JPH05236933A

JPH05236933A - 巨大核酸試料調製装置

Info

Publication number: JPH05236933A
Application number: JP4525892A
Authority: JP
Inventors: Katsuji Murakawa; 克二村川; Kazuhiko Kawasaki; 川崎　　和彦; Hideki Kanbara; 秀記神原
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1992-03-03
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1993-09-17

Abstract

(57)【要約】【目的】染色体あるいは、染色体の一部をなす、蛋白質
等との複合体を含む巨大核酸試料を迅速に分取する。【構成】固体表面１に目的とする核酸試料を包含する形
状の凹部２を設け、この固体表面上で核酸試料を含む液
を緩やかに揺動，撹拌して目的とする核酸試料を選択的
に凹部２の内部に捕捉する。【効果】染色体あるいは、染色体の一部をなす、蛋白質
等との複合体を含む巨大核酸試料を、高価な装置を使用
することなく、熟練を必要とせずに、迅速に分取するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は巨大核酸試料の分離をお
こなう巨大核酸試料調製装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞から目的とする染色体あるいは、染
色体の一部をなす巨大核酸試料を分取するには、顕微鏡
下で観察しながらマイクロマニュピレータを用いて、染
色体を一つずつ分離する方法の他、細胞分取用装置（セ
ルソータ）を用い、蛍光色素で標識した染色体を、その
形状の差による蛍光強度等の違いを利用して分離する方
法（文献１：サイトメトリ１１(１９９０年)５４０頁か
ら５４２頁(Cytometry１１（１９９０）、ｐｐ５４０−
５４２））、あるいは、顕微鏡下で目的とする染色体の
領域を残し、そのほかの領域をレーザ光で焼き切るレー
ザマイクロダイセクション法（文献２：ジエノミックス
１０（１９９０年）１０５３頁から1054頁（ＧＥＮＯＭ
ＩＣＳ１０（１９９０）ｐｐ１０５３−１０５４））
などがある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のいずれの方法
も、巨大核酸試料の作業操作を試料一個ずつ行うため、
処理速度が極めて遅い。例えば、最も処理速度が速いセ
ルソータを用いる方法でも、制限酵素による分析に必要
とされる百万個の染色体を得るのに、約１週間の時間が
必要であった。

【０００４】また、顕微鏡下で巨大核酸試料を観察する
場合、巨大核酸試料の分子の方向が一定でないため、目
視による巨大核酸試料の同定は容易でなく熟練が必要で
あった。巨大核酸試料の同定を自動的に行なうには高価
な画像処理装置が必要であった。

【０００５】本発明の目的は、染色体あるいは、染色体
の一部に代表される、蛋白質等との複合体を含む巨大核
酸試料を簡便，迅速に分取，分別分析することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の目的のために、固
体表面上に設けられ、巨大核酸試料の少なくとも一部を
包含する形状を有する凹部の内部に巨大核酸試料の少な
くとも一部を捕捉する。この凹部は、複数のほぼ平行な
直線状をなす溝、２本の直線状の溝とこれを連結する複
数の短い溝から形成される梯子状の溝、ほぼ平行な複数
の直線状の溝が異なる二つの方向に形成されこれら２群
の溝が交差して形成される斜めの格子状をなす溝等によ
って一定の規則をもった配置で形成される。また、異な
る種類の巨大核酸試料を捕捉するために異なる形状の凹
部が複数個形成され、凹部の底部に固体を貫通する細孔
を有している。さらに巨大核酸試料をフロー系で捕捉，
回収するために、凹部を固体表面に設けた流路の底部に
形成する。このように巨大核酸試料分子が選択的に入り
うる凹部を有する固体を用いて目的試料を捕捉する。

【０００７】

【作用】固体表面に目的とする巨大核酸試料を包含する
形を有する複数の凹部を設け、目的とする巨大核酸試料
を含む試料を緩衝液等の液体とともに凹部の上に注ぎ緩
やかに揺動し撹拌することにより、目的とする巨大核酸
試料が選択的に凹部に捕捉できる。凹部を多数設けるこ
とにより、同時に多数の巨大核酸試料を凹部に捕捉する
ことができる。また、固体表面に、異なる形状の凹部を
複数個設け、これにより異なる種類の巨大核酸試料を各
々選択的に凹部に捕捉することができる。さらに、凹部
を流路中に設け、目的とする巨大核酸試料をフロー系で
捕捉，回収することができる。凹部は一定の規則をもっ
た配置で形成されるので、巨大核酸試料は一定の配向で
凹部に捕捉される。

