JPH0523196A - ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体およびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトグリセンチンに対するモノクローナル抗
体の調製と、ヒトグリセンチンの定量法に関する。 【構成】 ヒトグリセンチンで免疫感作させた抗体産生
細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて得られるハイブリ
ドーマから目的のモノクローナル抗体が得られる。この
ようにして得られるモノクローナル抗体または別途調製
したポリクローナル抗体を固相化し、グリセンチン検体
と反応させ、さらに固相化した抗体とは認識部位を異に
する抗体であって標識化されたものを反応させることに
より、グリセンチン検体中のグリセンチンを定量するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトグリセンチンと特
異的に反応するモノクローナル抗体、そのモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞、およびグリセン
チンに対する抗体を用いる免疫定量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物の膵臓中のランゲルハンス島Ａ細胞
から分泌され、肝臓などの細胞膜のアデニル酸シクラー
ゼ系を活性化することが知られている２９個のアミノ酸
残基から構成されるポリペプチドホルモンであるグルカ
ゴンの研究から、Sundby, F.らはブタ小腸抽出物よりグ
ルカゴン抗体に対する抗原性を有する大分子量のポリペ
プチドを単離し、これをグリセンチンと命名した〔Sund
by，F. et. al., Horm.Metab. Res., Vol. ８，３６６
〜３７１（１９７６）〕。続いて Thim. L. および Moo
dy, A. J. はその構造決定を行なってこのグリセンチン
が６９個のアミノ酸残基から構成され、その３３〜６１
番のアミノ酸配列はグルカゴンと同一の配列であること
を解明した〔Regulatory Peptides, Vol. ２：１３９
（１９８１）〕。このようにしてブタのグリセンチンの
精製と構造の解明はなされたが、ブタのグリセンチンが
ブタの小腸に存在することからヒトにも存在することが
予想されるヒト型グリセンチンについては抽出のための
原材料すなわちヒトの腸管の材料の入手の困難性からこ
れまでに精製物として生体由来のものは単離されたこと
はなく、そしてこの単離が困難であった事情などから、
ヒト型グリセンチンの生理活性はいまだ解明されていな
い。

【０００３】ところで、Bell, G.I. らはハムスターの
プレプログルカゴンのｃＤＮＡをヒト遺伝子のＥｃｏＲ
Ｉ分解物とハイブリダイズする手法でヒトプレプログル
カゴン遺伝子の配列を推定し、同遺伝子のエクソン部分
の構造からヒト型グリセンチンのアミノ酸配列を解明し
た〔Nature, Vol. ３０４，３６８〜３７０（１９８
３）〕。

【０００４】このような経緯によってその化学構造が解
明された、腸管グルカゴンの１種であるヒトグリセンチ
ンは、その構造内にグルカゴンの全構造を含むアミノ酸
残基６９のポリペプチドである。そして一般的にグルカ
ゴンと呼ばれる膵グルカゴンは、糖代謝に重要な作用を
持つホルモンで、インシュリンに拮抗して血糖値を上昇
させる事が古くから知られている。

【０００５】空腸切除ラットでは腸絨毛が代償的に肥厚
することが知られており、この時に血中エンテログルカ
ゴン値の上昇がみられる。また摂食による腸細胞増殖の
際にもエンテログルカゴン値が上昇することから、細胞
増殖因子または栄養因子の可能性が考えられている。一
方グルカゴンと同様に血中インシュリン濃度を調節して
いる可能性も報告されている。そこで生体でのグリセン
チンの作用および消化器疾患または糖尿病との関わりを
理解するために、グリセンチンを特異的に定量する事は
医学上非常に重要である。

【０００６】従来行われているグリセンチンの定量法と
して、グリセンチンまたはその一部の構造に対する抗血
清を用いたラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ法）があ
る。この方法では、一種類の抗血清（ポリクローナル抗
体）を単独に使用しているために、抗体と交差反応を示
すすべての物質が検出されたり、あるいは非特異的干渉
の影響が大きく、グリセンチンを正確に定量することが
できない難点がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記した抗血清を用い
るヒトグリセンチンのＲＩＡ法による定量法では、用い
た抗血清と共通の抗原認識部位、あるいは類似の構造を
持つグルカゴン類縁物質が交差反応を起こすために、必
ずしも正確な検出および定量が行われなかった。さらに
は放射性物質を使用しなければならず、施設や廃棄物等
の問題があった。これらとは別に、ヒトグリセンチンに
対する力価の高い抗血清を安定して得ることの困難さが
あった。すなわち、抗Ｎ末端抗体を用いた場合では、グ
リセンチンのＮ末端領域１−３０と構造が同じGlicenti
n-related pancreatic peptide（ＧＲＰＰ）が反応する
ことになりその定量結果に正確性を欠く他にＲＩＡ法固
有の上記した問題点があった。

