JPH05222050A - 新規スクアレンシンセターゼ阻害剤及びそれからの製法 - Google Patents
新規スクアレンシンセターゼ阻害剤及びそれからの製法Info
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- JPH05222050A JPH05222050A JP4197405A JP19740592A JPH05222050A JP H05222050 A JPH05222050 A JP H05222050A JP 4197405 A JP4197405 A JP 4197405A JP 19740592 A JP19740592 A JP 19740592A JP H05222050 A JPH05222050 A JP H05222050A
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- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本願発明は、構造式；
【化５】
の化合物の回収可能な量を産生する醗酵ブロスを産生す
ることができるクルブラリア ルナータの生物学的に純
粋な培養物に関する。 【効果】 本願発明の培養により、スクアレンシンセタ
ーゼ阻害剤として有効な化合物を産生することができ、
抗高コレステロール血症剤の提供に有効なものである。
ることができるクルブラリア ルナータの生物学的に純
粋な培養物に関する。 【効果】 本願発明の培養により、スクアレンシンセタ
ーゼ阻害剤として有効な化合物を産生することができ、
抗高コレステロール血症剤の提供に有効なものである。
Description
【０００１】高コレステロール血症はアテローム性動脈
硬化症のような心臓血管系疾患の主要な危険因子の１つ
であることが知られている。胆汁酸吸収剤はこの症状を
治療するために用いられており、やや有効のようである
が、大量即ち一時に数グラムを消費せねばならず快適な
ものではない。
硬化症のような心臓血管系疾患の主要な危険因子の１つ
であることが知られている。胆汁酸吸収剤はこの症状を
治療するために用いられており、やや有効のようである
が、大量即ち一時に数グラムを消費せねばならず快適な
ものではない。
【０００２】現在市販されているＭＥＶＡＣＯＲ（商
標）（ロバスタチン）は酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクタ
ーゼを阻害することによりコレステロール生合成を制限
することによって機能する非常に活性な抗高コレステロ
ール血症剤群の１つである。
標）（ロバスタチン）は酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクタ
ーゼを阻害することによりコレステロール生合成を制限
することによって機能する非常に活性な抗高コレステロ
ール血症剤群の１つである。
【０００３】スクアレンシンテターゼは新たなコレステ
ロール生合成経路の最初の前駆段階に関与する酵素であ
る。この酵素は２分子のファルネシルピロリン酸の還元
的二量化を触媒してスクアレンを生成する。この前駆段
階のコレステロールへの阻害はユビキノン、ドリコール
及びイソペンテニルｔ−ＲＮＡへの生合成経路を妨害し
ないでおくべきである。
ロール生合成経路の最初の前駆段階に関与する酵素であ
る。この酵素は２分子のファルネシルピロリン酸の還元
的二量化を触媒してスクアレンを生成する。この前駆段
階のコレステロールへの阻害はユビキノン、ドリコール
及びイソペンテニルｔ−ＲＮＡへの生合成経路を妨害し
ないでおくべきである。
【０００４】スクアレンシンテターゼを阻害するこれま
での努力はＰ．オルチツ デ モンテラノ（Ortiz de M
ontellano ）等、J. Med. Chem. 第２０巻、第２４３頁
（１９７７年）及びＥ．Ｊ．コーリー（Corey)及びＲ．
ボランテ（Volante)、J. Am.Chem. Soc.第９８巻、第１
２９１頁（１９７６年）に記載されているように、ピロ
リン酸又はピロリン酸類縁体含有化合物の使用であっ
た。Ｓ．ビラー（Biller）（米国特許第４，８７１，７
２１号）はスクアレンシンテターゼの阻害剤としてイソ
プレノイド（ホスフィニルメチル）ホスホネートを記載
している。
