JPH05227945A - ベシキュラー・アービュスキュラー菌根菌の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ベシキュラー・アービュスキュラー菌根菌
（ＶＡ菌根菌）と植物とを共生培養するに際して、根の
生育可能な空間の水平方向の平均断面積が０．５〜１０
０ｃｍ²の構造を有する容器を三次元的に配置し、温
室、恒温室、人工気象器等の人工的に制御した培養環境
下で培養し、ＶＡ菌根菌を製造し、植物を培養する。製
造されたＶＡ菌根菌を組織培養植物に接種することによ
り苗を製造する。製造されたＶＡ菌根菌は、ＶＡ菌根菌
組成物として利用する。 【効果】 生産効率の向上、省スペース化、年に複数回
の生産が可能となり、ＶＡ菌根菌が工業的に大量に得ら
れ、工業的な植物の大量培養ができる。組織培養によ
り、高い生存率で苗が得られ歩留りが向上する。安価な
製造コストで工業的に大量にＶＡ菌根菌組成物が得ら
れ、施肥量軽減、悪い栽培環境に対する抵抗性の向上、
農産物の品質向上が実現できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＶＡ菌根菌を製造する
方法、植物を培養する方法、苗を生産する方法、ＶＡ菌
根菌組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＶＡ菌根菌は、植物と共生することによ
って、その共生植物の養分吸収（特にリン）を促した
り、共生植物を土壌の病原菌から保護する等、好ましい
影響を与えることが現在までに多数報告されている。そ
こで、工業的にＶＡ菌根菌を生産し共生させることがで
きれば、作物への施肥量軽減、悪い栽培環境に対する抵
抗性の向上、農産物の品質の向上が期待できる。

【０００３】しかし、ＶＡ菌根菌は植物と共生していな
ければ増殖しない絶対共生菌で純粋培養できないことか
ら、効率良く大量に生産する技術の開発が大変困難とな
っている。

【０００４】現在までに提案されたＶＡ菌根菌の培養方
法は、以下のような方法がある。 鉢培養において、培養基体として多孔性構造を有す
る物質などを用い植物体を栽培し、ＶＡ菌根菌を共生さ
せ増殖させる方法（特開昭６０−２３７９８７号公
報）。

【０００５】 水耕栽培において、培養液を薄膜状に
し常時培地の供給を行なって植物体の栽培を行ない、Ｖ
Ａ菌根菌を増殖させる方法（特開昭５５−１１８３９０
号公報）。 ポットカルチャー法を用いた様々な条件におけるＶ
Ａ菌根菌の培養（曽田ら、木炭と木酢液の新用途開発研
究成果集（１９９０））。

【０００６】 短日植物に短日処理を行なうことによ
りＶＡ菌根菌の増殖を促進する方法（特開平２−２２７
０６８号公報）。 粒径の異なる培土を深さ方向の界面において接触せ
しめて充填し植物を栽培してＶＡ菌根菌を共生させ増殖
させる方法（特開平３−７６５７２号公報）。

【０００７】 根の器官培養物とＶＡ菌根菌を共生さ
せ増殖させる方法（特開昭６２−１９０２８号公報）。 毛状根とＶＡ菌根菌を共生させ増殖させる方法（特
公昭６２−４９０３７号公報）。

【０００８】 毛状根とＶＡ菌根菌を共生させ増殖さ
せる方法（Ｇ． Ｂｅｃａｒｄ ら、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏ
ｌ． １０８，２１１ （１９８８））。 ＶＡ菌根菌をゼオライトを含む培土で特定の植物と
共に培養しＶＡ菌根菌を増殖させる方法（特開平３−２
４７２７０号公報）。

【０００９】しかしいずれの方法でも、ＶＡ菌根菌の増
殖培率、生産量、生産密度、培養期間、管理の手間など
を総合的に考えた生産効率が未だ十分でなかった。すな
わち、上記〜の中では増殖倍率、生産
量などの点でかなり生産効率が低く、一方、比較的生産
効率の高いについても以下のような問題があっ
た。

【００１０】においてはギガスポラ・マルガリータの
胞子生産のための条件として、ポットサイズを１００ｍ
ｌ程度にするのが生産密度、培養期間の点で最も好まし
いとしているが、このように、小容器を多数配置し培養
を行なうと手間がかかるし、２次元的に配置するのは工
業的に不利であり、ＶＡ菌根菌の大量生産法として未だ
確立されたものではなかった。

【００１１】また、においては、大量に生産する方法
として２５０ｍｌのポットで栽培した後、３０００ｍｌ
のポットに移植しているが、このような手間をかけなけ
れば高い生産効率でスケールアップできなかった。さら
に、ＶＡ菌根菌と共生させる植物が短日植物で、栽培途
中に短日条件で栽培する必要があり栽培環境を変えなけ
ればならない煩雑な操作が必要であった。

【００１２】また、については粒径の異なる２種類の
培土を用意する必要があるし、粒径の小さい方に大量に
胞子生産がみられても粒径の大きい培土のスペースが無
駄になり、結局単位体積あたりの胞子生産量は小さくな
ってしまう問題がある。また、ＶＡ菌根菌を年間複数回
工業的に生産する具体的な方法は未だ開発されていな
い。

【００１３】ＶＡ菌根菌の優れた性質を利用するため
に、植物にＶＡ菌根菌を共生させ培養する方法はいくつ
か知られているが、いずれも工業的に効率よく植物を培
養する具体的な方法は未だ開発されていない。

【００１４】組織培養により苗を生産する方法は、ウイ
ルスなどの病原菌に汚染されていない苗を生産したり、
新品種、優良品種、種子繁殖の不可能な品種、細胞融合
などにより得られた細胞などを均一で大量に増殖させる
場合などに有効な技術である。しかし、これらの増殖方
法はどれも無菌で、照明・温度などが制御された環境で
行なわれており、ここで得られた植物体を利用するに
は、このような完全に制御された環境から、例えば温室
のような完全には制御されていない環境、望ましくは自
然環境下へ解放する必要がある。

【００１５】このように制御された環境で育てた植物
を、自然環境に慣らすまでの過渡的な工程である順化工
程において、良好な活着、生長が得られないことや、商
品価値のある苗を生産するまでに長期間必要で人件費が
かかり、さらに歩留りが低いことは大きな問題であっ
た。そのため従来その応用はラン、カーネーション、イ
チゴなどの高級施設園芸作物に限定されていた。

【００１６】また、現行の方法の場合は容器内の植物に
何も処理をせずに順化工程に移行するために、この工程
はより困難なものになっていた。すなわち、植物にとっ
て急激な湿度の低下は特に地上部を最初に枯死に至らし
めてしまう。そして、完全な無菌状態ではなく、かつ外
気よりは湿度の高い順化工程においてはこの枯死した地
上部を中心に雑菌による汚染が広がり、その株の地下部
までやがては枯死させてしまう。さらに、雑菌による汚
染が他の株にまで広がり、ある程度順化できかけていた
株まで汚染してしまうこともある。最悪の場合には、一
つの独立した順化用容器内の全てが失われてしまうこと
さえ有り得る。

【００１７】この問題を解決するために、ジベレリン生
合成阻害剤やエチレン生合成阻害剤等の化学的物質を用
いる方法、特殊な培地・培養支持体を用いる方法、湿度
・二酸化炭素濃度などの環境を物理的に制御する方法な
どが試みられた。しかし、これらの方法は高度な知識と
経験を要し、植え替えの回数の増加にともない多大な労
力も必要となり、その度ごとに植物体が機械的損傷を受
けてしまう。さらに特殊な環境を整えるために新たな設
備投資が要求される可能性も大きい。

