JPH05252959A - リグニンパーオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 リグニンパーオキシダーゼ遺伝子を提供す
る。 【構成】 アラゲカワラタケのｃＤＮＡライブラリーよ
りリグニンパーオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、
その塩基配列を決定した。本ＤＮＡ断片は全く新規なも
のであった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リグニンパーオキシダ
ーゼ（以下ＬＰＯと略す）遺伝子、それを含む組換えプ
ラスミド及び当該組換えプラスミドを含む形質転換体に
関する。ＬＰＯはリグニンに作用して、これを低分子化
または分解する機能を有するため、木材等のリグノセル
ロース材料を原料とする紙パルプ製造において種々の工
程に利用できる。即ちパルプ化工程、パルプ漂白工程、
排水処理工程等におけるリグニンの低分子化または分解
に利用できる。さらに、いわゆるセルロース系バイオマ
ス利用の分野において、セルロースの糖化の前処理とし
てリグニンを分解することにより、糖化効率を高める目
的にも利用できる。

【０００２】

【従来の技術】ＬＰＯはリグニンを分解する酵素とし
て、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒ
ｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）から最
初に単離精製され、ヘムを補欠分子族として含むこと、
分子量が約４２，０００であること、酵素作用に過酸化
水素が必要であること、およびリグニンモデル化合物の
４位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった化合
物に対して作用することが明らかになっている〔FEBS L
ett.169, 247(1984)」。

【０００３】ＬＰＯは近年ファネロカエテ・クリソスポ
リウム以外の白色腐朽菌、例えばアラゲカワラタケ（Ｃ
ｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）〔特開昭６４−２
７４６８参照〕、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒ
ａ ａｄｕｓｕｔｕｓ）〔特開平２−３０３４８３参
照〕、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏ
ｌｏｒ）〔Acta Chem.Scand., B41, 766(1987)参照〕、
コガネシワウロコタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔ
ａ）〔Biochem.J., 254, 877(1988)参照〕等の培養物中
から見い出されているが、ＬＰＯの具体的な生産が確認
されている菌株の種類は少なく、また精製された例は上
記の菌株の他に知られていない。

【０００４】これらのいずれの菌についてもその培養物
中にいくつかのＬＰＯアイソザイムを見い出すことがで
き、リグニン分解においても多種の酵素が関与している
と考えることができる。ファネロカエテ・クリソスポリ
ウム、カワラタケ、コガネシワウロコタケ及びヤケイロ
タケのいずれの菌株においても、野生株を用いてＬＰＯ
を生産せしめる場合、培地中の窒素源濃度を低濃度に抑
えること、培養器中の酸素分圧を高くすることなどの制
約があり、ＬＰＯの大量生産は困難であった。

【０００５】これまでに、高窒素源濃度下、また大気と
同レベルの酸素分圧下でＬＰＯを生産する変異株の取得
が試みられている〔特開昭６４−２７４６９、特開平２
−７２８７５〕が未だ実用化には至っていない。また、
上述のＬＰＯ生産菌の中で、その遺伝子が単離されてい
るのはファネロカエテ・クリソスポリウム〔Nature,32
6, 520(1987)〕、カワラタケ〔B.B.R.C., 179, 428(199
1)〕、ヤケイロタケ〔特願平３−５９２８４〕、コガネ
シワウロコタケ〔Gene, 85, 343,(1989)〕の他にはな
く、これらの菌のＬＰＯ遺伝子を利用した工業生産も未
だ行なわれていない。

