JPH0523740B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なキトサナーゼ生産菌、さらに詳
しくは、医薬品などに有用な低分子化キトサンの
製造に好適に用いられる高活性キトサナーゼを生
産するプソイドモナス属に属する新規なキトサナ
ーゼ生産菌に関するものである。 従来の技術 近年、未利用海洋資源の１つとして、キチン、
キトサンが注目を浴びている。キチンは海洋バイ
オマスのカニ殻やエビ殻に含まれるアミノ糖から
成る塩基性多糖類の１種であり、キトサンはこの
キチンの脱アセチル化物であつて、ある種のカビ
にも高含量で含まれている。その用途としては、
例えば酵素などの固定化用担体、生分解性フイル
ムの原料、金属の選択的吸着剤、有機物の凝固剤
などが注目され、一部はすでに商品化されてい
る。 そして、そのキトサンの低分子化されたオリゴ
糖についても植物病原菌の生育阻害剤、核酸・エ
ンドトキシン除草剤など、様々の分野での応用が
脚光を浴びており、さらに、キトサンの各種重合
度の低分子化物については、種々の生理活性の効
果が期待されている。 このようなキトサン低分子化物の製法として
は、例えば、キトサン分解菌による分解法や化学
薬品を用いる方法などがあるが、キトサンの加水
分解酵素であるキトサナーゼを用いる酵素法が副
反応の防止などの点で有効である。 該キトサナーゼを生産する菌としては、これま
で例えばバチルスサーキユランス
（Bacilluscirculans）LCCー１株やアルカリゲネ
ス（Alcaligenes）MHK−１株やシユードモナ
ス（Pseudomonas）MP−1d株など数菌株が知
られている［（特公昭62−201571号公報、63−
94971号公報、平１−104158号公報）、「キチン・
キトサンの開発と応用」171〜176ページ（1987年
工業技術会刊行）］。しかしながら、これらの菌株
が生産するキトサナーゼは、その活性などについ
ては必ずしも十分に満足しうるものではなかつ
た。 発明が解決しようとする課題 本発明は、従来のキトサナーゼ生産菌が生産す
るキトサナーゼとは異なる性質を有し、低分子化
キトサンの製造に好適に用いられる高活性のキト
サナーゼを生産する新規な微生物を提供すること
を目的としてなされたものである。 課題を解決するための手段 本発明者らは、前記目的を達成するために、キ
トサナーゼを生産する微生物を自然界より広く検
索した結果、従来公知のキトサナーゼ生産菌とは
異なるプソイドモナス属の特定の細菌が、キトサ
ンを効率よく分解しうる高活性キトサナーゼを著
量生産しうることを見い出し、この知見に基づい
て本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、プソイドモナス菌
（Pseudomonas）Ｈ−14株（微工研菌寄第11143
号）から成るキトサナーゼ生産菌を提供するもの
である。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明のキトサナーゼ生産菌は、種々の土壌を
スクリーニングし、次に示す方法により分離し
た。すなわち、キトサン２重量％、KH₂PO₄0.1
重量％、寒天1.5重量％を含有する平板培地上に、
土壌試料懸濁液を画線し、30℃の温度で７日間培
養したのち、ハローを形成するコロニーを採取
し、次いで、このコロニーを再び前記と同様にし
て培養する操作を繰り返すことにより、純粋菌株
を分離した。このようにして得られた菌株は、前
記分離の際に用いた組成の斜面培地に移植し、30
℃の温度において７日間培養したのち、５℃の温
度にて保存した。なお、継代移植は３か月毎に、
新鮮な培地に植え継ぐことにより行つた。 本発明のプソイドモナス菌Ｈ−14株は、次に示
す菌学的性質を有している。なお、菌学的諸性質
の試験は、エス・テー・コーワンの「マニユア
ル・フオー・ザ・アイデンテイフイケーシヨン・
オブ・メデイカル・バクテリア」〔“Manual for
the Identification of Medical Bacteria”
（Cambridge University Press）〕及び「バージ
ーズ・マニユアル・オブ・システマテツク・バク
テリオロジー、第１巻（1984年）」〔“Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology，Volum