【０００８】またヒトグリセンチンの定量に抗Ｃ末端抗
体を用いようとする場合には、グリセンチン３３−６９
に相当する構造のオキシントモジュリンが抗体と反応す
ることになり、その定量結果の信頼性を低下させる他
に、グリセンチンとオキシントモジュリンには共通であ
るが、グルカゴンには含まれていないＣ末端領域に対す
る抗血清を得ることは極めて困難である事情があり、抗
Ｃ末端抗体を用いる定量法にも問題があった。

【０００９】ところでヒトグリセンチンが生体内におい
て果たしているであろう作用を理解するためには、生体
内におけるヒトグリセンチンを他のグルカゴン類縁物質
と区別して定量することが必須な課題であり、しかして
この定量法が簡便なものであり、また放射性物質を使用
することなく、そしてヒトグリセンチンを特異的に定量
することが求められるのである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記した課
題を解決するために鋭意研究した結果、ヒトグリセンチ
ンの各領域を認識するモノクローナルおよびポリクロー
ナル抗体を作成し、それらを組み合わせることによって
ヒトグリセンチンを特異的に定量しうることを見出して
本発明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明の第１の発明はヒトグリ
センチンに対するモノクローナル抗体に関し、また第２
の発明はヒトグリセンチンの免疫測定法に関するもので
ある。

【００１２】本発明者らは、ヒトグリセンチンの特異的
な免疫測定法の過程において、グリセンチンに対するモ
ノクローナル抗体を得たが、これまでＣ末端領域に対す
る抗血清は偶然に任せる以外得ることが出来なかったも
のが、その領域に対するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞を用いることによって、抗体が安定
して得られるようになった。

【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる
細胞融合法によって製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリドーマを形成さ
せ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒトグリセンチ
ンに対し特異性を示す抗体を産生するクローンを選択す
ることによって製造される。ここで使用される抗体産生
細胞には、例えばグリセンチンによって免疫された動物
からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球などがある。

【００１４】抗体産生細胞に免疫感作させるために用い
る抗原には、ヒトの消化管から精製されたヒトグリセン
チンを用いてもよいが、遺伝子操作技術または化学合成
により製造されたヒトグリセンチンの全領域を持つもの
あるいは化学合成されたヒトグリセンチンの一部の断片
を用いることが可能である。例えば、固相化法のＦＭＯ
Ｃ法によるグリセンチンのペプチド合成で得られたもの
でありうる。このペプチド合成は、他の固相化法あるい
は液相化法でもよい。

【００１５】このようにして得られたヒトグリセンチン
の断片は、次に、マレイミド法あるいはグルタルアルデ
ヒド法等の方法でキャリアー例えば Keyhole Limpet ヘ
モシアニンとの結合体にし、フロイントアジュバントと
混合される。この場合のキャリアーとしてアルブミンの
ようなタンパク質を用いてもよい。

【００１６】抗原として全構造のグリセンチンを用いる
場合には、キャリアーを使用しなくてもよい。また、遺
伝子操作により大腸菌に生産させたヒトグリセンチンを
使用する場合には、βガラクトシダーゼのようなタンパ
ク質との融合タンパク質の形で用いることが可能であ
る。

【００１７】抗体産生細胞すなわち上記の抗原により免
疫感作された動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞は、一般的な
方法〔Nature, Vol.256, 495〜497 (1975)〕に従って細
胞融合することが出来る。得られたハイブリドーマは、
酵素抗体法等によってスクリーニングを行い、限界希釈
法によってクローン化される。

【００１８】得られたクローンは、生育に適した培地中
で培養される。あるいは、例えばプリスタンを予め投与
したマウスの腹腔内に移植して、モノクローナル抗体を
高濃度に含む腹水を採取する。このようにして製造され
た培養液またはマウス腹水からのモノクローナル抗体
は、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、プロテインＡを用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー等によって精製される。