【０００６】アラゲカワラタケにおいても上記菌株と同
様に静置培養によりＬＰＯを生産する〔特開昭６４−２
７４６８〕が、その生産量は少なく、実用化するために
さらに生産方法の改善が望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ＬＰ
Ｏの実用的な製造のために有用なＬＰＯ遺伝子を提供し
ようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＬＰＯを生
産するアラゲカワラタケの菌体から単離したｍＲＮＡを
基に作製したｃＤＮＡライブラリーより新規なＬＰＯ遺
伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成す
るに至った。すなわち本発明は、配列番号２のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡからなるリグニンパーオキシダ
ーゼ遺伝子を提供する。その具体例として本発明は配列
番号１の塩基配列を有するリグニンパーオキシダーゼ遺
伝子を提供する。さらに、本発明は、配列番号１を有す
るか、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードするリグ
ニンパーオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターを提
供する。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む
形質転換体を提供する。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【０００９】構造遺伝子 本発明のＬＰＯの構造遺伝子は、配列番号１における１
番目のＡＴＧ（Ｍｅｔ）から１１１６番目のＴＴＣ（Ｐ
ｈｅ）の塩基配列からなる。この塩基配列は３７２アミ
ノ酸をコードするものであって、Ｎ末端から２６アミノ
酸のリーダー配列と３４６アミノ酸のリグニンパーオキ
シダーゼをそれぞれコードするものである。

【００１０】推定される成熟タンパク質のＮ末端アミノ
酸であるバリンから数えて１０３番目のアスパラギン
は、Ｎ−グリコシル化されたアミノ酸残基と考えられ
る。また、パーオキシダーゼに認められるヘム鉄が配位
するプロキシマルヒスチジンが１７９番目のヒスチジン
であり、過酸化水素の分解に関与するディスタルヒスチ
ジンが４８番目のヒスチジンであると考えられ、これら
上流、下流のアミノ酸配列は他のパーオキシダーゼと高
いホモロジーを有していた（表１参照）。

【００１１】

【表１】

【００１２】本発明のＬＰＯ遺伝子はファネロカエテ・
クリソスポリウムのＬＰＯ Ｈ８遺伝子とは表２に示し
たように種々の点で異なっており、その相同性は塩基配
列において７０％、アミノ酸配列において６０％であ
り、ファネロカエテ・クリソスポリウムのＬＰＯ Ｈ８
遺伝子とは全く異なるものである。また、表１からわか
る様に既知のパーオキシダーゼとはアミノ酸配列が異な
り、新規なＬＰＯ遺伝子である。

【００１３】

【表２】 本発明のＬＰＯ遺伝子はアラゲカワラタケのｍＲＮＡに
基いて合成したｃＤＮＡライブラリーから以下のように
して得ることができる。

【００１４】ｃＤＮＡライブラリーの作製 アラゲカワラタケのＬＰＯ遺伝子を含むｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡライブラリー作製は以下のようにして行なう。
アラゲカワラタケはいずれの株を用いてもよいが、例え
ばＩＦＯ４９１７株を用いることができる。該菌体のｃ
ＤＮＡライブラリー作製に適した菌体はＬＰＯ生産中の
ものであればいずれでも良く、例えば特開平２−３０３
４８３に示した方法で培養し、得ることができる。この
ようにして得た菌体を直ちに液体窒素で凍結し、例えば
乳鉢、ワーリングブレンダー等を用いて粉砕し、植物細
胞からＲＮＡを抽出する常法〔Sambrookら著、"Molecul
arCloning A Laboratory Manual／2nd Edition(1989)
〕に従ってＲＮＡを抽出する。

【００１５】得られたＲＮＡ中のｍＲＮＡはオリゴｄＴ
セルロース等のアフィニティカラムを通して濃縮、精製
し、次いでこの一部を使用してｃＤＮＡを合成し、適当
なリンカーまたはアダプターを介して、大腸菌のクロー
ニングベクター、例えばλｇｔ１０に連結してｃＤＮＡ
ライブラリーを作製することができる。

【００１６】これらの操作は、一般的に知られた方法、
例えば前述の"Molecular Cloning ALaboratory Manual"
によって行なうことができる。また市販のｍＲＮＡ抽
出キット、ｃＤＮＡ合成キット、ｃＤＮＡクローニング
キット、ライゲーションキット等のキット類を適宜用い
ることにより簡便に行なうことができる。

