 GAA TTT GGA ATA TCT GTA GAA AAT AAA ATA TGT TTA GAT ATA GGA 722 Glu Phe Gly Ile Ser Val Glu Asn Lys Ile Cys Leu Asp Ile Gly 70 75 80 GCT TCT ACA GGA GGA TTT ACA GAT TGT CTG CTT AAG CAT GGT GCT 767 Ala Ser Thr Gly Gly Phe Thr Asp Cys Leu Leu Lys His Gly Ala 85 90 95 AAA AAA GTT TAT GCT CTT GAT GTA GGA CAT AAT CAG CTA GTT TAT 812 Lys Lys Val Tyr Ala Leu Asp Val Gly His Asn Gln Leu Val Tyr 100 105 110 AAA CTT CGT AAT GAT AAT AGG GTA GTG TCA ATA GAA GAT TTC AAT 857 Lys Leu Arg Asn Asp Asn Arg Val Val Ser Ile Glu Asp Phe Asn 115 120 125 GCC AAA GAT ATA AAT AAA GAA ATG TTC AAT GAT GAA ATC CCA TCT 902 Ala Lys Asp Ile Asn Lys Glu Met Phe Asn Asp Glu Ile Pro Ser 130 135 140 GTA ATA GTA AGT GAC GTA TCA TTT ATA TCA ATA ACA AAA ATA GCA 947 Val Ile Val Ser Asp Val Ser Phe Ile Ser Ile Thr Lys Ile Ala 145 150 155 CCA ATC ATA TTT AAA GAA TTA AAT AAT TTA GAG TTT TGG GTA ACT 992 Pro Ile Ile Phe Lys Glu Leu Asn Asn Leu Glu Phe Trp Val Thr 160 165 170 TTA ATA AAA CCA CAA TTT GAA GCT GAA AGA GGT GAT GTT TCA AAA 1037 Leu Ile Lys Pro Gln Phe Glu Ala Glu Arg Gly Asp Val Ser Lys 175 180 185 GGC GGT ATA ATA CGA GAT GAT ATA CTT AGA GAA AAA ATA TTA AAT 1082 Gly Gly Ile Ile Arg Asp Asp Ile Leu Arg Glu Lys Ile Leu Asn 190 195 200 AAT GCT ATT TCA AAG ATA ATA GAC TGC GGA TTT AAA GAA GTT AAT 1127 Asn Ala Ile Ser Lys Ile Ile Asp Cys Gly Phe Lys Glu Val Asn 205 210 215 AGA ACC ATC TCT CCT ATA AAA GGT GCT AAA GGT AAT ATA GAA TAT 1172 Arg Thr Ile Ser Pro Ile Lys Gly Ala Lys Gly Asn Ile Glu Tyr 220 225 230 TTA GCT CAT TTT ATT ATT TAA TCATTTTCT TTTTATGTGT ATTTCTCTGT 1222 Leu Ala His Phe Ile Ile * 235 240 TTATATATTT CATATTCTTT ATAGAAGCCT TCTACATCAT TTACCATTAA 1272 ATATCCTTCT TCTGATATAT CTAATGATTT TATTTTTAAT ATTTCATTTT 1322 CTACATTACT TTTATATTCT ATGCCTATCA TAGAACAAAT ATCATTTATA 1372 TTATATTGAA ATTTTATTTT GTTTATATTT TTGAATAAAA GTTCAGTTTT 1422 TATTAACGCT TCTATTATTA TCACGAATTT GCTTACTACT TTATTAGCAT 1472 TAAAAGACCT TATTCTAGAA ATAGT 1497
【図面の簡単な説明】
【図１】これはアガロースゲル電気泳動によるセルプリ
ナ ハイオディセンテリアＷｔＣ５及びＭｕｔＩ−Ｍｕ
ｔＶのＰＣＲ生成物の分析を示す。
【図２】これはセルプリナ ハイオディセンテリアＷｔ
Ｃ５及びＭｕｔＩ−Ｖの染色体ＤＮＡのサザンブロット
分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的に活性な溶血素の生成が遺伝子
    工学技法により停止されるセルプリナ ハイオディセン
    テリア（Serpulina hyodysenteriae）変異体。
  2. 【請求項２】 前記生物学的に活性な溶血素の生成が前
    記セルプリナの染色体における少なくとも１つの欠失及
    び／又は挿入により停止される請求項１記載の変異体。
  3. 【請求項３】 前記少なくとも１つの欠失及び／又は挿
    入が溶血素の生成をコードする遺伝子に存在する請求項
    ２記載の変異体。
  4. 【請求項４】 前記欠失又は挿入が、配列番号１に示さ
    れる配列又はそれに類似する配列を有する染色体のポリ
    ヌクレオチド領域に存在する請求項２又は３記載の変異
    体。
  5. 【請求項５】 前記挿入が選択可能な特徴をコードする
    遺伝子に存在する請求項２〜４のいづれか１項記載の変
    異体。
  6. 【請求項６】 請求項２〜５のいづれか１項記載のセル
    プリナ ハイオディセンテリア変異体及び適切なキャリ
    ヤーを含むワクチン。
  7. 【請求項７】 請求項２〜５のいづれか１項記載の生存
    セルプリナ ハイオディセンテリア変異体が存在する請
    求項６記載のワクチン。
  8. 【請求項８】 請求項６又は７項記載のワクチンを可能
    な宿主に投与することによってセルプリナ感染を予防す
    るための方法。
JP4355540A 1991-12-23 1992-12-18 セルプリナ ハイオディセンテリアワクチン Pending JPH05276936A (ja)

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