JPH05244958A - コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子 - Google Patents
コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子Info
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- JPH05244958A JPH05244958A JP4046836A JP4683692A JPH05244958A JP H05244958 A JPH05244958 A JP H05244958A JP 4046836 A JP4046836 A JP 4046836A JP 4683692 A JP4683692 A JP 4683692A JP H05244958 A JPH05244958 A JP H05244958A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0101—Oligo-1,6-glucosidase (3.2.1.10), i.e. sucrase
-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】コリネホルム細菌に由来しシュークラーゼ活性
を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取
得し、該ＤＮＡ断片を含有するプラスミドをコリネホル
ム細菌に導入しシュークロースを取り込みグルコースと
フラクトースに分解する活性すなわちシュークラーゼ活
性を増強する。 【構成】コリネホルム細菌由来で、選択図に示す制限酵
素切断部位を有する、シュークラーゼ活性を持つ蛋白質
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を
含有するコリネホルム細菌内で複製可能なプラスミド、
および該プラスミドを保有するコリネホルム細菌
を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取
得し、該ＤＮＡ断片を含有するプラスミドをコリネホル
ム細菌に導入しシュークロースを取り込みグルコースと
フラクトースに分解する活性すなわちシュークラーゼ活
性を増強する。 【構成】コリネホルム細菌由来で、選択図に示す制限酵
素切断部位を有する、シュークラーゼ活性を持つ蛋白質
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を
含有するコリネホルム細菌内で複製可能なプラスミド、
および該プラスミドを保有するコリネホルム細菌
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、コリネホルム細菌に由
来しシュークラゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含有するコリネホル
ム細菌内で複製可能なプラスミド、および該プラスミド
を保有するコリネホルム細菌に関するもので、アミノ酸
などの発酵生産等に有効なコリネホルム細菌のシューク
ロース資化性改善、それによるアミノ酸収率およびアミ
ノ酸生産性の向上に利用可能なものである。
来しシュークラゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含有するコリネホル
ム細菌内で複製可能なプラスミド、および該プラスミド
を保有するコリネホルム細菌に関するもので、アミノ酸
などの発酵生産等に有効なコリネホルム細菌のシューク
ロース資化性改善、それによるアミノ酸収率およびアミ
ノ酸生産性の向上に利用可能なものである。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子操作技術を用いたアミノ酸生産菌
の育種については従来より多くの研究がなされており、
報告例も多数ある（Biotechnology Letters, Vol. 2 (1
980)pp. 525-530、Appl. Environ. Microbiol., Vol. 1
44 (1979) pp. 181-190、日本農芸化学会昭和56年度大
会講演要旨集 (1981) pp. 8）。しかしこれらはすべて
アミノ酸生合成系の遺伝子を材料とし、それらを増強す
ることによって目的とするアミノ酸の菌体あたりの生産
性を高めるものであって、それらの出発物質となる糖の
資化性を高めることによって生産効率を高めるものでは
なかった。
の育種については従来より多くの研究がなされており、
報告例も多数ある（Biotechnology Letters, Vol. 2 (1
980)pp. 525-530、Appl. Environ. Microbiol., Vol. 1
44 (1979) pp. 181-190、日本農芸化学会昭和56年度大
会講演要旨集 (1981) pp. 8）。しかしこれらはすべて
アミノ酸生合成系の遺伝子を材料とし、それらを増強す
ることによって目的とするアミノ酸の菌体あたりの生産
性を高めるものであって、それらの出発物質となる糖の
資化性を高めることによって生産効率を高めるものでは