での努力はＰ．オルチツ デ モンテラノ（Ortiz de M
ontellano ）等、J. Med. Chem. 第２０巻、第２４３頁
（１９７７年）及びＥ．Ｊ．コーリー（Corey)及びＲ．
ボランテ（Volante)、J. Am.Chem. Soc.第９８巻、第１
２９１頁（１９７６年）に記載されているように、ピロ
リン酸又はピロリン酸類縁体含有化合物の使用であっ
た。Ｓ．ビラー（Biller）（米国特許第４，８７１，７
２１号）はスクアレンシンテターゼの阻害剤としてイソ
プレノイド（ホスフィニルメチル）ホスホネートを記載
している。
【０００５】本発明はリン酸を含まないスクアレンシン
セターゼ阻害剤を産生するクルブラリア ルナータ（Cu
rvularia lunata)株を提供することである。
セターゼ阻害剤を産生するクルブラリア ルナータ（Cu
rvularia lunata)株を提供することである。
【０００６】本発明はスクアレンシンセターゼ阻害剤で
ある構造式（Ｉ）；
ある構造式（Ｉ）；
【化４】 の化合物を産生する新規な微生物に関する。式（Ｉ）の
化合物はコレステロール低下剤及び抗真菌剤として有用
である。式（Ｉ）の化合物はクルブラリア ルナータ株
の好気的発酵で製造される。とりわけ使用される株は、
株ＭＦ５５７３、ＭＦ５５７２あるいはこれらの変異株
から選択することができる。
化合物はコレステロール低下剤及び抗真菌剤として有用
である。式（Ｉ）の化合物はクルブラリア ルナータ株
の好気的発酵で製造される。とりわけ使用される株は、
株ＭＦ５５７３、ＭＦ５５７２あるいはこれらの変異株
から選択することができる。
【０００７】培養ＭＦ５５７３、クルブラリア ルナー
タｖａｒ．ルナータ、はフィクスエラスティカ（Ficus
elastica) 木樹皮（フィリピン）から単離された。この
培養物はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）にＡＴＣＣ７４０６７として寄託されている。
培養物ＭＦ５５７２は株クルブラリア ルナータｖａ
ｒ．アエリアであり木樹皮（フィリピン）から単離され
た。この培養物はＡＴＣＣ７４０６６として寄託されて
いる。
タｖａｒ．ルナータ、はフィクスエラスティカ（Ficus
elastica) 木樹皮（フィリピン）から単離された。この
培養物はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）にＡＴＣＣ７４０６７として寄託されている。
培養物ＭＦ５５７２は株クルブラリア ルナータｖａ
ｒ．アエリアであり木樹皮（フィリピン）から単離され
た。この培養物はＡＴＣＣ７４０６６として寄託されて
いる。
【０００８】一般に、本発明のクルブラリア ルナータ
株は多貧欲性であり、木及び多年性植物の幹、葉、樹皮
及び種子から単離することができる。これらの菌は種々
の方法により無菌培養中に容易に得ることができる。ほ
とんどの培養増殖は標準的な微生物培地上で中程度の速
度で増殖進展するが、この培地は穀物の抽出物、酵母抽
出物、果物抽出物、葉抽出物、単純な糖類、ポリサッカ
ライド、アミノ酸あるいはタンパク質加水分解物に限定
されるものではない。クルブラリア ルナータ株の単離
の最も単純で直接的な方法は、真菌分生子及び植物の障
害となる植物表面上ですでに展開されている分生子を有
する寄生された植物を収集することである。分生子は培
養を開始するために共通微生物培地に無菌的に移行する
ことができる。他の方法は枯化したあるいは老年植物木
を収集し，分生子及び分生子柄が展開するまで湿気チャ
ンバー中でこれらを培養し、次いで滅菌解剖器を使用し
て栄養培地へ移すことである。第三の方法は、豊富なク
ルブラリア ルナータに好都合であり、これは分生子の
増幅的産生に基づくものであり、株クルブラリアルナー
タは土壌、汚物あるいは葉積層のごとき共通有機基質か
らも回収することができる。少量のこれらの基質を滅菌
的に希釈しこの希釈物を抗菌性抗生物質を含有する微生
物培地に供給する。クルブラリア ルナータのコロニー
は急速に展開しその特徴的な分生子によりこの希釈物か
らの真菌展開物のコロニーから容易に区別される。更
に、単離の特異的方法は植物の外表面下にあるクルブラ
リアルナータコロニー組織のマイセリアに基づくもので
ある。選択的寒天培地上でのインキュベーションの前に