【０００８】

【実施例】本発明の実施例１を図１から図４を用いて説
明する。染色体あるいは、染色体の一部をなす、蛋白質
等との複合体を含む巨大核酸試料（以下実施例では単に
核酸試料と略記する）を分取，分別分析する巨大核酸試
料調製装置は、シリコンウエハ１の表面上に、エッチン
グにより凹部２を設け構成される。凹部はシリコンウエ
ハ１の表面上に２次元的に一定の規則をもって区画され
配列されて形成され、一つの区画には一つの凹部が存在
する。凹部の形状はその長さ，幅，深さを任意にするこ
とができる。

【０００９】図１，図２では凹部２の形状はＸ字状であ
り、長さは３.８μｍ、幅は３.４μｍである。核酸試料
４ａが凹部２に捕捉された状態の拡大平面図を図２に示
す。図２のＡＢ部の拡大断面図を図３に示す。溝の深さ
は１.５μｍ、溝の幅は1.5μｍである。

【００１０】この巨大核酸試料調製装置を用いた試料調
製の手順を図４に示す。図１に示すような複数の凹部２
を有するシリコンウエハ１を細胞培養用カルチャープレ
ート３の底に固定する。細胞より調製した形状の異なる
複数の核酸試料４ａ，４ｂ…（図４では単純化して核酸
試料４ａ，４ｂをそれぞれ１個のみを示してある）を含
む緩衝液５をシリコンウエハ１上に注ぐ。核酸試料中の
目的とする核酸試料４ａの数はこの核酸試料４ａを包含
する形状を有する凹部２の数よりも大過剰になるように
加える（図４（Ａ））。シェーカ上にカルチャープレー
ト３をのせ緩やかに核酸試料を含む緩衝液を揺動させ撹
拌する。撹拌操作中に凹部２には、図２及び図３に示す
ように核酸試料中の目的とする核酸試料４ａが凹部の内
部に捕捉される（図４（Ｂ））。一定時間の撹拌の後に
凹部２に捕捉されなかった核酸試料４ｂを緩衝液５と共
に除去する（図４（Ｃ））。

【００１１】以上の手順により目的とする核酸試料４ａ
が２次元的に規則をもって区画され配列された凹部２の
内部に捕捉され、この状態の核酸試料４ａを顕微鏡を用
いた観察，制限酵素反応，プローブのハイブリダイズ等
の目的に使用することが可能である。必要があれば捕捉
された核酸試料４ａの回収は、シリコンウエハ１上にあ
らたに緩衝液を加え、捕捉時よりも撹拌を激しく行なう
か、または、緩衝液中でシリコンウエハ１の凹部を有す
る面を下にして撹拌を行い、凹部２から核酸試料４ａを
遊離させて回収する。

【００１２】本実施例では、凹部２の形状に近い小型の
ヒト染色体２１番，２２番，Ｙ染色体を選択的に捕捉で
きる。形成した凹部２の数に応じて、同時に多数の核酸
試料が得られる。得られた核酸試料は、シリコンウエハ
上の凹部に捕捉された状態で、顕微鏡を用いた観察，制
限酵素反応，プローブのハイブリダイズ等を行なうこと
が可能であり、これらに関連する種々の作業（たとえ
ば、核酸試料が凹部に捕捉されたシリコンウエハを直
接、顕微鏡の観察台に搭載したり、種々の反応液中に入
れ核酸試料に反応を生じさせる等）の操作性が向上す
る。

【００１３】顕微鏡を用いた観察の場合、さらに具体的
にいえば、２次元的に規則をもって区画され配列されて
形成された凹部２の内部に核酸試料を捕捉できるので、
レーザによる核酸試料の一部の切り出し等の物理的操作
に必要な位置決めに関する操作性が向上する。

【００１４】本発明の実施例２を図５を用いて説明す
る。本実施例の巨大核酸試料調製装置は、シリコンウエ
ハ１０上に、エッチングにより異なる形状を持つ凹部１
１，１２をそれぞれ複数ずつ設ける。凹部１１の長さは
１９μｍ、幅は４.０μｍ、凹部１２の長さは３.８μ
ｍ、幅は３.４μｍである。溝の幅は１.６μｍ、深さは
１.６μｍである。凹部１１，１２はそれぞれ２次元的
に規則をもって区画され配列されて形成される。

【００１５】本実施例による巨大核酸試料調製装置の使
用により、異なる種類，形状の核酸試料を同時に分取で
きる。すなわち、凹部１１で小型のヒト染色体２１番，
２２番，Ｙ染色体，凹部１２で大型の染色体１番，２番
をそれぞれ同時に選択的に異なる凹部の内部に捕捉でき
る。

【００１６】以上の実施例は主として核酸試料の分取を
目的とするものである。核酸試料の分析など以下で説明
する他の目的に対しては、次に説明する実施例３から実
施例５に示す形状の凹部を使用できる。