なかった。
【０００３】遺伝子操作技術を用いてアミノ酸生産菌の
糖の資化性を高める報告例としては、特開昭61ー11918
5、特開平2ー171178がある。これらの技術は、遺伝子操
作によりエシェリヒア・コリにシュークロース資化能を
与えている。すなわち、シュークロースを取り込み、そ
れをグルコースとフラクトースに分解する活性をエシェ
リヒア・コリに与え、本来エシェリヒア・コリが資化で
きないシュークロースを炭素源として利用できるように
したというものである。しかし、コリネホルム細菌にお
いては、遺伝子操作技術を用いてシュークロースなど糖
の資化性を高めたという報告はなかった。
糖の資化性を高める報告例としては、特開昭61ー11918
5、特開平2ー171178がある。これらの技術は、遺伝子操
作によりエシェリヒア・コリにシュークロース資化能を
与えている。すなわち、シュークロースを取り込み、そ
れをグルコースとフラクトースに分解する活性をエシェ
リヒア・コリに与え、本来エシェリヒア・コリが資化で
きないシュークロースを炭素源として利用できるように
したというものである。しかし、コリネホルム細菌にお
いては、遺伝子操作技術を用いてシュークロースなど糖
の資化性を高めたという報告はなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、遺伝子工学の手法を用いてコリネホルム細菌のシュ
ークロース資化性を改善することであり、これによりア
ミノ酸発酵におけるアミノ酸の収率の向上をはかること
である。さらにはシュークロース資化性が高まることに
起因する菌の生育速度改善効果を利用したアミノ酸の生
産性の向上を実現することである。具体的には、コリネ
ホルム細菌に由来しシュークラーゼ活性を持つ蛋白質を
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断
片を含有するコリネホルム細菌内で複製可能なプラスミ
ドを取得し、該プラスミドをコリネホルム細菌に導入
し、該細菌のシュークロースを取り込みグルコースとフ
ラクトースに分解する活性を増強することである。
は、遺伝子工学の手法を用いてコリネホルム細菌のシュ
ークロース資化性を改善することであり、これによりア
ミノ酸発酵におけるアミノ酸の収率の向上をはかること
である。さらにはシュークロース資化性が高まることに
起因する菌の生育速度改善効果を利用したアミノ酸の生
産性の向上を実現することである。具体的には、コリネ
ホルム細菌に由来しシュークラーゼ活性を持つ蛋白質を
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断
片を含有するコリネホルム細菌内で複製可能なプラスミ
ドを取得し、該プラスミドをコリネホルム細菌に導入
し、該細菌のシュークロースを取り込みグルコースとフ
ラクトースに分解する活性を増強することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、遺伝子工学の手
法を用いてコリネホルム細菌由来のシュークラーゼ活性
を持つ蛋白質をコードする遺伝子を取得することに成功
した。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、遺伝子工学の手
法を用いてコリネホルム細菌由来のシュークラーゼ活性
を持つ蛋白質をコードする遺伝子を取得することに成功
した。
【０００６】即ち、本発明は、コリネホルム細菌由来
で、図１に示す制限酵素切断部位を有する、シュークラ
ーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片、該ＤＮＡ断片を含有するコリネホルム細菌内で複
製可能なプラスミド、および該プラスミドを保有するコ
リネホルム細菌である。
で、図１に示す制限酵素切断部位を有する、シュークラ
ーゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片、該ＤＮＡ断片を含有するコリネホルム細菌内で複
製可能なプラスミド、および該プラスミドを保有するコ
リネホルム細菌である。
【０００７】本発明におけるコリネホルム細菌とはバー
ジェイズ・マニュアル・オブ・ディターミネーティブ・
バクテリオロジー第８版５９９ページ（１９７４）に記
載されているように好気性のグラム陽性かん菌である。
ジェイズ・マニュアル・オブ・ディターミネーティブ・
バクテリオロジー第８版５９９ページ（１９７４）に記
載されているように好気性のグラム陽性かん菌である。
【０００８】本発明におけるシュークラーゼ活性を持つ
蛋白質をコードする遺伝子とは、シュークロースよりグ
ルコースとフラクトースを生成する活性を持つ蛋白質を
コードする遺伝子のことをさす。シュークラーゼ活性は
菌体がシュークロースを炭素源として利用する時に重要
であって、菌体は分解されたグルコースを利用する。
蛋白質をコードする遺伝子とは、シュークロースよりグ
ルコースとフラクトースを生成する活性を持つ蛋白質を
コードする遺伝子のことをさす。シュークラーゼ活性は
菌体がシュークロースを炭素源として利用する時に重要
であって、菌体は分解されたグルコースを利用する。
【０００９】本発明においてシュークラーゼ活性を持つ
蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得方法
は、コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡより遺伝子ライブ
ラリーを作成し、プローブを用いてシュークラーゼ遺伝
子のクローニングを行う方法が採用できる。以下、詳細
に説明する。
蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得方法
は、コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡより遺伝子ライブ
ラリーを作成し、プローブを用いてシュークラーゼ遺伝
子のクローニングを行う方法が採用できる。以下、詳細
に説明する。
【００１０】まず、コリネホルム細菌から得られたＤＮ
Ａ数百マイクログラムを制限酵素Sau3AIで部分分解し、
シュークロース密度勾配遠心によって、分子量約千から
１万程度の分画を取得する。これをエシェリヒア・コリ
のベクターpUC18を制限酵素BamHIで切断しておいたもの
と混合し、ATP存在下、T4DNAライゲースによって連結
後、エシェリヒア・コリ JM109株を形質転換することに
よって、コリネホルム細菌全遺伝子のライブラリーを作
成する。
Ａ数百マイクログラムを制限酵素Sau3AIで部分分解し、
シュークロース密度勾配遠心によって、分子量約千から
１万程度の分画を取得する。これをエシェリヒア・コリ
のベクターpUC18を制限酵素BamHIで切断しておいたもの
と混合し、ATP存在下、T4DNAライゲースによって連結
後、エシェリヒア・コリ JM109株を形質転換することに
よって、コリネホルム細菌全遺伝子のライブラリーを作
成する。
【００１１】シュークラーゼ遺伝子は バチルス・ズブ
チリス (Gene, Vol. 45 (1986) pp.221-225)、バクテロ
イデス・フラジリス (Appl. Environ. Microbiol., Vo
l. 56(1990) pp. 1944-1948)、ザイモモナス・モビリス
(J. Bacteriol., Vol. 172(1990) pp. 6727-6735)、ス
トレプトコッカス・ミュータンス (Infect. Immun.,Vo
l. 56 (1988) pp.1956-1960)、サッカロミセス属酵母
(Nucleic Acids Res.,Vol. 11 (1983) pp. 1943-195
4)、ビブリオ・アルジノリティカス (Gene Vol.80 (198
9) pp. 49-56)などでクローニングされており、それら
の遺伝子の塩基配列はある程度の相同性を持っている
(J. Bacteriol., Vol. 172 (1990) pp. 6727-6735)。各
生物間で高く保存されている箇所の配列をもとに数種類
の合成ＤＮＡをＤＮＡシンセサイザーを用いて合成す
る。
チリス (Gene, Vol. 45 (1986) pp.221-225)、バクテロ
イデス・フラジリス (Appl. Environ. Microbiol., Vo
l. 56(1990) pp. 1944-1948)、ザイモモナス・モビリス
(J. Bacteriol., Vol. 172(1990) pp. 6727-6735)、ス
トレプトコッカス・ミュータンス (Infect. Immun.,Vo
l. 56 (1988) pp.1956-1960)、サッカロミセス属酵母
(Nucleic Acids Res.,Vol. 11 (1983) pp. 1943-195
4)、ビブリオ・アルジノリティカス (Gene Vol.80 (198
9) pp. 49-56)などでクローニングされており、それら
の遺伝子の塩基配列はある程度の相同性を持っている
(J. Bacteriol., Vol. 172 (1990) pp. 6727-6735)。各
生物間で高く保存されている箇所の配列をもとに数種類
の合成ＤＮＡをＤＮＡシンセサイザーを用いて合成す
る。
【００１２】このようにして作成した数種の合成ＤＮＡ
を(32P)ATPを基質としてリン酸化し、標識プローブとす
る。上記にて作成した遺伝子ライブラリーを用いて、コ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、該プローブにハ
イブリダイズするコロニーのスクリーニングを行う。プ
ローブとハイブリダイズするコロニーのうち、その中で
シュークラーゼ活性を発現するものを選び出す。
を(32P)ATPを基質としてリン酸化し、標識プローブとす
る。上記にて作成した遺伝子ライブラリーを用いて、コ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、該プローブにハ
イブリダイズするコロニーのスクリーニングを行う。プ
ローブとハイブリダイズするコロニーのうち、その中で
シュークラーゼ活性を発現するものを選び出す。
【００１３】本発明において、シュークラーゼ活性を持
つ蛋白質をコードする遺伝子を乗せるプラスミドとして
は特に制限はないが、通常コリネホルム細菌由来のプラ
スミドを用いれば良い。具体的にはpHM1519(Agric. Bio