【００１８】一方、土壌微生物であるＶＡ菌根菌は植物
と共生することによって、好ましい影響を与えるので、
培養苗に接種する検討が下記のように行われている。 （１） メリクローン培養によって得られたイチゴの苗
にＶＡ菌根菌を接種することによって、植物の乾燥重や
リン含量が増加するという報告（Ｈｒｓｅｌｏｖａ
Ｈ．ら、ｉｎｔｅｒｒｌａｔ．Ｍｉｃｒｏｏｒｇ．Ｐｌ
ａｎｔｓ Ｓｏｉｌ １０９−１１４（１９８９））。

【００１９】（２） 組織培養によって得られたアスパ
ラガス苗にＶＡ菌根菌を接種することによって、植物の
乾燥重やリン含量が増加し、圃場への活着率が高くなる
という報告（Ｃ．Ｔ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ
ａｎｄ Ｓｏｉｌ １３５，７５−８２（１９８
８））。

【００２０】しかし、（１）の報告は植物の順化や生存
率については検討していない。さらに（１）、（２）の
報告はともにＶＡ菌根菌胞子を安定的に大量に得る方法
を示していない。すなわち、ＶＡ菌根菌の確保を野外採
取に頼った場合、ＶＡ菌根菌は大量の肥料が施用され、
特に殺菌剤などの農薬が大量に散布されるような現代的
農業の行なわれている土壌には生存してないので、土壌
中から得ることは非常に難しく、また、もしＶＡ菌根菌
の生存している所を発見し、取扱いのしやすい胞子が得
られたとしても、それらはできた時期が不揃いで、休眠
している可能性もあり発芽率は低く、工業的苗生産に使
用するには問題がある。

【００２１】そこで、人工的にＶＡ菌根菌を生産し、苗
生産に利用することが考えられる。しかし、前述のよう
にＶＡ菌根菌は植物と共生していなければ増殖しない絶
対共生菌で、純粋培養できないことから効率よく大量に
生産する技術の開発が大変困難となっている。

【００２２】以上のように、組織培養によって苗を生産
する方法において、効率よく大量に安定した苗生産を可
能にする方法は、未だに開発されていない。また、現在
までにいくつかのＶＡ菌根菌組成物は提案されている
が、原料となるＶＡ菌根菌の生産効率が前述のように未
だ十分でなく、組成物の生産コスト、安定供給などに問
題があった。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、効率が高く
製造コストの安価なＶＡ菌根菌を大量に製造する方法を
提供することを目的とする。また、本発明は、工業的に
効率よく植物を培養する方法を提供することを目的とす
る。

【００２４】また本発明は、植物の組識培養により苗を
生産する方法において、苗の効率的で安定な苗生産方法
を提供することを目的とする。また本発明は、製造コス
トが安価で、しかも植物とＶＡ菌根菌とを効率よく共生
させることができるＶＡ菌根菌組成物を提供することを
目的とする。

【００２５】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく、
種々のＶＡ菌根菌培養方法を検討した結果、ＶＡ菌根菌
と植物の培養において、根の生育可能な空間の水平方向
の平均断面積が、０．５〜１００ｃｍ² の構造を有する
容器を、人工的に制御した培養環境下で三次元的に配置
し培養することにより、生産効率の向上、省スペース
化、年に複数回の生産が可能となり、ＶＡ菌根菌が大量
に効率良く得られることが認められた。

【００２６】本発明は、この知見に基づき、検討をさら
に重ねた結果なされたものである。すなわち、本発明の
ＶＡ菌根菌の製造方法は、ＶＡ菌根菌と植物の培養にお
いて、根の生育可能な空間の水平方向の平均断面積が、
０．５〜１００ｃｍ² の構造を有する容器を、人工的に
制御した培養環境下で三次元的に配置し培養することを
特徴とする。

【００２７】また、本発明の植物の培養方法は、ＶＡ菌
根菌と植物の培養において、根の生育可能な空間の水平
方向の平均断面積が、０．５〜１００ｃｍ² の構造を有
する容器を、人工的に制御した培養環境下で三次元的に
配置し培養することを特徴とする。

【００２８】また、本発明の苗の生産方法は、植物の組
織培養によって苗を生産する方法において、上記の方法
によって製造されたＶＡ菌根菌を、植物に接種すること
を特徴とする。

【００２９】また、本発明のＶＡ菌根菌組成物は、ＶＡ
菌根菌と植物の培養において、根の生育可能な空間の水
平方向の平均断面積が０．５〜１００ｃｍ² の構造を有
する容器を、人工的に制御した培養環境下で三次元的に
配置し培養したＶＡ菌根菌を含有することを特徴とす
る。

【００３０】

【発明の実施態様】本発明において用いられるＶＡ菌根
菌としては、ギガスポラ属（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ）、グ
ロマス属（Ｇｌｏｍｕｓ）、スクレロシスチス属（Ｓｃ
ｌｅｒｏｃｙｓｔｉｓ）、アカウロスポラ属（Ａｃｃａ
ｕｌｏｓｐｏｒａ）、エントロホスポラ属（Ｅｎｔｒｏ
ｐｈｏｓｐｏｒａ）、スクテリスポラ属（Ｓｃｕｔｅｌ
ｌｉｓｐｏｒａ）などが挙げられる。

【００３１】ＶＡ菌根菌の胞子は、野生の植物や栽培植
物の根の付近の土壌、水耕栽培物の根、毛状根などの容
器内培養物より採集することができる。これらのうち、
土壌からギガスポラ・マルガリータの胞子を分離する方
法を以下に示す。

【００３２】まず圃場または植物の鉢植えの土壌を採取
し、水に懸濁する。これを１〜２ｍｍメッシュの篩で大
きなごみ、石等を除き、さらに通過液を０．１ｍｍメッ
シュの篩に通す。０．１ｍｍメッシュの篩に残ったもの
を流水で洗浄後集め、少量の水に懸濁しシャーレに移
す。これを実体顕微鏡下でごみと胞子とに選別し、胞子
のみをピペットで吸い取り別のシャーレに移す。この操
作を３回繰り返し、遠沈管に移した後、水を加えて超音
波を数秒当ててごみを分散させ、水を捨てることにより
胞子を洗浄する。これを数回繰り返す。洗浄した胞子の
無菌化は、滅菌水で２０〜３０回洗浄するか、ストレプ
トマイシン等の抗生物質、種々の殺菌剤等を用いること
によって行なう。無菌培養下で得られた胞子については
もちろんその必要は無い。

【００３３】以上のようにして単離した胞子を、無菌化
の確認や予備発芽のために、植物に接種する前に適当な
固体培地上で培養してもよい。このＶＡ菌根菌と植物と
を共生させ、増殖を行なう。共生させる接種源としての
ＶＡ菌根菌は、上記の方法で得た胞子または予備発芽し
た胞子が通常用いられるが、他の物質との混合物の状態
や、根または毛状根と共生しているものをそのまま分離
せずに接種源として用いることも可能である。

【００３４】ＶＡ菌根菌の接種は、ＶＡ菌根菌接種源を
水、緩衝液等の液体、またはケイソウ土、有機肥料等の
粉体、粒状体、カラギーナン等のゲル状体に混合、懸濁
し、植物体と接触させることにより、あるいは植物の付
近に置くことにより行なうことができる。