【００１７】本発明の実施例３を図６を用いて説明す
る。本実施例では、シリコンウエハ１５上に、複数のほ
ぼ平行な直線状の溝からなる凹部１６を設ける。凹部１
６の溝の幅は１.８μｍ、深さは１.６μｍ、２本の溝の
間隔は０.６μｍである。図７は図６のＡＢ部の断面図
である。

【００１８】核酸試料１７の交差している部分（セント
ロメア）は溝１７の内部に捕捉されないが、核酸試料１
７の少なくともその一部は、図６および図７に示すよう
に凹部１６に捕捉される。その結果、核酸試料１７は溝
の長手方向に配向させることができ、本実施例では、核
酸試料の向きを溝の長手方向に揃えることができる。

【００１９】本発明の実施例４を図８を用いて説明す
る。本実施例では、シリコンウエハ２０上に２本の直線
状の溝２１とこれを連結する複数の溝２２から構成され
る梯子状の溝である凹部２３を設ける。凹部２３の溝２
１の幅は１.６μｍ、深さは１.６μｍ、溝２２の長さは
１.０μｍ、幅は2.0μｍ、深さは１.６μｍである。二
つの凹部２３の間隔は２０μｍである。本実施例では、
核酸試料２４は凹部２３に捕捉される。このとき、核酸
試料２４の交差している部分（セントロメア）２４ａは
溝２１を連結する溝２２の位置に固定される。その結
果、交差している部分を持つ核酸試料を凹部の特定位
置、溝２１を連結する溝２２の位置にセントロメアを包
含して捕捉できる。

【００２０】本発明の実施例５を図９を用いて説明す
る。本実施例はシリコンウエハ３０上に、ほぼ平行な複
数の直線状の溝が、異なる二つの方向に形成され、これ
ら２群の溝が交差して形成される、斜めの格子状をなす
溝で形成した凹部３１を設ける。凹部３１の溝の幅は
１.６μｍ、深さは1.6μｍ、隣あう溝の間隔は１０μｍ
である。本実施例では、核酸試料３２は凹部３１に捕捉
される。核酸試料３２の交差している部分（セントロメ
ア）３２ａを、溝がなす格子の交差している位置３３に
包含することができる。その結果、交差している部分を
持つ核酸試料を凹部の特定位置，溝がなす格子の交差し
ている位置３３で捕捉できる。

【００２１】以上の実施例３から実施例５では、任意の
核酸試料を溝の配置される形状にしたがって捕捉するこ
とができ、このような核酸試料の捕捉状態で、任意の核
酸試料の顕微鏡下での観察を容易にできる。核酸試料の
大きさの測定や、レーザによる核酸試料の一部の切り出
し等の物理的操作に必要な位置決めに関する操作性が向
上する。

【００２２】本発明の実施例６を図１０を用いて説明す
る。本実施例は、底部に凹部をもつ流路を有する巨大核
酸試料調製装置を示し、凹部が流路中に形成されている
ものである。

【００２３】目的とする小型の染色体を包含しうる形状
を持つ凹部４０をシリコンウエハ４１の表面に設けた流
路４２の底部に設ける。流路４２に異なる種類の染色体
の混合物である核酸試料を緩衝液と共に導入する。シリ
コンウエハ４１上の凹部４０には混合物試料中の小型の
核酸試料４３ａが捕捉される。その他の染色体４３ｂは
捕捉されない。流路４２に緩衝液を流して捕捉されなか
ったその他の染色体４３ｂを通過させた後、流路４２に
緩衝液を流速をあげて流し凹部４０から捕捉されている
小型の染色体４３ａを回収する。なお、説明のため図１
０中の凹部４０一個の大きさは図１と同様に実際よりも
大きく描いてある。

【００２４】本実施例における凹部は、実施例２と同様
に異なる形状の凹部の組合せ、実施例３から実施例５で
説明した形状の凹部でもよい。本実施例では、核酸試料
の供給，回収等の操作を流路を利用して行うことができ
る。

【００２５】実施例１から実施例６では、凹部を設ける
担体としてシリコンウエハを使用したが、凹部を設ける
担体の材料，形状を限定するものではなく、シリコンウ
エハのかわりにセラミックス等の多孔質材料を用いても
よい。あるいは、図１１に示す実施例７のように凹部５
０の底部に緩衝液を抜くための細孔５１を担体５２を貫
通して設け、核酸試料を緩衝液と共に流路に導入し、細
孔５１を通過する緩衝液の流れに核酸試料をのせて凹部
５０に核酸試料を捕捉しやすくするようにしてもよい。