【００１７】ライブラリーからのＬＰＯ遺伝子の単離及
びその塩基配列の決定 精製したアラゲカワラタケのリグニンパーオキシダーゼ
をリシルエンドペプチダーゼ等のタンパク質分解酵素で
処理し、いくつかのペプチド断片のアミノ酸配列を決定
し、そのアミノ酸配列を基にしていくつかの合成ＤＮＡ
プローブを作成し、これらを〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰで末
端ラベルし、これをプローブとして前述のｃＤＮＡライ
ブラリーからプラーク・ハイブリダイゼーションにより
選抜できる。

【００１８】また、上記方法で単離したＬＰＯ遺伝子の
塩基配列は、Ｓａｎｇｅｒらの方法〔Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 74, 5463,(1977) 〕により決定できる。ｍＲＮ
ＡからｃＤＮＡを合成し、λｇｔ１０で作製したｃＤＮ
Ａライブラリーから選抜したクローンを大腸菌ベクター
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋にサブクローニング
して得た株、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ／ｐＢＳＬＰＯ
Ｃ４ａは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１２６８１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６８１）として寄
託されている。

【００１９】組換えＤＮＡ、形質転換体 配列番号１の塩基配列で表わされるＬＰＯ遺伝子は、適
当なベクター例えばプラスミドベクターに連結し、発現
組換えベクターを得ることができる。この場合ベクター
としては特に限定されるものではなく、λファージ、コ
スミドベクター、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が
適宜用いられる。さらに酵母や枯草菌のベクターも用い
られる。また、上記組換えプラスミドを所望の宿主細胞
に導入して形質転換体が得られる。宿主細胞としては大
腸菌、枯草菌及び酵母が用いられる。

【００２０】

【実施例】

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。実施例１．ｃＤＮＡライブラリーの作成 アラゲカワラタケを特開昭６４−２７４６８で示す条件
で培養を行ない、集菌、洗浄後、液体窒素で凍結し、ワ
ーリングブレンダーで粉砕した。以下に使用する器具、
試薬類は常法により〔Sambrookら著、"Molecular Cloni
ng A Laboratory Manual／2nd" Edition(1989)〕ジエチ
ルピロカーボネート処理したものを用いた。粉砕した菌
体約５ｇからアマシャム社製ＲＮＡ抽出キットを用い、
そのマニュアルに従って全ＲＮＡを抽出した。

【００２１】２mgの該全ＲＮＡからファルマシア社製の
mRNA Purification Kit を用い、そのマニュアルに従っ
てｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ画分を調製した。次に５μｇの
ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡからアマシャム社製のｃＤＮＡ合
成キットを用いて、そのマニュアルに従って２本鎖ｃＤ
ＮＡを合成した。合成した２本鎖ｃＤＮＡからアマシャ
ム社製のｃＤＮＡクローニングキットを用い、そのマニ
ュアルに従ってλｇｔ１０でのｃＤＮＡライブラリーを
以下のように作製した。ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプタ
ーを連結し、ゲル濾過カラムにより未反応のアダプター
を除去し、０．５kb以上のｃＤＮＡ断片を含む画分を取
り出した。さらに上記ｃＤＮＡ断片画分をキナーゼ処理
後、フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱に
より回収し、風乾後、１０μｌのＴＥ溶液に溶解した。

【００２２】λｇｔ１０アーム１μｇとｃＤＮＡ１００
ngとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２．５ユニットを含
む附属のライゲーションバッファー中で１６℃１６時間
連結反応させた。次に、マニュアルに従ってｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでパッケージを行ない、ｃＤＮＡライブラリーと
した。上記ｃＤＮＡライブラリーから組換え体λファー
ジを大腸菌ＮＭ５１４に感染せしめ、ＬＢ寒天プレート
上でプラークを形成させた。その結果、５ｘ１０⁷ プラ
ーク／μｇインサートｃＤＮＡの力価を有するｃＤＮＡ
ライブラリーを得ることができた。