【００３５】本発明に用いられる宿主植物はＶＡ菌根菌
が共生する植物であれば何でもよいが、アスパラガス、
タマネギ等のユリ科、トウモロコシ、バヒアグラス等の
イネ科、クローバー、アルファルファ、ダイズ等のマメ
科、キュウリ、スイカ等のウリ科、ナス、トマト、ピー
マン、ジャガイモ等のナス科、イチゴ等のバラ科、その
他キク科、シソ科、セリ科、クマツヅラ科等が挙げられ
る。これらのうちマメ科のシャジクソウ属、ユリ科のネ
ギ属、イネ科のスズメノヒエ属、ナス科のナス属、トマ
ト属が好ましい。宿主植物はＶＡ菌根菌を生産するため
に三次元的に配置するので、地上部が大きくなり過ぎな
いものが好ましく、また、年に複数回培養するので、発
芽発根が比較的早いものが好ましい。これらの植物を容
器に播種または移植し、ＶＡ菌根菌を接種した後人工的
に制御した栽培条件下で三次元的に配置して培養を行な
うことができる。

【００３６】本発明において、ＶＡ菌根菌と植物との共
生培養を行なう培地は固体でも液体でもよく、固体培地
としては土、砂、腐葉土、ピートモス、赤玉土、バーミ
キュライト、パーライト等の無機物、有機物、それらの
混合物が用いられる。また、寒天、ゲランガム等の固化
剤によって調製した固体培地や、多孔性物質、人工土壌
などに液体培地を含浸させたものも用いることができ
る。液体培地としては、通常水耕栽培や組織培養に用い
られるものを、そのまままたは改変して用いることがで
きる。また時々液体培地でリンスし、養分を補給する方
法を用いることによって、通常は培地が無い状態で培養
を行なうこともできる。

【００３７】本発明において、三次元的に培養する方法
は多段型の棚や斜向式の棚に容器を置いて行なう方法、
懸垂式培養法等が挙げられる。また、ベルトコンベアー
方式を利用し、容器を棚へ自動収集することも可能であ
る。さらに、培養棚が可動式で、培地の充填、植物播
種、移植、ＶＡ菌根菌の接種、灌水、施肥等が自動で工
業的に行なえる施設の構築も可能である。

【００３８】本発明において、培養に使用される容器と
しては、培養可能な形状のものなら何でもよいが、根の
生育可能な空間の水平方向の平均断面積が０．５〜１０
０ｃｍ² の構造を有する容器が用いられる。好ましくは
１〜５０ｃｍ² の構造を有する容器が用いられる。

【００３９】従来大容量の容器を用いると生産効率が下
がることは知られていたが、本発明者らが詳細に検討し
た結果、根の生育可能な空間の水平方向の平均断面積が
０．５〜１００ｃｍ² の場合に、植物根とＶＡ菌根菌の
生育を規定制限する容器の壁面、仕切りなどの遮蔽物の
効果が最適となり、生産効率を非常に高めることが判っ
た。

【００４０】例えば、大型のプランターに仕切りを入れ
て、水平方向の平均断面積が、０．５〜１００ｃｍ² に
なる区画を作製したものや、水平方向の断面積が、０．
５〜１００ｃｍ² の試験管、また容器の上部下部によっ
て水平方向の断面積が異なる容器でも平均断面積が０．
５〜１００ｃｍ² であればよい。

【００４１】但し、容器のコスト、管理の手間を考える
と、水平方向の平均断面積が、０．５〜１００ｃｍ² の
区画が多数連結した構造を有する容器が工業的に有利で
ある。根の生育可能な空間の水平方向の平均断面積が
０．５ｃｍ² 未満であると植物が十分に根を伸長させる
ことができなくなりＶＡ菌根菌の胞子の生産効率が著し
く低下する。また、１００ｃｍ² を超えるとＶＡ菌根菌
の植物への感染機会が減ることによって感染が遅くなり
短期間におけるＶＡ菌根菌の胞子の生産効率が著しく低
下する。

【００４２】本発明において、培養に使用される容器と
しては、根の生育可能な空間の水平方向の平均断面積
が、０．５〜１００ｃｍ² であれば、通常植物栽培に用
いられている素焼の鉢、ワグネルポット、ビニールポッ
ト、プランター、育苗トレイ、プラスチック製のコンテ
ナ等の他、ガラス製の試験管、プラスチック製のチュー
ブ等または、それらに仕切り等を有するものも使用する
ことができる。材質は、陶器類やガラス製、プラスチッ
ク製、金属製、木製、紙製等培養可能と思われるものな
ら何でもよい。

【００４３】本発明において、人工的に培養環境を制御
する培養施設としては具体的に温室、好ましくは照明、
温度の調整可能な温室、照明設備を備えた恒温室や恒温
槽、植物工場、温度、照明を制御できるクリーンルー
ム、人工気象器等を用いることができる。施設での培養
環境条件のうち温度としては、植物生長可能である５〜
４０℃で、このうち１５〜３０℃が好ましい。５℃未満
であると、ＶＡ菌根菌が植物に共生しにくくなり短期間
での大量の胞子生産ができない。４０℃を超えると植物
が枯死または生育悪化し、ＶＡ菌根菌との共生がスムー
ズに成立せず、ＶＡ菌根菌の生産効率は著しく低下す
る。

【００４４】また、培養環境のうち、照度については５
００ルックス以上であればよく、好ましくは２０００ル
ックス以上、２００００ルックス以下がよい。光源とし
ては太陽光でもよいが人工光も用いることができる。本
発明において、ＶＡ菌根菌の培養に必要な照度は、通常
の人工光による植物栽培より比較的低照度でよいので、
大幅な省電力化を図ることができる。

【００４５】以上のように本発明の方法に従えば、ＶＡ
菌根菌を年間複数回生産することができる。ＶＡ菌根菌
を植物の播種と同時に接種すると約２〜４週間で感染が
成立し、接種後約６〜８週間で胞子生産が見られてく
る。約３ケ月で胞子生産はほぼ定常状態になるので生産
方法として３ケ月でＶＡ菌根菌の胞子生産を終わらせた
場合、年間４回の工業生産が可能になり、４ケ月でＶＡ
菌根菌の胞子生産を終わらせると年間３回の工業生産を
行なうことができる。本法によれば、季節、天候に左右
されることになくＶＡ菌根菌の培養を行なうことがで
き、年間を通じて安定的に大量のＶＡ菌根菌を効率良く
生産することができる。

【００４６】またＶＡ菌根菌の胞子はほぼ同時に生産さ
れるため、その後の発芽等はばらつくことなく同調的で
あり、常に一定以上の有効なＶＡ菌根菌の胞子を大量に
得ることができる。

【００４７】また高密度生産が可能であるため、低コス
トでエアフィルター、殺菌灯等を用いた微生物汚染の防
除を行なうこともでき、従来大きな問題であった有害な
微生物の混入を防ぐことも比較的容易である。以上のよ
うな方法でＶＡ菌根菌と植物を培養すると、植物の培養
方法としても非常に好適である。

【００４８】本発明においてはＶＡ菌根菌が高密度で生
産されるため、植物への感染率が非常に高く、ＶＡ菌根
菌の好ましい効果が強く付与された植物を得ることがで
きる。また、効率的に大量の植物を生育する方法として
適している。特に苗の生産に好適である。

【００４９】培養環境は、培養する植物に適当なものが
好ましい。本発明で、組織培養により苗を生産する方法
における出発材料としては以下のものが挙げられる。

【００５０】幼植物、植物の器官、すなわち茎頂、茎、
葉、根、花、胚などの全部または一部、植物ホルモンな
どを用いることによって脱分化したカルス組織、単細胞
化し細胞壁を除いたプロトプラスト、または以上のもの
に遺伝子組換えや細胞融合を行なったものなどである。

【００５１】また本発明における組織培養法として以下
のものが挙げられる。近年、栄養繁殖性の花きや作物を
増殖させる方法として注目されているマイクロプロパゲ
ーションは特に本発明に好適である。