１（1984）”〔Williams＆Wilkins）〕に基づいて行
つた。 １ グラム染色：陰性 ２ 形態的性質：大きさ0.8〜1.9μmの桿菌。単極
毛で運動する。菌は無色で、肉汁寒天培地上で
は光沢がある。 ３ 生理的性質： (1) 酵素を要求する絶対好気性菌である。 (2) 生育PH：4.0〜8.8、生育最適PH：6.7 (3) 生育温度：13〜38℃、 生育最適温度：30℃ (4) オキシダーゼ反応：弱陽性 (5) 生育に12％以上のNaCを要求しない。 (6) エタノールから酢酸の生産は認められない。 (7) 窒素の固定はしない (8) カタラーゼを産生する (9) 炭水化物を酸化的に分解するグルコースより
酸を生成するもガスは発生しないキシロースと
ラクトースより酸を生成せず、ガスも発生しな
い (10) グルコース、グリセロール、クエン酸、酢
酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などを唯一の炭素
源として利用する (11) キチンは炭素源としても窒素源としても利用
できない (13) システインや鉄塩を要求しない 以上の菌学的諸性質より、前記文献の分類方法
により本菌株の同定を行つた結果、プソイドモナ
ス（Pseudomonas）属に属することを認め、本
菌株をプソイドモナスＨ−14と命名した。 次に、本発明の菌株より生産されるキトサナー
ゼの理化学的性質を下記に示す。 作用：キトサンに作用し、これを分解する。 作用PH：3.0〜7.0（至適PH：4.0） PH安定性：25℃で５時間処理した場合、PH4.0〜
7.0で100％の残存活性を示す 温度安定性：25℃で18時間以上処理した場合、90
％以上の残存活性を示す なお、本発明で得られるキトサナーゼは、培養
液中に分泌生産されるで、ろ過、あるいは遠心分
離などの操作で菌体を除いた培養液をそのまま酵
素液として使用することができる。また、キトサ
ナーゼを単離する場合は、通常の精製手段、例え
ば塩析法、溶媒沈殿処理法、電気泳動法、ゲルろ
過法などにより、容易に高純度の標品を得ること
ができる。 発明の効果 本発明のプソイドモナス菌Ｈ−14株は、高活性
のキトサナーゼを著量生産しうる新規なプソイド
モナス属に属する細菌であつて、この細菌から得
られるキトサナーゼは、キトサンを高効率で低分
子化キトサンに分解することができる。この低分
子化キトサンは種々の生理活性を有することか
ら、例えば医薬品や農薬などとして有用である。 実施例 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらの例によつてなんら限定
されるものではない。 実施例 １ まず、キトサン0.2重量％、KH₂PO₄0.031重量
％、Na₂HPO₄0.17重量％、MgSO₄・7H₂O0.05重
量％より成る培地を、4N NaOH水溶液でPH6.5
とし、その100mlを500ml容三角フラスコに分注
し、オートクレーブ滅菌したのち、これに、保存
培地から、プソイドモナスＨ−14株（FERM Ｐ
−11143）を一白金耳量接種し、28℃で６日間培
養した。 培養中、適宜３mlの培養液を無菌的に抜きとり
遠心分離で菌体を除いた上澄液を粗キトサナーゼ
液として採取した。 この粗キトサナーゼ液を適宜希釈したもの0.25
mlに、0.5重量％のキトサン液（PH４の酢酸ナト
リウムバツフアに溶解したもの）0.25mlを加え、
30℃で20分間反応させた。 反応終了後、反応後のキトサナーゼ活性を測定
した。なお、キトサナーゼ活性は、全還元糖をソ
モギーネルソン法〔「還元糖の定量法」第10〜12
ページ（1969年東大出版会刊行）〕にて定量する
ことにより測定し、また、還元糖量は、グルコサ
ミンを標準物質として作成した検量線から求め
た。キトサナーゼ活性１単位（Unit）とは、上
記の条件下、１分間に1μモルのグルコサミンに
相当する還元糖を生成させる酵素量をいう。 培養中のキトサナーゼの生産経過を次表に示
す。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プソイドモナス菌（Pseudomonas）Ｈ−14
   株（微工研菌寄第11143号）から成るキトサナー
   ゼ生産菌。