l. Chem., Vol. 48 (1984)pp. 2901-2903)、pAM330(Agr
ic. Biol. Chem., Vol. 48 (1984) pp. 2901-2903)、お
よびこれらをベースとした薬剤耐性プラスミド等であ
る。また、ホモロガスリコンビネーションを用いて染色
体中に導入することも可能である。
つ蛋白質をコードする遺伝子を乗せるプラスミドとして
は特に制限はないが、通常コリネホルム細菌由来のプラ
スミドを用いれば良い。具体的にはpHM1519(Agric. Bio
l. Chem., Vol. 48 (1984)pp. 2901-2903)、pAM330(Agr
ic. Biol. Chem., Vol. 48 (1984) pp. 2901-2903)、お
よびこれらをベースとした薬剤耐性プラスミド等であ
る。また、ホモロガスリコンビネーションを用いて染色
体中に導入することも可能である。
【００１４】本発明において宿主菌として使用できるコ
リネホルム細菌としては、例えばブレビバクテリウム・
サッカロリティクムATCC14066,ブレビバクテリウム・イ
ンマリオフィルムATCC14068、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・
ロゼウムATCC13825、ブレビバクテリウム・フラバムATC
C13826、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムAT
CC13870、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC1303
2、13060、コリネバクテリウム・リリウムATCC15990、
等の野生株、および上記グルタミン酸生産菌より誘導さ
れ、グルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン
をはじめとするアミノ酸類、イノシンをはじめとする核
酸類等、他の生産物を生産する変異株も含まれる。
リネホルム細菌としては、例えばブレビバクテリウム・
サッカロリティクムATCC14066,ブレビバクテリウム・イ
ンマリオフィルムATCC14068、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・
ロゼウムATCC13825、ブレビバクテリウム・フラバムATC
C13826、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムAT
CC13870、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC1303
2、13060、コリネバクテリウム・リリウムATCC15990、
等の野生株、および上記グルタミン酸生産菌より誘導さ
れ、グルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン
をはじめとするアミノ酸類、イノシンをはじめとする核
酸類等、他の生産物を生産する変異株も含まれる。
【００１５】シュークラーゼ活性を持つ蛋白質をコード
する遺伝子を有する組換えプラスミドを上述したコリネ
ホルム細菌に導入する方法としては通常よく用いられる
プロトプラスト法(Gene, Vol. 39 (1985) pp. 281-28
6)、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, Vol.
7 (1989) pp. 1067-1070)、等の方法を用いれば良い。
また得られた形質転換体は通常よく用いられている方
法、条件に従って培養すればよい。
する遺伝子を有する組換えプラスミドを上述したコリネ
ホルム細菌に導入する方法としては通常よく用いられる
プロトプラスト法(Gene, Vol. 39 (1985) pp. 281-28
6)、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, Vol.
7 (1989) pp. 1067-1070)、等の方法を用いれば良い。
また得られた形質転換体は通常よく用いられている方
法、条件に従って培養すればよい。
【００１６】シュークラーゼ活性を持つ蛋白質をコード
する遺伝子が導入されたコリネホルム細菌を用いて生産
効率を上げることのできる有用物質としては、各種アミ
ノ酸の他、インターロイキン２、６等の生理活性物質で
もよい。該有用物質は、形質転換体を培養することによ
り菌体内または菌体外に蓄積される。
する遺伝子が導入されたコリネホルム細菌を用いて生産
効率を上げることのできる有用物質としては、各種アミ
ノ酸の他、インターロイキン２、６等の生理活性物質で
もよい。該有用物質は、形質転換体を培養することによ
り菌体内または菌体外に蓄積される。
【００１７】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて具体的に説
明する。
明する。
【００１８】（遺伝子ライブラリーの作成）ブレビバク
テリウム属細菌およびブレビバクテリウム・フラバムよ
り、Saito-Miuraの方法(Biochim. Biophys. Acta, Vol.