【００５２】具体的には、微生物はもちろんウイルスに
も汚染されていない無病の苗生産に重要な手段である茎
頂培養、茎頂培養よりも増殖のよい苗条原基、多数の苗
条の生産が可能なマルシプルシュート、一度で大量増殖
の可能な不定胚、ジャガイモの茎の培養でえき芽から小
型のイモを作出するマイクロチューバー、植物の組織・
カルス・液体培養細胞などを材料とし、分化の誘導を行
なう不定芽などの培養である。これ以外にも、ユリ科の
植物などで鱗片を培養し小型の鱗茎を得る方法にも好適
である。

【００５３】これらのうち、不定胚を経由する方法は以
下のような利点を持っているので特に好ましい。 （１） 不定胚を作出するカルス（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎ
ｉｃ ｃａｌｌｕｓ）を液体培地で培養することによっ
て増殖のスピードを飛躍的に上げることができる。

【００５４】（２） 不定胚は独立した器官として他の
組織と容易に分離でき、扱いやすい。 （３） 胚としての機能を保持しており、種子と同様、
発芽、発根、その後の生長が容易に行なえる。 （４） 不定胚の成育ステージを揃える同調培養を行な
うことによって、バラツキの少ない苗を生産することが
できる。

【００５５】本発明で、例えば従来から植物の組織培養
に用いられている培地、つまり、無機成分および炭素源
を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類お
よびアミノ酸類から選ばれる少なくとも１種以上の成分
を添加し、必要に応じてその他の成分も添加されている
培地を用いることができる。

【００５６】上記培地中の無機成分としては、窒素、亜
鉛、鉄、銅、モリブデン、ホウ素、リン、コバルト、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、マンガ
ン、塩素、ナトリウム、ヨウ素等があり、具体的には、
硝酸アンモニウム、リン酸２水素アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸
カルシウム、硝酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄、硫
酸第２鉄、エチレンジアミン４酢酸鉄、硫酸銅、モリブ
デン酸、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、リン酸、リ
ン酸１ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸２ナトリウ
ム、リン酸３ナトリウム、塩化コバルト、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウ
ム、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム等が例示される。

【００５７】また炭素源には、ショ糖および他の炭水化
物、その誘導体、脂肪酸等の有機酸、エタノール等の１
級アルコール等が例示される。植物ホルモン類には、イ
ンドール酢酸、ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸等のオーキシン類、ベンジルアデニン、ゼア
チン等のサイトカイニン類が例示される。

【００５８】ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ₁） 、ピリドキシン（ビタミンＢ₆） 、パント
テン酸、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトー
ル、ニコチン酸等が例示される。アミノ酸類には、グリ
シン、アラニン、グルタミン、システイン等が例示され
る。

【００５９】この他に、ビタミン、ホルモン等が含まれ
ると言われている天然物、例えばココナッツミルク、酵
母エキス等も用いることができる。本発明で培地中の成
分の濃度は、広い範囲で変えることができる。通常は、
無機成分を約０．１μＭ〜約１００ｍＭ程度、炭素源を
約１ｇ／リッター〜１２０ｇ／リッター程度、さらに植
物ホルモン類を約０．０１μＭ〜約１０μＭ程度、ビタ
ミン類およびアミノ酸類を、それぞれ約０．１ｍｇ／リ
ッター〜約１００ｍｇ／リッター程度とすることができ
る。

【００６０】ゲル状物質である固体培地を用いる場合の
培地固化剤としては、寒天、ゲランガムなどが例示され
る。また固体に液体培地を浸透させて固体培地として用
いる場合の固体としては、バーミキュライト、ロックウ
ール、ピートモス、川砂、鹿沼土、その他の園芸土壌、
培養土が例示される。

【００６１】本発明においては、ＶＡ菌根菌と植物の培
養において、根の生育可能な空間の水平方向の平均断面
積が、０．５〜１００ｃｍ² の構造を有する容器を、人
工的に制御した培養環境下で三次元的に配置し培養する
ことを特徴とする、ＶＡ菌根菌の製造方法によって生産
されたＶＡ菌根菌を、植物の組織培養によって苗を生産
する際に植物に接種する。

【００６２】本発明において、接種の方法は、植物根の
近傍または発根の期待できる箇所にＶＡ菌根菌を置くか
または培地中に埋めるだけでよい。接種するものはＶＡ
菌根菌の胞子、菌糸、などいずれでも可能であるが、有
効性が高く扱いやすい胞子であることが好ましい。また
ＶＡ菌根菌を含有する組成物でもよい。植物に接種する
前に、予備発芽のために胞子を適当な培地で培養するこ
ともできる。

【００６３】本発明においては順化工程においてＶＡ菌
根菌が接種されるか、またはすでに接種されていること
が好ましい。ＶＡ菌根菌には養分吸収の補助、耐干性の
向上、病原菌からの保護などの効果が期待できるので、
特に幼植物の初期生育の向上に効果を発揮するからであ
る。順化工程で用いられる方法のうち、最もよく用いら
れる方法としては以下のものが挙げられる。

【００６４】無菌状態で幼植物に生長した植物を容器か
ら取り出し、無菌培養用の培地を滅菌水などで洗い流し
て、予め滅菌しておいたバーミキュライト、ロックウー
ル、ピートモス、水ゴケ、川砂、鹿沼土などに植え付
け、小さな穴の開いた覆いをして、雑菌汚染の少ない培
養室などに置いて管理する。特に順化初期には、ほぼ１
００％に近い高湿度に保つことが必要である。人工環境
と自然環境の中間のこのような環境で、薄い液肥を与え
て育成し、１〜２週間後に覆いを取り除く。以上のよう
な方法により順化された苗が得られる。

【００６５】本発明によって生産された苗は、圃場や栽
培ポット等の土壌栽培、バーミキュライトやロックウー
ル等による人工土壌栽培、水耕栽培等の養液栽培などに
応用可能である。本発明のＶＡ菌根菌組成物は、ＶＡ菌
根菌と植物の培養において、根の生育可能な空間の水平
方向の平均断面積が、０．５〜１００ｃｍ² の構造を有
する容器を、人工的に制御した培養環境下で三次元的に
配置し培養したＶＡ菌根菌を含有することを特徴とす
る。

【００６６】本発明においては、非常に高密度でＶＡ菌
根菌と植物との共生培養を行なう培地中にＶＡ菌根菌が
生産されるので、そのまま、またはさらに種々の添加剤
を加えても微生物製剤として用いることができる。また
必要に応じて、ふるい分け等の簡単な操作で培地中のＶ
Ａ菌根菌密度を高めても良い。

【００６７】また、湿式篩別法、比重液浮遊法、浮遊吸
着法などを用いて、培地からＶＡ菌根菌を分離し製剤化
してもよい。さらに、前述のように低コストで微生物汚
染の防除を行なうこともできるので、従来大きな問題で
あった微生物製剤への有害な微生物の混入を防ぐことも
比較的容易である。

【００６８】本発明において用いられる添加剤の例とし
ては、ＶＡ菌根菌生長を抑制する物質である、有機酸、
有機酸塩が挙げられる。有機酸またはその塩が存在する
組成物中では、ＶＡ菌根菌はほとんど生長しない。例え
ば、ＶＡ菌根菌胞子の場合は、全く発芽しないか、また
は発芽しても菌糸の生長は短いまま停止する。

【００６９】有機酸としては、クエン酸、オキザロ酢
酸、酒石酸、ピルビン酸などが挙げられる。また有機酸
塩としてはこれらのナトリウム塩、カリウム塩などが挙
げられる。これらのうち有機酸としてはクエン酸が、有
機酸塩としてはクエン酸塩が好ましい。