【００１９】このようにして得られた抗ヒトグリセンチ
ンモノクローナル抗体は、生体由来のグリセンチン、ま
たは抗原として認識される領域を含む他のグルカゴン類
縁物質を特異的に測定するために極めて適している。

【００２０】この抗ヒトグリセンチンモノクローナル抗
体に関する第１の本発明の完成により、このモノクロー
ナル抗体と別途作成した認識部位を異にするポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体とを組み合わせるこ
とによって第２の本発明のヒトグリセンチンの特異的な
定量法が完成された。この場合またモノクローナル抗体
と抗血清を組み合わせることによっても特異的測定が行
えるのである。

【００２１】すなわち、この第２の発明はエピトープの
異なる２種以上の抗体を組み合わせることを特徴とする
ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）によるグリセンチンを
特異的に測定する方法に関するものである。

【００２２】すなわち、マイクロプレート、ビーズ等に
固相化した抗体に被検液を反応させ、固相に結合したヒ
トグリセンチンを、別の抗体を用いた酵素免疫法で測定
する。例えば、抗ヒトグリセンチンモノクローナル抗体
を固相化したマイクロプレートに、一定の量のグリセン
チンまたは未知量の水性試料（例えば血清、血漿、組織
抽出液等）を反応させ、標識した第２の抗体を用いて発
色反応または蛍光反応にて定量を行う。

【００２３】抗体の組み合わせは、例えばヒトグリセン
チンＣ末端のヘプタペプチドに対する抗体を固相化して
おけば、被検液中のグリセンチンとオキシントモジュリ
ンが結合し、グリセンチンＮ末端の３２アミノ酸からな
るペプチドに対する抗体を用いてグリセンチンのみを測
定する事が出来る。グルカゴン領域に対する抗体を用い
ると、両者を他の腸管グルカゴンと区別して測定する事
も出来る。Ｎ末端に対する抗体を固相化に使用した場合
には、次にグルカゴン領域またはＣ末端領域に対する抗
体を使用することによって、ヒトグリセンチンのみを測
定することが出来る。あるいは、Ｎ末端領域に対するポ
リクローナル抗体またはエピトープの異なるモノクロー
ナル抗体を使用すれば、ヒトグリセンチンとＧＲＰＰと
の両者を測定することが可能である。

【００２４】抗体の固相化は、公知の化学結合法または
物理結合法を用いて行う。あるいは、先に被検出物質と
エピトープの異なる２種類の抗体を反応させて形成され
た複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記の方法で固
相化させておいて捕捉することも可能である。

【００２５】抗体の標識は、抗体にβガラクトシダー
ゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素を直接結合す
る方法がある。あるいは、抗体をビチオンで標識してお
いて、次にアビシンの結合した酵素を用いることが可能
である。または酵素標識した抗体、例えばモノクローナ
ル抗体に対して抗マウスＩｇＧ標識抗体を使用すること
が可能である。さらに、放射性同位元素で標識した抗体
を使用しうることは勿論である。

【００２６】次に実施例によって本発明を具体的に説明
することにするが、この実施例は単に説明のためのもの
で、これによって本発明が限定されるものと解してはな
らない。

【００２７】〔実施例１〕 免疫用抗原（ヒトグリセンチン）の調製 １） グリセンチン全領域（１−６９）・・・大腸菌を
用いて生産した組換えグリセンチンを用いた。Ｎ末端に
はＭｅｔ残基が余分に付加されている点が天然型と異な
り、アミノ酸残基数は７０（Ｍｅｔ.１−６９）であ
る。この組換えグリセンチンは次のアミノ酸配列を有す
る。

【００２８】 Met Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn Glu Asp Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala これをグルタルアルデヒドを用いてキャリアーとして
の Keyhole Limpet のヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合さ
せた。

【００２９】２） グリセンチンＮ末端断片（１−３
２）・・・ヘプチド合成機を用いてＮ末端には天然型と
同様にメチオニンを持っていない断片を合成した。この
断片は次のアミノ酸配列を有する。

【００３０】 Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn Glu Asp Lys Arg ３３番目には天然型グリセンチンにはないアミノ酸のシ
ステインを付け、マレイミド法でキャリアーのヘモシア
ニンと結合させた。グルタルアルデヒド法で抗原とキャ
リアーを結合させた場合、キャリアーが抗原のアミノ基
全てと結合し得るので、免疫感作に用いた抗原の構造が
天然型のそれとは大きく変化してしまう欠点がある。マ
レイミド法で調製したこの免疫原はグリセンチン３２断
片のＣ末端だけにキャリアーが結合しているので、抗原
となる領域は天然型ヒトグリセンチンに近い状態で呈示
される。