8278 (1963) pp. 619-629)によって染色体ＤＮＡを調
製した。調製したＤＮＡ約100μgを10％から40％のシュ
ークロース・デンシティー・グラディエント・チューブ
に重層し220,000r. p. m.、22時間、20℃の条件下で超
遠心分離を行った。チューブの下に針で穴をあけ、1ml
ずつフラクショネーションし、約1,500から6,000bpの画
分を採取した。これをTEバッファー(10mM Tris, 1mM ED
TA, pH 8.0)に対し透析を行い、BamHIで切断したベクタ
ーpUC18とT4DNAリガーゼを用いて連結した。この溶液と
エシェリヒア・コリ JM109株を混合して該株の形質転
換を行った。その結果、約10,000クローンを持つ遺伝子
ライブラリーを作成した。
テリウム属細菌およびブレビバクテリウム・フラバムよ
り、Saito-Miuraの方法(Biochim. Biophys. Acta, Vol.
8278 (1963) pp. 619-629)によって染色体ＤＮＡを調
製した。調製したＤＮＡ約100μgを10％から40％のシュ
ークロース・デンシティー・グラディエント・チューブ
に重層し220,000r. p. m.、22時間、20℃の条件下で超
遠心分離を行った。チューブの下に針で穴をあけ、1ml
ずつフラクショネーションし、約1,500から6,000bpの画
分を採取した。これをTEバッファー(10mM Tris, 1mM ED
TA, pH 8.0)に対し透析を行い、BamHIで切断したベクタ
ーpUC18とT4DNAリガーゼを用いて連結した。この溶液と
エシェリヒア・コリ JM109株を混合して該株の形質転
換を行った。その結果、約10,000クローンを持つ遺伝子
ライブラリーを作成した。
【００１９】（プローブの作成）既に塩基配列の決定さ
れているシュークラーゼ（β-フルクトシダーゼ）遺伝
子には以下のものがある。バチルス・ズブチリス由来レ
バンシュークラーゼ、レバナーゼ、およびシュークラー
ゼ(Gene, Vol. 45 (1986) pp. 221-225)、バクテロイデ
ス・フラジリス (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 56
(1990) pp. 1944-1948)、ザイモモナス・モビリス (J.
Bacteriol., Vol. 172 (1990) pp. 6727-6735)、スト
レプトコッカス・ミュータンス由来シュークラーゼ(Inf
ect. Immun., Vol. 56 (1988) pp.1956-1960)、サッカ
ロミセス・セレビジエ由来インベルターゼ (Nucleic Ac
ids Res., Vol. 11 (1983) pp. 1943-1954)、ビブリオ
・アルジノリティカス由来シュークラーゼ(Gene Vol. 8
0 (1989) pp. 49-56)。これらの遺伝子の塩基配列には
相互に相同性のある部分があり(J. Bacteriol., Vol. 1
72 (1990) pp. 6727-6735)、この情報をもとに配列表の
配列番号１、２、３記載の配列を持つ合成ＤＮＡをＤＮ
Ａシンセサイザーを用いて合成し、プローブに供した。
れているシュークラーゼ（β-フルクトシダーゼ）遺伝
子には以下のものがある。バチルス・ズブチリス由来レ
バンシュークラーゼ、レバナーゼ、およびシュークラー
ゼ(Gene, Vol. 45 (1986) pp. 221-225)、バクテロイデ
ス・フラジリス (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 56
(1990) pp. 1944-1948)、ザイモモナス・モビリス (J.