【００２３】実施例２．ｃＤＮＡライブラリーからのＬ
ＰＯｃＤＮＡ遺伝子の単離 上記ｃＤＮＡライブラリーからのＬＰＯ遺伝子の単離は
常法通り〔Sambrookら著、"Molecular Cloning A Labor
atory Manual／2nd" Edition(1989)〕プラークハイブリ
ダイゼーションにより行なった。直径９０mmのシャーレ
に２，０００〜３，０００のプラークが出現するように
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５１４にファージを感染させ、プラ
ークが０．５mm〜１mm位の大きさの時にナイロンメンブ
ランを２分間プレートにのせてメンブランにプラークを
移した。続いてアマシャム社製のブロッティング・メン
ブランのマニュアルに従って、アルカリ変性液による変
性操作を１回、中和液による中和操作を２回、さらに２
ｘＳＳＣによる洗浄を行ない風乾後、紫外線照射により
組換え体ＤＮＡをメンブラに固定した。

【００２４】続いて、一枚のナイロンメンブランあた
り、５mlのプレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳ
Ｃ，１×デンハート溶液、１％ＳＤＳ，１００μｇ／ml
のサケ変性ＤＮＡ）中で６５℃一晩振盪した。プレハイ
ブリダイゼーション終了後、一枚あたり新たに２mlのハ
イブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ，１×デンハー
ト溶液、１％ＳＤＳ，１００μｇ／mlサケ変性ＤＮＡ）
を加え、さらに１×１０ ⁶ cpm/mlとなるように合成ＤＮ
Ａプローブを添加し、４０℃で２４時間ハイブリダイゼ
ーションを行なった。

【００２５】ハイブリダイゼーション後のメンブランは
常法に従い、１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ及び０．１×
ＳＳＣで時間を変えて数回洗浄し、乾燥後増感紙を用い
たオートラジオグラフィーにより後述する２つの合成Ｄ
ＮＡプローブが共通にハイブリダイズする陽性プラーク
をたんりした。上記ＬＰＯ遺伝子の単離に用いたＤＮＡ
プローブは以下の表３に示すにアミノ酸配列の解析に基
づきＤＮＡ合成機により作製した。表３に示した合成Ｄ
ＮＡを常法通り、Ｔ４ＤＮＡキナーゼにより［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰを用いて端末標識した。

【００２６】

【表３】

【００２７】陽性プラークから常法に従って、液体培養
によりファージＤＮＡを調製し、制限酵素ＢａｍＨＩで
切断後、１％アガロースゲル電気泳動により分画して
１．３kbp のｃＤＮＡ断片を得た。該断片を常法に従っ
てStratagene社製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ
＋のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、大腸菌Ｘ
Ｌ−１Ｂｌｕｅを形質転換した。

【００２８】サブクローニングしたＤＮＡを大量調製
し、超遠心分離法（５０，０００rpm,１６hr，２０℃）
で精製して塩基配列を決定した。塩基配列の決定は宝酒
造社製のデリーションキット及びUnited States Bioche
mical 社製のシーケナーゼのキットを用いて行った。結
果は配列番号１に示した通りである。なお、ＢａｍＨＩ
で切断後の断片を、Stratagene社製のプラスミドｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫ＋のＢａｍＨＩサイトに連結
し、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転
換して得た株Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ／ｐＢＳ
ＬＰＯＣ４ａは、工業技術院微生物工業研究所に微工研
菌寄第１２６８１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６８１）とし
て寄託されている。

【００２９】ＬＰＯ遺伝子の構造 配列番号１のｍＲＮＡに由来する遺伝子と他のアラゲカ
ワラタケから単離されたリグニンパーオキシダーゼ遺伝
子との比較から分泌に関与するリーダー配列の存在が明
らかとなった。配列番号２に示されるアミノ酸配列にお
いて、１番目のメチオニンから始まりアルギニンまでの
２６個のアミノ酸配列がリーダー配列であり、成熟蛋白
質としてはアミノ末端のバリンから、カルボキシル末端
のフェニルアラニンまで３４６個のアミノ酸から成って
いる。