【００３１】３） グリセンチンＣ末端断片（６３−６
９）・・・アミノ酸７残基の断片を合成した。この断片
は次のアミノ酸配列を有する。

【００３２】Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala これにグルタルアルデヒド法でヘモシアニンを結合し
た。この断片のアミノ基はＮ末端のαアミノ基だけであ
るので、Ｎ末端にのみキャリアーが結合する。特別な工
夫なしでグリセンチンＣ末端領域が免疫原として呈示さ
れる。

【００３３】ウサギ抗血清の調製 体重約２kgのウサギ日本白色種雌を以下の方法で免疫感
作し、抗血清を得た。グリセンチン量として２００μｇ
の全領域グリセンチン・ＫＬＨ複合体、または各断片量
として５００μｇのＮ末端断片またはＣ末端断片のＫＬ
Ｈ複合体を０.５mlのＰＢＳ緩衝液に懸濁した。それら
を等量のフロイント完全アジュバントと混合しエマルジ
ョンにして皮下投与した。その後約２週間の間隔でそれ
ぞれ１回目に投与したのと同じ複合体をフロイント不完
全アジュバントとのエマルジョンにして２〜３回投与し
た。

【００３４】免疫マウス脾細胞の調製 ６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、グリセンチ
ン量３０μｇの全領域グリセンチン・ＫＬＨ複合体、ま
たは各断片量として１００μｇのＮ末端断片またはＣ末
端断片のＫＬＨ複合体とフロイント完全アジュバントの
エマルジョンを２週間の間隔で２回投与した。その後約
２週間の間隔でそれぞれ最初に投与したのと同じ複合体
とフロイント不完全アジュバントとのエマルジョンを２
〜３回腹腔内に投与した。さらに２週間後に最終免疫と
して生理的食塩水に懸濁した抗原を投与した。次いで３
日後に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し
た後、注射針を用いて単一細胞の懸濁液とし、細胞数１
×１０⁸／mlに調製した。

【００３５】細胞融合 得られたマウス脾細胞をマウス骨髄種細胞ＮＳ−１と細
胞融合して抗体産生ハイブリドーマを作成した。

【００３６】１０％牛胎児血清、４０μｇ／mlゲンタマ
イシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で対数増殖期
（約２×１０⁵ＣＥＬＬＳ／ml）にあるＮＳ−１細胞を
遠心して集めた。血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０で
洗浄したＮＳ−１細胞１×１０ ⁷と脾細胞１×１０⁸を混
合し、遠心して培地を除き、ペレットに５０％ＰＥＧ
４,０００溶液を１ml加えて融合を行った。さらにＲＰ
ＭＩ−１６４０を２０ml加えて遠心し、１００mlのＨＡ
Ｔ培地に懸濁して２４穴プレートに各ウェル１.５mlず
つ分注し、インキュベーションを行った。

【００３７】スクリーニング ４〜５日後に検鏡を行いハイブリドーマの生育が認めら
れたウェルの培養上清を用い、酵素抗体法によってスク
リーニングを行った。

【００３８】グリセンチンの全領域とＣ末端断片に対す
るモノクローナル抗体のスクリーニングには、予めグリ
センチンを固相化した９６ウェルマイクロプレートを使
用した。Ｎ末端断片に対するモノクローナル抗体のスク
リーニングには、同様のプレートとさらには予め抗マウ
スＩｇＧ抗体を固相化した９６ウェルマイクロプレート
を用いて行った。それぞれのプレートにハイブリドーマ
の培養上清５０μｌを加えた。室温に１時間放置した
後、０.０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液で３回
洗浄し、０.１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液
で希釈したグリセンチン５ngを添加して室温に１時間放
置した。次に、ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液で洗浄
後、グリセンチン全領域に対するウサギ抗血清を適当に
希釈したものを５０μｌ加え、室温に１時間放置した。
次に、ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、西洋わ
さびパーオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを
適当に希釈したものを５０μｌ加え、室温で１時間放置
した。ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、西洋わ
さびパーオキシダーゼ基質溶液（オルトフェニレンジア
ミン１mg／ml、３０％過酸化水素０.４μｌ／mlを含む
０.１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４.５）を１００μｌ加え
て発色させた。室温で５分反応後２規定の硫酸１００μ
ｌを加えて反応を停止させた後、各穴の吸光度を測定し
た。コントロールより有意の呈色反応をしたものを陽性
とし、グリセンチンに対する抗体を産生するハイブリド
ーマを限界希釈法により単一細胞までクローン化し、ク
ローンＧＷ１７、ＧＮ４−１、ＧＮ４−２、ＧＣ１５−
Ａ、ＧＣ１５−Ｅを得た。