Bacteriol., Vol. 172 (1990) pp. 6727-6735)、スト
レプトコッカス・ミュータンス由来シュークラーゼ(Inf
ect. Immun., Vol. 56 (1988) pp.1956-1960)、サッカ
ロミセス・セレビジエ由来インベルターゼ (Nucleic Ac
ids Res., Vol. 11 (1983) pp. 1943-1954)、ビブリオ
・アルジノリティカス由来シュークラーゼ(Gene Vol. 8
0 (1989) pp. 49-56)。これらの遺伝子の塩基配列には
相互に相同性のある部分があり(J. Bacteriol., Vol. 1
72 (1990) pp. 6727-6735)、この情報をもとに配列表の
配列番号１、２、３記載の配列を持つ合成ＤＮＡをＤＮ
Ａシンセサイザーを用いて合成し、プローブに供した。
【００２０】（ハイブリダイゼーション）作成した遺伝
子ライブラリーに対し上記プローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。方法はDerek Woodsの
方法(FOCUS, Vol. 6 (1984) pp. 1-4)に従った。ハイブ
リダイゼーションの温度は50℃,洗浄は48℃で行った。
各プローブと反応するクローンそれぞれをM9培地(Molec
ular Cloning second edition, Cold Spring Harbor Pr
ess (1989) Maniatis et. al. pp. A.3) 100mlに培養し
た。集菌した菌体を0.9% 生理食塩水で洗浄した後、5ml
の0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに懸濁し、超音波で
菌体を破砕した。33,000rpm、1時間遠心し、上澄を取っ
てクルード・イクストラクトとした。このクルード・イ
クストラクト150μlと0.5M シュークロース水溶液50μl
とを混合し、30℃、1時間反応させた後、100℃、3分加
熱して酵素を失活させた。生成したグルコースをグルコ
ースＣテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用い
て検出し、シュークラーゼ活性を測定した。配列表の配
列番号２に示したプローブによって検出されたクローン
の中の1つの株が明瞭なシュークラーゼ活性を示した
（表１）。表１には、1mg蛋白質あたりのシュークラー
ゼ活性（比活性）を示してある。シュークラーゼ活性を
示すこの株の持つプラスミドをpBS3-43と命名した。
子ライブラリーに対し上記プローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。方法はDerek Woodsの
方法(FOCUS, Vol. 6 (1984) pp. 1-4)に従った。ハイブ
リダイゼーションの温度は50℃,洗浄は48℃で行った。
各プローブと反応するクローンそれぞれをM9培地(Molec
ular Cloning second edition, Cold Spring Harbor Pr
ess (1989) Maniatis et. al. pp. A.3) 100mlに培養し
た。集菌した菌体を0.9% 生理食塩水で洗浄した後、5ml
の0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに懸濁し、超音波で
菌体を破砕した。33,000rpm、1時間遠心し、上澄を取っ
てクルード・イクストラクトとした。このクルード・イ
クストラクト150μlと0.5M シュークロース水溶液50μl
とを混合し、30℃、1時間反応させた後、100℃、3分加
熱して酵素を失活させた。生成したグルコースをグルコ
ースＣテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用い
て検出し、シュークラーゼ活性を測定した。配列表の配
列番号２に示したプローブによって検出されたクローン
の中の1つの株が明瞭なシュークラーゼ活性を示した
（表１）。表１には、1mg蛋白質あたりのシュークラー
ゼ活性（比活性）を示してある。シュークラーゼ活性を
示すこの株の持つプラスミドをpBS3-43と命名した。
【００２１】
【表１】
【００２２】（クローンの解析）得られたクローンか
ら、プラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片(11.6k
b)について制限酵素地図を作成した（図１）。さらに挿
入ＤＮＡの内6300bpのSmaI断片を切り出し、エシェリヒ
ア・コリとコリネホルム細菌のシャトルベクターである
pSAC4のSmaIサイトに導入したところ、このプラスミド
（pSSM30）はエシェリヒア・コリ中でシュークラーゼ活
性を発現することができた。また、プラスミドpSSM30を
保有するエシェリヒア・コリJM109(AJ12678)は、微工研
に寄託されており、受託番号FERM P-12821が付与されて
いる。
ら、プラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片(11.6k
b)について制限酵素地図を作成した（図１）。さらに挿
入ＤＮＡの内6300bpのSmaI断片を切り出し、エシェリヒ
ア・コリとコリネホルム細菌のシャトルベクターである
pSAC4のSmaIサイトに導入したところ、このプラスミド
（pSSM30）はエシェリヒア・コリ中でシュークラーゼ活
性を発現することができた。また、プラスミドpSSM30を
保有するエシェリヒア・コリJM109(AJ12678)は、微工研
に寄託されており、受託番号FERM P-12821が付与されて
いる。
【００２３】
【発明の効果】コリネホルム細菌に由来しシュークラー
ゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片、および該ＤＮＡ断片を含有するコリネホルム細菌内
で複製可能なプラスミドを取得し、該プラスミドをコリ
ネホルム細菌に導入し、該細菌のシュークロースを取り
込みグルコースとフラクトースに分解する活性を増強す
る。
ゼ活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片、および該ＤＮＡ断片を含有するコリネホルム細菌内
で複製可能なプラスミドを取得し、該プラスミドをコリ
ネホルム細菌に導入し、該細菌のシュークロースを取り
込みグルコースとフラクトースに分解する活性を増強す