【００７０】本発明において用いられる有機酸またはそ
の塩の組成物中の濃度は、広い範囲で変えることができ
る。液型組成物中の濃度は１ｍｇ／リッター以上、１０
ｇ／リッター以下が好ましい。

【００７１】この抑制効果は容易に解除でき、非常に好
適である。抑制解除は、有機酸またはその塩の濃度を低
下させることによって行なうことができる。また、有機
酸またはその塩の濃度がほとんど低下しなくても、ｐＨ
を上昇させることによって抑制解除を行なうことができ
る。他に、植物根が近傍に存在することによって抑制解
除されるという知見が、本発明者らによって得られてい
る。

【００７２】具体的には、大量の水で組成物を希釈した
り、塩基性溶液を加えたり、土壌に施用したあと潅水を
行なうことにより、あるいは植物を植え付けて根が生長
すれば、ＶＡ菌根菌は生長抑制が解除され、活発に生長
し植物と共生することができる。

【００７３】有機酸またはその塩は、常温で効果の高い
ＶＡ菌根菌生長抑制物質であり、これを用いることによ
り、非常に有用なＶＡ菌根菌含有組成物、例えば肥料な
どを開発することができる。実際には、ＶＡ菌根菌含有
組成物が保存、輸送されている間は有機酸またはその塩
が含有されていればよい。低温を維持したり、水分条件
を厳密に管理するというような手間がかかりしかもＶＡ
菌根菌が死滅する危険性のある方法を用いる必要は無
い。

【００７４】本発明において有機酸またはその塩を用い
る場合においては、組成物に酸性物質を加えることによ
って、ＶＡ菌根菌周囲のｐＨが酸性となるようにするの
が好ましい。具体的にはｐＨ２以上、６以下が好まし
い。ｐＨが２未満の場合はＶＡ菌根菌が強い酸性によっ
て悪影響を受け、６を超える場合は生長抑制効果が低下
するからである。

【００７５】生長抑制効果は有機酸および／または有機
酸塩を用いずに、ｐＨを２〜６にしただけでは得ること
ができない。本発明において用いられる酸性物質として
は、酸性土壌など水素イオン交換能を持つ固体を含め、
組成物のｐＨを酸性に保つ物質が幅広く用いられる。本
発明において、ＶＡ菌根菌組成物に使用できる担体とし
ては、以下の物が挙げられる。

【００７６】固体担体としては、鉱物質粉末であるカオ
リン、珪藻土、酸性白土など；植物質粉末であるデンプ
ン、セルロースなど；高分子化合物であるポリアクリル
酸架橋重合体塩、ポリビニルアルコールなどが挙げられ
る。液体担体としては、水、アルコール類、炭化水素類
などが挙げられる。また、水和剤とする場合には、基剤
としてラノリンなど、乳化剤として石けんなどが用いら
れる。

【００７７】また、本発明の組成物中には、種々の肥料
成分、農薬成分などを添加することができる。肥料成分
としては硫安、過リン酸石灰等の無機肥料や油かす等の
有機肥料を用いることができる。農薬成分としては、種
々の殺菌剤、殺虫剤、除草剤等を用いることができる。
ただし以上の各成分は、ＶＡ菌根菌および植物に対し
て、害作用の低いものを用いなければならない。

【００７８】本発明のＶＡ菌根菌組成物は散剤、顆粒
剤、丸剤、錠剤、液剤、水和剤、乳剤、ゲル状剤、スラ
リー状剤などの剤形にすることができる。本発明のＶＡ
菌根菌含有組成物は、圃場や栽培ポット等の土壌栽培
や、バーミキュライトやロックウール等による人工土壌
栽培、水耕栽培等の養液栽培、無菌容器内における寒天
培地等の固形培地栽培等の様々な栽培方法における植物
に応用可能である。

【００７９】使用方法に関しては、ＶＡ菌根菌含有組成
物を土壌に混合するか、根の近傍に置くだけでよく、そ
の前後または同時に肥料や農薬を与えてもよい。ただし
農薬によっては、ＶＡ菌根菌の生育に害作用を有するも
のがあるので、使用前に調査が必要である。

【００８０】

【発明の効果】本発明のＶＡ菌根菌の製造方法を用いれ
ば、生産効率の向上、省スペース化、年に複数回の生産
が可能となり、ＶＡ菌根菌を大量に得られるので、ＶＡ
菌根菌の製造方法として極めて有用である。

【００８１】また本発明の植物の培養方法を用いれば、
工業的に効率良く植物を培養できるので、植物の培養方
法として極めて有用である。また本発明の苗の生産方法
を用いれば、植物の組織培養によって苗を生産する方法
において、苗の良好な活着（生存率の向上）、生長が得
られ、商品価値のある苗の歩留りが非常に向上し、苗の
実用的な生産方法として極めて有用である。

【００８２】また本発明のＶＡ菌根菌組成物によれば、
製造コストが安価で、植物とＶＡ菌根菌とを効率的に共
生させることができ、植物への施肥量軽減、悪い栽培環
境に対する抵抗性の向上、農産物の品質の向上などが可
能となるので、ＶＡ菌根菌の実用的な製剤として極めて
有用である。

【００８３】

【実施例】

実施例１および比較例１ ２．５ｍｍメッシュ篩を通過し、１．０ｍｍメッシュ篩
を通過しなかった赤玉土を底に穴を開けたコンテナに１
０リッター入れた。アルファルファの栽培プランターに
ＶＡ菌根菌であるギガスポラ・マルガリータの胞子を接
種し、数ヶ月栽培した後、土壌から胞子を得た。

【００８４】占有面積８５０ｃｍ² のコンテナに仕切り
板を設置し、２０区画に分割し１区画における根の生育
可能な空間の水平方向の平均断面積が４２．５ｃｍ² に
なるようにした。上記の胞子を水に懸濁してコンテナの
１区画当り１５個植え付け穴に接種した後、そこに草丈
５ｃｍのバヒアグラス（Ｐａｓｐａｌｕｍｎｏｔａｔｕ
ｍ）の苗をコンテナ１区画に１本づつ計２０本植え付け
た。このコンテナを３段の棚に３個づつ、計９個配置し
温室で培養したものを実施例１とした。

【００８５】比較例１として圃場に１苗当り３０個のＶ
Ａ菌根菌を接種したバヒアグラスを移植して培養を行な
った。ＶＡ菌根菌を接種してから４ヶ月後に培養を終了
し、地上部を刈り取った後、培土を３日間乾燥させよく
撹拌して各プランターから１００ｍｌをサンプリング
し、胞子を計数した。比較例２についてはコンテナ９個
に相当する容積の土を圃場から採取し、そこから１００
ｍｌサンプリングすることを９回繰り返し胞子を計数し
た。さらに、実施例１、比較例１、共にこれを繰り返
し、１年間に３回ＶＡ菌根菌の培養を行なった。サンプ
リング時の胞子数を基にコンテナ全体の総胞子数を推定
し、単位面積当りの生産胞子数を求めたところ、下記表
１のようになった。

【００８６】比較例１に比べて実施例１では新たに非常
に多くの胞子が生産され、総生産数で約１８倍、単位面
積当りで約５４倍の胞子が生産されることがわかった。

【００８７】

【表１】 培養期間 総生産胞子数 単位面積当りの胞子数 （ヶ月） （個） （個／ｃｍ²） １回目 実施例１ 4 597600 234.4 比較例１ 4 30600 4.0 ２回目 実施例１ 4 802800 314.8 比較例１ 4 70200 9.2 ３回目 実施例１ 4 405900 159.2 比較例１*¹ 4 − − 年間合計 実施例１ 12 1806300 708.4 比較例１ 12 100800 13.2 ＊１）冬期、植物体地上部枯死の為、サンプリング不能