【００３０】配列番号２で示される成熟蛋白質の１０３
番目のアスパラギンはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ配列からＮ−
グリコシル化されていると考えられる。また、多くのパ
ーオキシダーゼに共通してみられるヘム鉄が配位するプ
ロキシマルヒスチジンが１７９番目、過酸化水素の分解
に関与するディスタルヒスチジンが４８番目に見られ、
これらの周辺のアミノ酸配列は他のパーオキシダーゼと
比較的高いホモロジーを有していた。しかしながら、既
知のＬＰＯ遺伝子の配列とは全く異なっており、新規な
配列であった。

【００３１】

【発明の効果】本発明により、新規なＬＰＯ遺伝子、そ
の組換えプラスミド及び形質転換体を提供することがで
きた。これにより、遺伝子組換え技術を用いたリグニン
パーオキシダーゼ生産を行なうことができる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１２３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus） 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 1-1116 P CDS 1-78 P sig peptide 79-1116 P mat peptide

【００３３】 配列： ATGGCCTTCG GTAGTCTCCT CACCATCGTC TCCCTCGCTG CGACCCTCAC 50 GGGCACCAAC GCTGCGCTGA CGCGCCGCGT CGCCTGCCCC GACGGCGTCA 100 ACACCGCGAC CAACGCCGCC TGCTGCCAGC TCTTCGCCGT CCGCGAGGAT 150 CTCCAGCAAA ACCTCTTCCA CGGTGGTCTG TGCACCGCTG AGGGGCACGA 200 CTCCCTCCGC CTGACCTTCC ACGACGGTAT CGCCATCTCG CCCGCGCTGG 250 AGGCGCAAGG CAAGTTCGGC GGCGGCGGTG CCGACGGCTC GATTTCGATC 300 TTCCCCGAGA TCGAGACGGC GTTCCACCCC AACATCGGTC TCGACGAGAT 350 CGTTGCTCTC CAGAAGCCCC TCCAGGCACG CCACAACCTC TCGCACGCTG 400 ACTTCCTGCA CTTCGCCGGT GCCATCGCCG CCTCGAACTG CGCGGGTGCC 450 GCCCAGCTCG CCGCCTTCGT CGGCCGCAAG GACGCCACCC AGCCCGCCCC 500 CGACGGCCTT GTCCCCGAGC CGTTCCACAC CCCCGACCAG ATCTTCGACC 550 GCCTCGGACC GCGGTCCCAG GGCGAGTTCG ACCCAATCCT CACCGTCTGG 600 CTCCTGACCG CGCACACCGT CGCGGCGGCC AACGACGTCG ACCCGACCAA 650 GGCCGGCCTT CCCTTCGACT CGACGCCGGA GCTGTGGGAC ACGCAGTTCT 700 TCGTGGAGAC GCAGCTGCGC GGGACCGTGT TCCCCGGCTC GGGCGGGAAC 750 CAGGGCGAGG TGGAGAGCCC GCTCGAGGGG GAGATCCGCC TGCAGAGCGA 800 CCACACGATC GCGCGCGACC CGGGCACGGC GTGCGAGTGG CAGCTGTTCG 850 TGGACAACCA GCCGAAGGCG CAGCAGATGT TCCAGTTCGT GTTCCAGGTG 900 CTCACGACGC TCGGGCAGAA CCAGGACGAC CTCGTCGACT GCACTGAAGT 950 TGTACCCATC CCCCGCCCCG CCCAGGGCCG TACTCACCTC CCCGCCGGCA 1000 TGACCCACAC CGACATCGAG CAGGCGTGCG CCGACACCCC CTTCCCCACC 1050 CTCCCCATCG ACCCCGGTCC GAAGACCGCC GTCGCCCCTG TCGTCCCCCC 1100 TCCGAAGGCC ACTTTCTGAG CACGTGGATT TTGGACTATG GTTAGAGCCT 1150 TATGCCAGCT AGACACGCGC TGTTTTGTTG AGTAAGCTAT CCCTGAACGA 1200 ATCGCATGTT CCTTGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1239