【００３９】サブクラスの決定 モノクローナル抗体のサブイソタイプの決定はクローニ
ング後のハイブリドーマ培養上清より、ザイメット社の
抗マウスＩｇＧサブクラスセット（ＭＯＮＯＡｂ−ＩＤ
^TM ＥＩＡ ＫＩＴ）を用いたＥＬＩＳＡ法により行っ
た。その結果は以下の表１に示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】本発明モノクローナル抗体の調製 得られた各クローンを２×１０⁵cells／mlの濃度まで培
養して、遠心分離で細胞を集めた。２×１０⁶の細胞を
生理的食塩水０.５mlに懸濁し、７〜１０日前にプリス
タン０.５mlを腹腔内に投与した雄性ＢＡＬＢ／ｃマウ
スに腹腔内投与した。１０〜１４日後、蓄積した腹水を
採取し、これを１,０００rpm３分間遠心分離して細胞成
分を除いた。次に３,０００rpm １５分間遠心分離して
脂肪層を除いた。

【００４２】抗体を含む腹水はバイオラッド社製のＭＡ
ＰＳ−^TMIIキットを用い、供給者の指示にしたがってＩ
ｇＧ分画を精製した。

【００４３】抗体の特異性 グリセンチンの全領域及び部分断片を濃度を変えてマイ
クロプレートに固相化し、これらの断片に対する反応性
から得られたモノクローナル抗体の特異性を決定した。
結果を以下の表２に示す。

【００４４】

【表２】

【００４５】〔実施例２〕 ＥＬＩＳＡ（サンドウイッチ）法による検出 抗体プレートの調製 ヒトグリセンチンＣ末端断片に対して得られたモノクロ
ーナル抗体ＧＣ１５−ＡまたはＧＣ１５−ＥのＩｇＧ分
画を５０mMリン酸緩衝液ｐＨ７.０を用いてタンパク質
あたり１０μｇ／mlの濃度にする。９６穴プレート（ヌ
ンク社製）の各ウェルあたりこの溶液を５０μｌずつ分
注し、４℃に一晩放置して抗体をプレートに固相化し
た。ＰＢＳ緩衝液でウェルを３回洗浄した後、蒸留水で
４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬製）を各ウ
ェルに３００μｌ加え、４℃に一晩または３７℃に２時
間放置してブロッキングを行った。

【００４６】抗体のビオチン化 ヒトグリセンチンＮ末端断片に対して得られたモノクロ
ーナル抗体ＧＮ４−１またはＧＮ４−２またはウサギ抗
血清のＩｇＧ分画を５０mMホウ酸ナトリウム水溶液ｐＨ
８.６に対して平衡化し、タンパク質あたり１mg／mlの
濃度に調製した。この抗体溶液１.５mlを用いてアマー
シャム社製ビオチン化キットにより供給者の指示にした
がってビオチン化を行った。反応終了後、反応液を０.
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で平衡化したナップカラ
ム（ファルマシア社製）に通して、抗体を未反応のビオ
チン化試薬と分離した。調製したビオチン化抗体は、溶
液に最終０.０１％となるようにチメロサールを加え４
℃で保存した。

【００４７】測 定 上記の方法にしたがって調製したプレートをＰＢＳ洗浄
を３回繰り返した後、０.１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝
液で精製ヒトグリセンチン標品を２００ng／mlから２ng
／mlまで段階希釈して各ウェルに５０μｌ載せて、室温
で２時間反応した。再びＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した
後、ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で６００〜１２００倍に
希釈したビオチン化抗体と６０００倍に希釈したアビジ
ン・ペルオキシダーゼ（ベクター社製を）の混合液を１
００μｌ加えて室温に１時間放置した。次に、オルトフ
ェニレンジアミンを０.１Ｍクエン酸・水酸化カリウム
緩衝液ｐＨ４.５に１mg／mlの濃度に溶解し、最終０.０
１２％となるように過酸化水素水を加えて発色試薬を調
製し、プレートを０.０５％ Tween ２０を含むＰＢＳ緩
衝液でよく洗浄した後に発色試薬を１００μｌ加え、室
温で発色させた。等量の２規定硫酸を加えて反応を停止
させて、波長４９０nmの吸光度を測定した。結果を図１
に示す。