る。
【図１】プラスミドpBS3-43に挿入されたＤＮＡ断片の
制限酵素地図。
制限酵素地図。
配列番号：1 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGCTGTTAA ATGACCCAAA TGGG 24 配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TACATGTGGG AATGCCCTGA TTTG 24 配列番号：3 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＡＴＣＡＡＧＧＴＴ ＴＴＧＡＴＴＴＴＴＡ ＣＧＣＧＣＣＧＣＡＡ
ＡＣＡ ３３
ＡＣＡ ３３
【手続補正書】
【提出日】平成４年３月６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】（ハイブリダイゼーション）作成した遺伝
子ライブラリーに対し上記プローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。方法はDerek Woodsの
方法(FOCUS, Vol. 6 (1984) pp. 1-4)に従った。ハイブ
リダイゼーションの温度は50℃,洗浄は48℃で行った。
各プローブと反応するクローンそれぞれをM9培地(Molec
ular Cloning second edition, Cold Spring Harbor Pr
ess (1989) Maniatis et. al. pp. A.3) 100mlに培養し
た。集菌した菌体を0.9% 生理食塩水で洗浄した後、5ml
の0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに懸濁し、超音波で
菌体を破砕した。33,000rpm、1時間遠心し、上澄を取っ
てクルード・イクストラクトとした。このクルード・イ
クストラクト150μlと0.5M シュークロース水溶液50μl
とを混合し、30℃、1時間反応させた後、100℃、3分加
熱して酵素を失活させた。生成したグルコースをグルコ
ースＣテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用い
て検出し、シュークラーゼ活性を測定した。配列表の配
列番号２に示したプローブによって検出されたクローン
の中の1つの株が明瞭なシュークラーゼ活性を示した
（表１）。表１には、1mg蛋白質あたりのシュークラー
ゼ活性（比活性）を示してある。シュークラーゼ活性を
示すこの株の持つプラスミドをpBS3-43と命名した。ま
た、プラスミドpBS3-43を保有するエシェリヒア・コリJ
M109(AJ12678)は、微工研に寄託されており、受託番号F
ERM P-12821が付与されている。
子ライブラリーに対し上記プローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。方法はDerek Woodsの
方法(FOCUS, Vol. 6 (1984) pp. 1-4)に従った。ハイブ
リダイゼーションの温度は50℃,洗浄は48℃で行った。
各プローブと反応するクローンそれぞれをM9培地(Molec
ular Cloning second edition, Cold Spring Harbor Pr
ess (1989) Maniatis et. al. pp. A.3) 100mlに培養し
た。集菌した菌体を0.9% 生理食塩水で洗浄した後、5ml
の0.1Mリン酸ナトリウムバッファーに懸濁し、超音波で
菌体を破砕した。33,000rpm、1時間遠心し、上澄を取っ
てクルード・イクストラクトとした。このクルード・イ
クストラクト150μlと0.5M シュークロース水溶液50μl
とを混合し、30℃、1時間反応させた後、100℃、3分加
熱して酵素を失活させた。生成したグルコースをグルコ
ースＣテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用い
て検出し、シュークラーゼ活性を測定した。配列表の配
列番号２に示したプローブによって検出されたクローン
の中の1つの株が明瞭なシュークラーゼ活性を示した
（表１）。表１には、1mg蛋白質あたりのシュークラー
ゼ活性（比活性）を示してある。シュークラーゼ活性を
示すこの株の持つプラスミドをpBS3-43と命名した。ま
た、プラスミドpBS3-43を保有するエシェリヒア・コリJ
M109(AJ12678)は、微工研に寄託されており、受託番号F
ERM P-12821が付与されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】（クローンの解析）得られたクローンか
ら、プラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片(11.6k
b)について制限酵素地図を作成した（図１）。さらに挿
入ＤＮＡの内6300bpのSmaI断片を切り出し、エシェリヒ
ア・コリとコリネホルム細菌のシャトルベクターである
pSAC4のSmaIサイトに導入したところ、このプラスミド
（pSSM30）はエシェリヒア・コリ中でシュークラーゼ活
性を発現することができた。
ら、プラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片(11.6k
b)について制限酵素地図を作成した（図１）。さらに挿
入ＤＮＡの内6300bpのSmaI断片を切り出し、エシェリヒ
ア・コリとコリネホルム細菌のシャトルベクターである
pSAC4のSmaIサイトに導入したところ、このプラスミド
（pSSM30）はエシェリヒア・コリ中でシュークラーゼ活
性を発現することができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (3)
- 【請求項１】コリネホルム細菌由来で、図１に示す制限
酵素切断部位を有する、シュークラーゼ活性を持つ蛋白
質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項２】請求項１記載のＤＮＡ断片を含有するコリ
ネホルム細菌内で複製可能なプラスミド。 - 【請求項３】請求項２記載のプラスミドを保有するコリ
ネホルム細菌。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04683692A JP3298135B2 (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子 |