【００８８】実施例２および比較例２ ２．５ｍｍメッシュ篩を通過し、１．０ｍｍメッシュ篩
を通過しなかった赤玉土を根の生育可能な空間の水平方
向の平均断面積が１０ｃｍ² であるガラス製底穴付き棒
びんに１００ｍｌ充填した。アルファルファの栽培プラ
ンターにＶＡ菌根菌であるギガスポラ・マルガリータの
胞子を接種し、２年間栽培した後、土壌から胞子を得
た。

【００８９】実施例２として、上記胞子を水に懸濁して
棒びん１本当り２０個植え付け穴に接種した後、そこに
白クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ）の
種子を３個播種した。播種後、２５℃±２℃、１０００
０ルックス、日長時間１６時間の人工気象器中棒びんを
１段に１００本計３段に渡って３００本を積載し培養を
行なった。比較例２として、実施例と同じ棒びんを用
い、温室中２次元的に棒びんを３００本並べ培養を行な
った。

【００９０】実施例２、比較例２共に、ＶＡ菌根菌を接
種してから３ヶ月後に培養を終了させ、棒びん中の土を
合わせて乾燥させよく撹拌した後、その一部をサンプリ
ングし、胞子数を計数した。さらに、実施例２、比較例
２共にこれを繰り返し、１年間に４回ＶＡ菌根菌の培養
を行なった。サンプリング時の胞子数を基に全棒びん中
の胞子数を推定し、単位面積当りの生産胞子数を求めた
ところ、下記表２のようになった。

【００９１】比較例２に比べて実施例２では、安定して
新たに非常に多くの胞子が生産され、総胞子数で約２．
２倍、単位面積当りで約６．６倍の胞子が生産された。

【００９２】

【表２】 培養期間 総生産胞子数 単位面積当りの胞子数 （ヶ月） （個） （個／ｃｍ²） １回目 実施例２ 3 399600 249.8 比較例２ 3 145800 30.4 ２回目 実施例２ 3 325500 203.4 比較例２ 3 210900 43.9 ３回目 実施例２ 3 328200 205.1 比較例２ 3 169500 35.3 ４回目 実施例２ 3 309600 193.5 比較例２ 3 95700 19.9 年間合計 実施例２ 12 1362900 851.8 比較例２ 12 621900 129.6

【００９３】実施例３および比較例３，４ ２．５ｍｍメッシュ篩を通過し、１．０ｍｍメッシュ篩
を通過しなかった赤玉土を縦３７．４ｃｍ、横２７．４
ｃｍ、高さ６．２ｃｍのプラスチック製バットに４６０
０ｍｌ充填した。アルファルファの栽培プランターにＶ
Ａ菌根菌であるギガスポラ・マルガリータの胞子を接種
し、数ヶ月栽培した後、土壌から胞子を得た。

【００９４】実施例３として、上記バットに仕切りを入
れ、３５区画に分割し１区画における根の生育可能な空
間の水平方向の平均断面積が３０ｃｍ² になるようにし
た。上記胞子を水に懸濁して１区画当り１３個接種し
た。１区画毎にトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の種子を３個播種し、発芽後間引
きをして１区画当り１個体になるようにし、１バットに
３５個体を培養した。人工気象器中の４段の棚に各段２
バット、計８バットを配置して、２５℃±２℃、１００
００ルックス、日長時間１６時間で培養を行なった。

【００９５】比較例３として、バットに仕切りを入れず
に上記胞子を植物１個体当り１３個接種し、１バットに
３５個体のトマトを培養し、その他は実施例と同様の条
件で培養を行なった。

【００９６】比較例４として根の生育可能な空間の水平
方向の平均断面積が２４３ｃｍ² である１／５０００ａ
ワグネルポットに実施例と同様の赤玉土を３リッター充
填し、ギガスポラ・マルガリータの胞子を１ポット当り
３００個接種した。そこにトマトを播種し、ポット当り
１個体を培養した。ポットは温室中に２次元的に並べ、
日中２０〜３０℃、夜間１５℃±３℃、日長条件のコン
トロールはせずに培養を行なった。

【００９７】実施例３、比較例３、４共に、ＶＡ菌根菌
を接種してから３ヶ月後に培養を終了し、培土を乾燥さ
せよく撹拌して、実施例３および比較例３では各バット
から、また比較例４では各ポットから１００ｍｌをサン
プリングし、胞子数を計数した。サンプリング時の胞子
数を基に全容器中の胞子数を推定し、単位面積当りの生
産胞子数を求めたところ、下記表３のようになった。

【００９８】比較例３、４に比べて、植物１個体当りの
培土容量の少ない実施例３では、非常に多くの胞子が効
率よく生産され、その量は単位面積当りで比較例３の約
３．４倍、比較例３の約１６．３倍となった。

【００９９】

【表３】 培養期間 総生産胞子数 単位面積当りの胞子数 （ヶ月） （個） （個／ｃｍ²） 実施例３ 3 366758 178.9 比較例３ 3 108100 52.7 比較例４ 3 41220 11.1

【０１００】実施例４および比較例５ ２．５ｍｍメッシュ篩を通過し、１．０ｍｍメッシュ篩
を通過しなかった赤玉土を縦３７．４ｃｍ、横２７．４
ｃｍ、高さ６．２ｃｍのプラスチック製バットに４６０
０ｍｌ充填した。アルファルファの栽培プランターにＶ
Ａ菌根菌であるギガスポラ・マルガリータの胞子を接種
し、数ヶ月栽培した後、土壌から胞子を得た。

【０１０１】実施例４として、上記バットに仕切りを入
れ、３５区画に分割し１区画における根の生育可能な空
間の水平方向の平均断面積が３０ｃｍ² になるようにし
た。上記胞子を水に懸濁して１区画当り１３個接種し
た。１区画毎にトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の種子を３個播種し、発芽後間引
きをして１区画当り１個体になるようにし、１バットに
３５個体を培養した。人工気象器中の５段の棚に各段４
バット、計２０を配置して、２５℃±２℃、１００００
ルックス、日長時間１６時間で培養を行いトマトの苗を
生産した。

【０１０２】また、比較例５として、上記胞子を接種し
ないこと以外は実施例４と同様の方法でトマトの栽培を
行なった。実施例４のトマトの苗を圃場に移植し栽培を
行なったところ、比較例５のトマトの苗に比べて初期生
長が非常に早く、多くの収穫が得られた。

【０１０３】実施例５および比較例６ ＜ＶＡ菌根菌胞子生産＞２．５ｍｍメッシュ篩を通過
し、１．０ｍｍメッシュ篩を通過しなかった赤玉土を水
平方向の断面積が１０ｃｍ² 、高さ１３０ｍｍのガラス
製底穴付き棒びんに１００ｍｌ充填した。アルファルフ
ァの栽培プランターにＶＡ菌根菌であるギガスポラ・マ
ルガリータの胞子を接種し、２年間栽培した後、土壌か
ら胞子を得た。

【０１０４】上記胞子を水に懸濁して棒びん１本当り２
０個植え付け穴に接種した後、そこに白クローバー（Ｔ
ｒｉｆｏｌｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ）の種子を３個播種し
た。播種後、２５℃±２℃、１００００ルックス、日長
時間１６時間の人工気象器中で培養を行ない、ＶＡ菌根
菌を接種してから３ヶ月後に培養を終了した。これによ
って、棒びん１本当り１３３２個の胞子が得られ、この
胞子を実験に供与した。