【００４８】２０ng／mlから２００pg/mlまで段階希釈
したグリセンチンをプレートに載せた場合は、上記発色
試薬を用いずに、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸を５mg／mlの濃度になるように０.１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ７.０に溶解し、最終０.０１５％となるよう
に過酸化水素水を加えて調製した蛍光試薬を用いた。蛍
光試薬１００μｌをプレートに添加して３０℃に９０分
間放置した後、反応液を２.５mlの０.１Ｍグリシン・水
酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０.３に移して、波長３２
０nmの紫外光で励起して波長４０５nmの蛍光を測定し
た。結果を図２に示す。

【００４９】〔実施例３〕 ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ′の調製 石川らの方法(酵素免疫測定法、第３版、医学書院)によ
り行った。すなわち、グリセンチンＮ末端断片に対して
得られたウサギ抗血清のＩｇＧ分画を、０.１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ４.５)中５
mg／mlの濃度に調製した。その液３.５mlにペプシン
（ＢＭＹ社製）０.２mgを加え３７℃で２４時間反応さ
せた。反応後１Ｍトリスを加えてｐＨ７.０に調整し、
３,０００rpm（ＴＯＭＹ ＲＳ−２０IV遠心機、ＴＳ−
７ローター）で１０分間遠心して不溶化物を除いた後、
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡化
したSuperdex^TM２００カラム(ファルマシア社製）でゲ
ル濾過を行った。溶出してきたフラクションの２８０nm
のピークのうちＦ(ａｂ′)₂に相当する分画を集め、４m
g／mlとなるように濃縮した。

【００５０】このようにして調製されたＦ(ａｂ′)₂の
溶液の内１.８mlを０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐ
Ｈ６.０)に対して平衡化し、１００mM ２−メルカプト
エチルアミン、５mM ＥＤＴＡ、０.１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液(ｐＨ６.０）を含む液７５μｌを加え、３７℃
で９０分間インキュベーションした。反応液を０.１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したナッ
プカラムに通して脱塩し、Ｆａｂ′サンプルとした。

【００５１】２.８mgの西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ
(Boehringer Mannheim GmbH社製）を３００μｌの０.１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０）に溶解し、これ
にＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３０μｌに０.３５mgの
Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶か
した溶液を加え、３０℃で３０分間反応してペルオキシ
ダーゼにマレイミド基を導入した。反応後０.１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０)で平衡化したナップカ
ラムを通し、マレイミド・ペルオキシダーゼサンプルと
した。

【００５２】Ｆａｂ′サンプルとマレイミド・ペルオキ
シダーゼサンプルとを合わせ、４℃２０時間反応させた
後、２０μｌの０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイミドを加えて
３０℃１０分間放置することにより反応を停止させた。
反応液を３,０００rpmで１０分間遠心分離した後０.１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.５）で平衡化したS
uperdex^TM２００カラムでゲル濾過を行った。各分画の
２８０nmと４０３nmの吸光度から、ペルオキシダーゼ標
識Ｆａｂ′に相当するピークを集めて、測定に用いた。

【００５３】測定は、前記の方法と同様に行った。但
し、ビオチン化抗体とアビジン・ペルオキシダーゼの代
わりに、１００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆａ
ｂ′を５０μｌ加えて室温で２時間反応させ、発色は室
温暗所で３０分間行った。４９０nmの吸光度を測定し
た。結果を図３に示す。

【００５４】比較のために、Ｆａｂ′の調製を行ったウ
サギ抗血清を用いて従来のＲＩＡ法によるグリセンチン
の定量結果を図４に示す。ペルオキシダーゼ標識Ｆａ
ｂ′を用い、本発明のＥＬＩＳＡ法による定量法では、
測定感度が１０倍以上優れている。

【００５５】

【発明の効果】本発明によるハイブリドーマを適当な生
産用培地を用いて培養して得られた培養液より、または
動物の腹腔内に移植して得られた腹水よりモノクローナ
ル抗体を精製する事によって、グリセンチンに対する抗
体が安定して得られるようになった。