| US08/311,174 US5556776A (en) | 1992-03-04 | 1994-09-23 | Sucrase gene derived from coryneform bacteria |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04683692A JP3298135B2 (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子 |
| US08/311,174 US5556776A (en) | 1992-03-04 | 1994-09-23 | Sucrase gene derived from coryneform bacteria |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244958A true JPH05244958A (ja) | 1993-09-24 |
| JP3298135B2 JP3298135B2 (ja) | 2002-07-02 |
Family
ID=26386975
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04683692A Expired - Fee Related JP3298135B2 (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5556776A (ja) |
| JP (1) | JP3298135B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2729970A1 (fr) * | 1995-01-30 | 1996-08-02 | Ajinomoto Kk | Fragment d'adn, vecteur, bacterie coryneforme et procede de production de l-aminoacides ou d'acides nucleiques les utilisant |
| WO2001025447A1 (fr) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene enzymatique du systeme de biosynthese d'acide amine thermophile |
| US6893852B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-05-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Dna encoding sucrose pts enzyme II |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2010088301A (ja) * | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5284757A (en) * | 1989-01-12 | 1994-02-08 | Ajinomoto Company, Inc. | Process for producing l-arginine by fermentation with brevibacterium or corynebacterium |
| DE4208785A1 (de) * | 1992-03-19 | 1993-09-23 | Degussa | Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen |
-
1992
- 1992-03-04 JP JP04683692A patent/JP3298135B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-23 US US08/311,174 patent/US5556776A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2729970A1 (fr) * | 1995-01-30 | 1996-08-02 | Ajinomoto Kk | Fragment d'adn, vecteur, bacterie coryneforme et procede de production de l-aminoacides ou d'acides nucleiques les utilisant |
| EP0724017A3 (en) * | 1995-01-30 | 1997-09-17 | Ajinomoto Kk | Coryneform bacteria sucrase gene |
| US6893852B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-05-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Dna encoding sucrose pts enzyme II |
| WO2001025447A1 (fr) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene enzymatique du systeme de biosynthese d'acide amine thermophile |
| US6995250B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Thermophilic amino acid biosynthesis system enzyme gene of thermotolerant coryneform bacterium |
| US7125977B2 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
| US7183403B2 (en) | 1999-10-04 | 2007-02-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3298135B2 (ja) | 2002-07-02 |
| US5556776A (en) | 1996-09-17 |
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