【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：３７２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 起源 生物名：アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus） 株名：ＩＦＯ４９１７ 配列の特徴 1-26 P sig peptide 27-372 P mat peptide 配列： Met Ala Phe Gly Ser Leu Leu Thr Ile Val Ser Leu Ala Ala Thr 5 10 15 Leu Thr Gly Thr Asn Ala Ala Leu Thr Arg Arg Val Ala Cys Pro 20 25 30 Asp Gly Val Asn Thr Ala Thr Asn Ala Ala Cys Cys Gln Leu Phe 35 40 45 Ala Val Arg Glu Asp Leu Gln Gln Asn Leu Phe His Gly Gly Leu 50 55 60 Cys Thr Ala Glu Gly His Asp Ser Leu Arg Leu Thr Phe His Asp 65 70 75 Gly Ile Ala Ile Ser Pro Ala Leu Glu Ala Gln Gly Lys Phe Gly 80 85 90 Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ser Ile Phe Pro Glu Ile Glu 95 100 105 Thr Ala Phe His Pro Asn Ile Gly Leu Asp Glu Ile Val Ala Leu 110 115 120 Gln Lys Pro Leu Gln Ala Arg His Asn Leu Ser His Ala Asp Phe 125 130 135 Leu His Phe Ala Gly Ala Ile Ala Ala Ser Asn Cys Ala Gly Ala 140 145 150 Ala Gln Leu Ala Ala Phe Val Gly Arg Lys Asp Ala Thr Gln Pro 155 160 165 Ala Pro Asp Gly Leu Val Pro Glu Pro Phe His Thr Pro Asp Gln 170 175 180 Ile Phe Asp Arg Leu Gly Pro Arg Ser Gln Gly Glu Phe Asp Pro 185 190 195 Ile Leu Thr Val Trp Leu Leu Thr Ala His Thr Val Ala Ala Ala 200 205 210 Asn Asp Val Asp Pro Thr Lys Ala Gly Leu Pro Phe Asp Ser Thr 215 220 225 Pro Glu Leu Trp Asp Thr Gln Phe Phe Val Glu Thr Gln Leu Arg 230 235 240 Gly Thr Val Phe Pro Gly Ser Gly Gly Asn Gln Gly Glu Val Glu 245 250 255 Ser Pro Leu Glu Gly Glu Ile Arg Leu Gln Ser Asp His Thr Ile 260 265 270 Ala Arg Asp Pro Gly Thr Ala Cys Glu Trp Gln Leu Phe Val Asp 275 280 285 Asn Gln Pro Lys Ala Gln Gln Met Phe Gln Phe Val Phe Gln Val 290 295 300 Leu Thr Thr Leu Gly Gln Asn Gln Asp Asp Leu Val Asp Cys Thr 305 310 315 Glu Val Val Pro Ile Pro Arg Pro Ala Gln Gly Arg Thr His Leu 320 325 330 Pro Ala Gly Met Thr His Thr Asp Ile Glu Gln Ala Cys Ala Asp 335 340 345 Thr Pro Phe Pro Thr Leu Pro Ile Asp Pro Gly Pro Lys Thr Ala 350 355 360 Val Ala Pro Val Val Pro Pro Pro Lys Ala Thr Phe 365 370

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２で表わされるアミノ酸配列を
   コードするＤＮＡからなるリグニンパーオキシダーゼ遺
   伝子。
2. 【請求項２】 配列番号１の塩基配列で表わされるリグ
   ニンパーオキシダーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１または２に定義するリグニンパ
   ーオキシダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えプラスミドを含む
   形質転換体。