【００２６】目的とする核酸試料よりもサイズの小さな
核酸試料がサイズの大きい凹部に捕捉されることがある
が、目的とする核酸試料を十分濃縮することができる。

【００２７】また、凹部を必ずしもシリコンウエハのよ
うな平板上に形成する必要はなく、たとえば、凹部を粒
子表面上に設けてもよい。この粒子をカラムに充填し、
核酸試料を緩衝液と共にカラムに導入し、カラムクロマ
トグラフィーの手法を用いて試料を展開することによ
り、たとえば染色体の大小が分離されてカラムから溶出
して、染色体の大小を分別する分離分析ができる。

【００２８】核酸試料の形状は、試料を細胞から調製す
る時期（細胞分裂の時期），試料の周囲の水素イオン濃
度，共存するイオン等の条件により大きく変化する。し
たがって、試料調製時の条件によって核酸試料の形状は
異なるので、試料調製時の条件のもとで予め目的とする
核酸試料の形状を確認しておき、この形状を包含するよ
うに凹部の形状を巨大核酸試料調製装置に形成してお
く。したがって、試料調製時の条件と目的とする核酸試
料の形状が同じである場合には同じ凹部の形状を有する
巨大核酸試料調製装置を再使用することができる。逆
に、核酸試料の周囲の水素イオン濃度、共存するイオン
等の条件を変化させることにより核酸試料の形状を変化
させ、特定の条件下で核酸試料を凹部に捕捉し、凹部よ
り核酸試料を回収することも可能である。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、染色体あるいは、染色
体の一部をなす、蛋白質等との複合体を含む巨大核酸試
料を、簡便に、大量かつ迅速に分取，分別することがで
きる。また、試料調製に際し高価な装置が不要であり、
熟練を要する顕微鏡下の作業を軽減することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１の巨大核酸試料調製装置の平
面図。

【図２】本発明の実施例１の巨大核酸試料調製装置の凹
部に試料が捕捉された状態を示す平面図。

【図３】本発明の実施例１の巨大核酸試料調製装置の凹
部に試料が捕捉された状態を示す断面図。

【図４】本発明の実施例１の巨大核酸試料調製装置を用
いた試料調製の手順を示す説明図。

【図５】本発明の実施例２の異なる形状の凹部を有する
巨大核酸試料調製装置の平面図。

【図６】本発明の実施例３の直線上の溝からなる凹部を
有する巨大核酸試料調製装置の凹部に試料が捕捉された
状態を示す平面図。

【図７】本発明の実施例３の巨大核酸試料調製装置の凹
部に試料が捕捉された状態を示す断面図。

【図８】本発明の実施例４の梯子状の溝からなる凹部を
有する巨大核酸試料調製装置の凹部に試料が捕捉された
状態を示す平面図。

【図９】本発明の実施例５の斜めの格子状の溝からなる
凹部を有する巨大核酸試料調製装置の凹部に試料が捕捉
された状態を示す平面図。

【図１０】本発明の実施例６の底部に凹部をもつ流路を
有する巨大核酸試料調製装置の平面図。

【図１１】本発明の実施例７の凹部の底部に担体を貫通
する細孔を有する巨大核酸試料調製装置の断面図。

【符号の説明】

１…シリコンウエハ、２…凹部。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固体表面上に設けられ、巨大核酸試料の少
なくとも一部を包含する形状を有する凹部の内部に前記
巨大核酸試料の少なくとも一部を捕捉することを特徴と
する巨大核酸試料調製装置。
【請求項２】請求項１において、複数のほぼ平行な直線
状をなす溝により前記凹部が形成されている巨大核酸試
料調製装置。
【請求項３】請求項１において、２本の直線状の溝とこ
れを連結する複数の溝から形成される梯子状の溝により
前記凹部が形成され、前記梯子状の溝を複数個有する巨
大核酸試料調製装置。
【請求項４】請求項１において、ほぼ平行な複数の直線
状の溝が異なる二つの方向に形成されこれら２群の溝が
交差して形成される斜めの格子状をなす溝により前記凹
部が形成されている巨大核酸試料調製装置。
【請求項５】請求項１において、前記凹部が一定の規則
をもって前記固体表面上に複数個の区画に設けられ、こ
の一区画にある凹部の形状が巨大核酸試料の１個の形状
を包含する形状であり、前記凹部がこの巨大核酸試料の
１個を捕捉する巨大核酸試料調製装置。
【請求項６】請求項５において、異なる形状の凹部を複
数個有する巨大核酸試料調製装置。
【請求項７】請求項１，２，３，４，５または６におい
て、前記凹部の底部に前記固体を貫通する細孔を有する
巨大核酸試料調製装置。
【請求項８】請求項１，２，３，４，５，６，７または
８において、前記凹部を前記固体表面に設けた流路の底
部に形成する巨大核酸試料調製装置。
【請求項９】請求項１，２，３，４，５，６，７または
８において、前記固体がシリコンウエハである巨大核酸
試料調製装置。