【０１０５】＜ｉｎ ｖｉｔｒｏ植物の生産＞圃場で栽
培しているアスパラガス雄株（品種：メリーワシントン
５００Ｗ）の若い茎部を採取した。表面を洗剤でよく洗
い、７０％エタノールで２０秒、有効塩素濃度１％の次
亜塩素酸ナトリウム溶液で２０分表面殺菌した後、滅菌
水で２回良く洗浄し、茎を５ｍｍの長さに輪切りにし
た。

【０１０６】ショ糖を３％、ナフタレン酢酸を３ｍｇ／
リッター、カイネチンを１ｍｇ／リッター含有したムラ
シゲ・スクーグの液体培地５０ｍｌを入れた三角フラス
コに植え付けた。その後培養温度２５℃、２０００ルッ
クスの光を１６時間照射、８時間暗黒で、３０日間、毎
分１００回転の旋回培養を行なったところカルスが形成
した。

【０１０７】次いで、孔径２５０μｍと２．８ｍｍのス
テンレス篩を用いて、その間の大きさのカルスを選別
し、ホルモンを含まない上記培地に植え継いで、さらに
３０日間培養したところ、不定胚が形成された。次いで
不定胚を充実させるために、水で希釈し、さらに２日間
培養を行なった後、ショ糖を３％、ゲランガムを０．２
％含む、ムラシゲ・スクーグの固体培地上に置床した。
その後、ホルモンを含まない培地上で培養を行ない、不
定胚由来の小植物が得られ、これを実験に供与した。

【０１０８】＜順化＞実施例５は、無菌容器内で得られ
た小植物を容器から取り出し、特に根に付着している無
菌培養用の培地を滅菌水で洗い流して培養土に植え付
け、その時同時にギガスポラ・マルガリータの胞子を１
植物当り５０個接種した。その後小さな穴の開いた覆い
をして２５℃、１６時間照明下（４０００ルックス）で
管理した。特に順化初期には、ほぼ１００％に近い高湿
度に保ち、２週間後に覆いを取り除き、温室で培養を続
けた。

【０１０９】比較例６は、胞子接種の工程を除き実施例
５と同様の操作を行なった。なお使用した培養土は、滅
菌した田土、たい肥、モミガラ薫炭を４：２：１で配合
したもので、栽培容器は直径９ｃｍのビニールポットで
ある。実施例５、比較例６ともに植え付け後９週目まで
の植物の生存率と生長量を測定した結果を下記表４と表
５に示す。実施例５は、比較例６と比較すると優良な苗
を生産することができることがわかった。

【０１１０】

【表４】表４：生存率（％） （繰り返し数） １Ｗ ２Ｗ ４Ｗ ６Ｗ ９Ｗ 実施例５ 28 100.0 89.3 71.4 64.3 53.6 比較例６ 34 44.1 14.7 5.9 5.9 5.9

【０１１１】

【表５】表５：生長量（ｃｍ） （繰り返し数） １Ｗ ２Ｗ ４Ｗ ６Ｗ ９Ｗ 実施例５ 28 5.0 10.1 15.7 19.2 20.5 比較例６ 34 4.8 9.5 11.9 12.7 13.1

【０１１２】実施例６および比較例７ ニンジンの苗の生産方法については以下に説明する。 ＜胞子増殖＞実施例５と同様に行なった。

【０１１３】＜ｉｎ ｖｉｔｒｏ植物の生産＞ニンジン
種子（品種：時なし五寸）を希釈した次亜塩素酸ナトリ
ウム液（有効塩素量０．５％以上）で超音波をかけなが
ら殺菌処理を行なう。これを滅菌水でよくすすいだもの
を寒天０．５％としょ糖０．５％を含む培地に置床し、
１６時間４０００ルックスの光照射下で２５度で培養
し、１週間後にその下胚軸を外植片とする。培地はしょ
糖３％、２，４−Ｄ １ｍｇ／リッター、ゲランガム
０．２％を含むＭＳ培地で、同条件で培養した。１ヶ月
の培養の後、得られたカルスをホルモンを含んでいない
同様の培地に移植したところ、移植後２週目から不定胚
の形成がみられた。この不定胚により再分化した植物を
実験に供与した。

【０１１４】＜順化＞実施例６は無菌容器内で得られた
小植物を容器から取り出し、特に根に付着している無菌
培養用の培地を滅菌水で洗い流して培養土に植え付け、
その時同時にギガスポラ・マルガリータの胞子を１植物
当り５０個接種した。その後小さな穴の開いた覆いをし
て、２５℃、１６時間照明下（４０００ルックス）で管
理した。特に順化初期には、ほぼ１００％に近い高湿度
に保ち、２週間後に覆いを取り除き、温室で培養を続け
た。

【０１１５】比較例７は、胞子接種の工程を除き実施例
６と同様の操作を行なった。なお使用した培養土は、滅
菌したバーミキュライトで、栽培容器は直径９ｃｍのビ
ニールポットである。実施例６、比較例７ともに植え付
け後９週目までの植物の生存率を測定した。実施例６
は、比較例７と比較すると苗を大量に生産することがで
きることがわかった。

【０１１６】

【表６】表６：生存率（％） （繰り返し数） １Ｗ ２Ｗ ４Ｗ ６Ｗ ９Ｗ 実施例６ 36 97.2 83.3 75.0 75.0 75.0 比較例７ 36 47.2 33.3 13.9 13.9 13.9

【０１１７】実施例７および比較例８ 実施例２において得られたＶＡ菌根菌含有赤玉土を、密
封容器に入れ６ケ月間室温で保存した。これを７号の植
木鉢１つにつき１．５ｍｌ（ＶＡ菌根菌胞子を約２０個
含有する）用意し、あらかじめ１２０℃、６０分間高圧
蒸気滅菌した土壌に混合し、そこに草丈１０ｃｍのナス
の苗を植え付けた。このような鉢を１０鉢作り栽培を行
なった。

【０１１８】５本の苗について、栽培４０日後にＶＡ菌
根菌の感染率の調査を行なった。調査は、１ｃｍ以上の
分枝した根をランダムに５０本採取し、トリパンブルー
によって染色し、顕微鏡下で観察して感染したものの割
合を調べることによって行なった。比較例８として、Ｖ
Ａ菌根菌を含まない赤玉土のみの試験を行なった。結果
を表７を示す。

【０１１９】

【表７】

【０１２０】また残りの苗について、感染率調査を行な
わずに栽培を続けたところ、実施例ではナスは非常に良
く生長し、多くの収穫を得ることができた。

【０１２１】実施例８および比較例９，１０ 実施例３において得られた胞子を含有する培地約１０ｍ
ｌを２００ｍｇ／リッターのクエン酸水溶液２０ｍｌと
混合し、さらに乾熱滅菌した酸性白土１０ｇを混合する
ことによってスラリー状のＶＡ菌根菌組成物を得た。こ
の組成物を３ヶ月間室温で保存した。

【０１２２】これを７号の植木鉢１つにつき５．５ｇ
（ＶＡ菌根菌胞子を約３０個含有する）用意し、あらか
じめ１２０℃、６０分間高圧蒸気滅菌した土壌を混合
し、そこに草丈１０ｃｍのダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍ
ａｘ）の苗を植え付けた。このような鉢を１０鉢作り栽
培を行なった。５本の苗について、栽培４０日後にＶＡ
菌根菌の感染率の調査を行なった。

【０１２３】調査は、１ｃｍ以上の分枝した根をランダ
ムに５０本採取し、トリパンブルーによって染色し、顕
微鏡下で観察して感染したものの割合を調べることによ
って行なった。比較例として土壌から単離したＶＡ菌根
菌胞子のみ（比較例９）、ＶＡ菌根菌を含まない乾熱滅
菌した酸性白土（比較例１０）の試験を行なった。結果
を表８に示す。