【００５６】さらに第１の発明によるモノクローナル抗
体を組み合わせ、あるいは抗血清と組み合わせるところ
の第２の発明により、グリセンチンを特異的に検出、定
量する事が可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトグリセンチンＣ末端断片に対して得られた
モノクローナル抗体を固相化し、これにヒトグリセンチ
ン標本を反応させ、更にヒトグリセンチンＮ末端断片に
対して得られた標識化されたモノクローナル抗体（ビオ
チン化抗体）を反応させ、反応物を発色させた場合のグ
リセンチン量と吸光度の関係を示す図。

【図２】図１の場合と同様の操作であるが、段階希釈し
たヒトグリセンチンを反応させ、更にこれと反応させた
標識化モノクローナル抗体との反応物の蛍光を測定する
場合のグリセンチン量と蛍光強度の関係を示す図。

【図３】ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ′を用いる場合の
グリセンチン量と吸光度の関係を示す図。

【図４】従来のＲＩＡ法によるグリセンチンの定量結果
を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年８月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】Ａ ｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ これにグルタルアルデヒド法でヘモシアニンを結合し
た。この断片のアミノ基はＮ末端のαアミノ基だけであ
るので、Ｎ末端にのみキャリアーが結合する。特別な工
夫なしでグリセンチンＣ末端領域が免疫原として呈示さ
れる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】グリセンチンの全領域とＣ末端断片に対す
るモノクローナル抗体のスクリーニングには、予めグリ
センチンを固相化した９６ウェルマイクロプレートを使
用した。Ｎ末端断片に対するモノクローナル抗体のスク
リーニングには、同様のプレートとさらには予め抗マウ
スＩｇＧ抗体を固相化した９６ウェルマイクロプレート
を用いて行った。それぞれのプレートにハイブリドーマ
の培養上清５０μｌを加えた。室温に１時間放置した
後、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液で３回
洗浄し、０．１％牛血清アルブミン（０．１％ＢＳＡ）
を含むＰＢＳ緩衝液で希釈したグリセンチン５ｎｇを添
加して室温に１時間放置した。次に、ツイーン２０添加
ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、グリセンチン全領域に対するウ
サギ抗血清を適当に希釈したものを５０μｌ加え、室温
に１時間放置した。次に、ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝
液で洗浄後、西洋わさびパーオキシダーゼで標識したヤ
ギ抗ウサギＩｇＧを適当に希釈したものを５０μｌ加
え、室温で１時間放置した。ツイーン２０添加ＰＢＳ緩
衝液で洗浄後、西洋わさびパーオキシダーゼ基質溶液
（オルトフェニレンジアミン１ｍｇ／ｍｌ、３０％過酸
化水素０．４μｌ／ｍｌを含む０．１Ｍクエン酸緩衝
液、ｐＨ４．５）を１０Ｏμｌ加えて発色させた。室温
で５分反応後２規定の硫酸１００μｌを加えて反応を停
止させた後、各穴の吸光度を測定した。コントロールよ
り有意の呈色反応をしたものを陽性とし、グリセンチン
に対する抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法に
より単一細胞までクローン化し、クローンＧＷ１７、Ｇ
Ｎ４−１、ＧＮ４−２、ＧＣ１５−Ａ、ＧＣ１５−Ｅを
得た。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５１】２．８ｍｇの西洋ワサビ・ペルオキシダー
ゼ（ＢＭＹ社製）を３００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、これにＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド３０μｌに０．３５ｍｇのＮ−サク
シニミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶かした溶液
を加え、３０℃で３０分間反応してペルオキシダーゼに
マレイミド基を導入した。反応後０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したナップカラムを
通し、マレイミド・ペルオキシダーゼサンプルとした。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｚ 8318−4Ｈ 7/10 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 坂井 博 埼玉県入間郡大井町鶴ケ岡１丁目17番10号 高山マンシヨン303号

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトグリセンチンの全領域、ヒトグリセ
   ンチンのＣ末端領域またはヒトグリセンチンのＮ末端領
   域に対するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトグリセンチン抗体を固相化し、これ
   にグリセンチン含有の検体を反応させ、はじめに固相化
   したヒトグリセンチン抗体とは別のヒトグリセンチンま
   たはその断片の領域を認識する抗体であって標識化され
   たものを反応させ、反応した標識化された抗体の量を測
   定することからなる、ヒトグリセンチンの定量法。