【０１２４】

【表８】 感染率 実施例８ ＶＡ菌根菌含有組成物 68％ 比較例９ ＶＡ菌根菌胞子のみ 12％ 比較例10 ＶＡ菌根菌を含まない乾熱滅菌した酸性白土 0％

【０１２５】また残りの苗について、感染率調査を行な
わずに栽培を続けたところ、実施例ではダイズは非常に
良く生長し、多くの収穫を得ることができた。

【０１２６】実施例９ 縦５６ｃｍ、横３２ｃｍ、高さ８ｃｍのプラスチック製
育苗箱にプラスチック製の仕切り板を設置し、１区画に
おける根の生育可能な空間の水平方向の平均断面積が１
６ｃｍ² になるように１１２区画に分割した。この育苗
箱に２．５ｍｍメッシュ篩を通過し、１．０ｍｍメッシ
ュ篩を通過しなかった赤玉土を１４リッター充填した。

【０１２７】アルファルファの栽培プランターにＶＡ菌
根菌であるギガスポラ・マルガリータの胞子を接種し数
ヶ月栽培した後土壌から胞子を得た。上記胞子を水に懸
濁して１区画当り１０個接種した。１区画毎にアスパラ
ガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）
の種子を３個播種し、発芽後間引きをして１区画当り１
個体になるようにし、１箱に１１２個体を培養した。人
工気象器中の３段の棚に各段４箱、計１２箱を配置し
て、２５℃±２℃、７０００ルックス、日長時間１６時
間、適宜灌水、施肥を行ない培養した。

【０１２８】ＶＡ菌根菌を接種してから１０週間後に培
養を終了し、培土を乾燥させよく撹拌して、１００ｍｌ
をサンプリングし、胞子数を計数した。サンプリング時
の胞子数を基に全容器中の胞子数を推定し、総生産胞子
数を求めたところ、下記表９のようになった。

【０１２９】

【表９】 培養期間(週間) 総生産胞子数(個) 実施例９ 10 2293872

【０１３０】またアスパラガスの苗を圃場に移植し栽培
を行なったところ、通常の苗に比べて初期生長が非常に
早く、優良な植物体を得ることができ、その後多くの収
穫を得ることができた。一方、下記のようにして組織培
養することにより植物を得た。

【０１３１】温室で培養しているカーネーションの側芽
を採取し、表面を洗剤でよく洗い、有効塩素濃度０．５
％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で１０分間表面を殺菌
し、滅菌水で３回良く洗浄した。この側芽より、実体顕
微鏡下で茎頂を摘出した。この茎頂を、ショ糖を３％、
ナフタレン酢酸を０．０２ｍｇ／リッター、ベンジルア
デニンを１ｍｇ／リッター、寒天を６ｇ／リッター含有
したムラシゲ・スクーグの固体培地に植え付けた。

【０１３２】置床後３日は２５℃で暗所培養し、その後
２５℃、２０００ルックスの光を１６時間照射、８時間
暗黒で１０週間の培養を行なったところ幼苗が得られ
た。以上のようにして得た組織培養苗に、上記で得られ
たＶＡ菌根菌を下記のようにして接種した。

【０１３３】無菌容器内で得られた小植物を容器から取
り出し、特に根に付着している無菌培養用の培地を滅菌
水で洗い流して培養土に植え付け、その時同時にギガス
ポラ・マルガリータの胞子を１植物当り５０個接種し
た。その後ビニール袋で覆いをして２５℃、１６時間照
明下（２０００ルックス）で管理した。３日後から植物
の様子を観察しながらビニール袋に少しづつ小さな穴を
空け、１１日かけて自然の環境に慣らした。２週間後に
ビニール袋の覆いを完全に取り除き、温室で培養を続け
た

【０１３４】なお使用した培養土は、滅菌した川砂で、
栽培容器は直径９ｃｍのビニールポットである。植え付
け後９週目までの植物の生存率と生長量を測定した結果
を下記の表１０および表１１に示す。優良な苗を大量に
生産することができることがわかった。

【０１３５】

【表１０】表１０：生存率（％） （繰り返し数） １Ｗ ２Ｗ ４Ｗ ６Ｗ ９Ｗ 実施例９ 17 100.0 88.2 76.5 70.6 70.6

【０１３６】

【表１１】表１１：生長量（ｃｍ） （繰り返し数） １Ｗ ２Ｗ ４Ｗ ６Ｗ ９Ｗ 実施例９ 12 3.2 5.8 8.8 12.3 16.4

【０１３７】上記で得られたＶＡ菌根菌を含む培土を篩
分して、胞子を含まない画分を除くことにより、胞子密
度を５倍に高めたＶＡ菌根菌含有培土を得た。１００ｍ
ｇ／リッターのクエン酸を含有する４０ｍｌの２％アル
ギン酸ナトリウム水溶液にギガスポラ・マルガリータ胞
子約２００個含むＶＡ菌根菌含有培土３ｍｌを入れ、溶
液中に均一に分散させた。上記溶液を２０％塩化カルシ
ウム水溶液に滴下させることによってゲル状のＶＡ菌根
菌含有組成物を得た。この組成物を密封容器に入れ６ヶ
月間室温で保存した。

【０１３８】これを７号の植木鉢１つにつき４ｇ（ＶＡ
菌根菌胞子を約２０個含有する）用意し、あらかじめ１
２０℃、６０分間高圧蒸気滅菌した土壌に深さ１０ｃｍ
の穴を開けて入れ、そのうえに草丈１２−１４ｃｍのト
マトの苗を植え付けた。このような鉢を１０鉢作り栽培
を行なった。

【０１３９】５本の苗について、栽培４０日後にＶＡ菌
根菌の感染率の調査を行なった。調査は、１ｃｍ以上の
分枝した根をランダムに５０本採取し、トリパンブルー
によって染色し、顕微鏡下で観察して感染したものの割
合を調べることによって行なった。結果を下記表１２に
示す。

【０１４０】

【表１２】

【０１４１】また残りの苗について、感染率調査を行な
わずに栽培を続けたところ、実施例ではトマトは非常に
良く生長し、多くの収穫を得ることができた。

フロントページの続き (72)発明者 宮本 園子 東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライオ ン株式会社内 (72)発明者 松野 里香 東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライオ ン株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ベシキュラー・アービュスキュラー菌根
   菌（のう状体と樹枝状体を有する内生菌根菌類：以下Ｖ
   Ａ菌根菌と称す）と植物の培養において、根の生育可能
   な空間の水平方向の平均断面積が、０．５〜１００ｃｍ
   ² の構造を有する容器を、人工的に制御した培養環境下
   で三次元的に配置し培養することを特徴とする、ＶＡ菌
   根菌の製造方法。
2. 【請求項２】 ＶＡ菌根菌と植物の培養において、根の
   生育可能な空間の水平方向の平均断面積が、０．５〜１
   ００ｃｍ² の構造を有する容器を、人工的に制御した培
   養環境下で三次元的に配置し培養することを特徴とする
   植物の培養方法。
3. 【請求項３】 植物の組織培養によって苗を生産する方
   法において、請求項１の方法によって製造されたＶＡ菌
   根菌を植物に接種することを特徴とする苗の生産方法。
4. 【請求項４】 ＶＡ菌根菌と植物の培養において、根の
   生育可能な空間の水平方向の平均断面積が、０．５〜１
   ００ｃｍ² の構造を有する容器を、人工的に制御した培
   養環境下で三次元的に配置し培養したＶＡ菌根菌を含有
   することを特徴とするＶＡ菌根菌組成物。