この植物試料の表面を滅菌することにより多くの望まし
くない真菌及び微生物を除去することができ、そしてク
ルブラリア ルナータのコロニーを更に容易に検知する
ことができる。
株は多貧欲性であり、木及び多年性植物の幹、葉、樹皮
及び種子から単離することができる。これらの菌は種々
の方法により無菌培養中に容易に得ることができる。ほ
とんどの培養増殖は標準的な微生物培地上で中程度の速
度で増殖進展するが、この培地は穀物の抽出物、酵母抽
出物、果物抽出物、葉抽出物、単純な糖類、ポリサッカ
ライド、アミノ酸あるいはタンパク質加水分解物に限定
されるものではない。クルブラリア ルナータ株の単離
の最も単純で直接的な方法は、真菌分生子及び植物の障
害となる植物表面上ですでに展開されている分生子を有
する寄生された植物を収集することである。分生子は培
養を開始するために共通微生物培地に無菌的に移行する
ことができる。他の方法は枯化したあるいは老年植物木
を収集し，分生子及び分生子柄が展開するまで湿気チャ
ンバー中でこれらを培養し、次いで滅菌解剖器を使用し
て栄養培地へ移すことである。第三の方法は、豊富なク
ルブラリア ルナータに好都合であり、これは分生子の
増幅的産生に基づくものであり、株クルブラリアルナー
タは土壌、汚物あるいは葉積層のごとき共通有機基質か
らも回収することができる。少量のこれらの基質を滅菌
的に希釈しこの希釈物を抗菌性抗生物質を含有する微生
物培地に供給する。クルブラリア ルナータのコロニー
は急速に展開しその特徴的な分生子によりこの希釈物か
らの真菌展開物のコロニーから容易に区別される。更
に、単離の特異的方法は植物の外表面下にあるクルブラ
リアルナータコロニー組織のマイセリアに基づくもので
ある。選択的寒天培地上でのインキュベーションの前に
この植物試料の表面を滅菌することにより多くの望まし
くない真菌及び微生物を除去することができ、そしてク
ルブラリア ルナータのコロニーを更に容易に検知する
ことができる。
【０００９】株クルブラリア ルナータは以下の形態学
的特徴を示す。コロニーは比較的早く増殖し、１週間で
以下の径に達する：コーンミール寒天（Difco Laborato
ries) 上で３５−４０ミリ；酵母麦芽抽出物寒天上で４
０ミリ（１０ｇ麦芽抽出物、２ｇ酵母抽出物、２０ｇ寒
天、１リッター蒸留水）、Ｖ８ジュース寒天上で４５−
５０ミリ（２００mlＶ８ジュース、Campbell Soup C
o.、３ｇCaCO3 、２０ｇ寒天、１リッター蒸留水で希
釈）。液内及び気中菌糸体の両者を有する酵母麦芽寒天
上では、放射鎖をしばしば形成し、熟成中綿毛状からコ
ットン状あるいは羊毛状になり、辺縁に付着し、しばし
ば長毛縁であり、辺縁では透明から青白い灰色であり、
しかしすぐに暗灰色あるいは暗オリーブー灰色、キャス
ターグレイ、ダークオリーブーグレイ、アイロングレ
イ、ダスキーグリーンーグレイ、ブラッキシュグレーン
ーグレイ、オリバセアスブラック（CastorGray, Dark O
live-gray, Iron Gray, Dusky Green-Gray, Blackish G
reen-Gray, Olivaceous Black) (Ridgway, R, 1912. Co
lor Standars and Nomenclature,Washigton, D,C, から
のカラーネームを利用）、反対面でも同様に、しばしば
老年部分においてはパッチあるいは透明から青白い灰色
の好気性菌糸の展開の綿状物を有し、場合により青白い
灰色から透明なセクターを有している。香味、硬化膜、
子座あるいは擬似包膜は不存在である。
的特徴を示す。コロニーは比較的早く増殖し、１週間で
以下の径に達する：コーンミール寒天（Difco Laborato
ries) 上で３５−４０ミリ；酵母麦芽抽出物寒天上で４
０ミリ（１０ｇ麦芽抽出物、２ｇ酵母抽出物、２０ｇ寒
天、１リッター蒸留水）、Ｖ８ジュース寒天上で４５−
５０ミリ（２００mlＶ８ジュース、Campbell Soup C
o.、３ｇCaCO3 、２０ｇ寒天、１リッター蒸留水で希
釈）。液内及び気中菌糸体の両者を有する酵母麦芽寒天
上では、放射鎖をしばしば形成し、熟成中綿毛状からコ
ットン状あるいは羊毛状になり、辺縁に付着し、しばし
ば長毛縁であり、辺縁では透明から青白い灰色であり、
しかしすぐに暗灰色あるいは暗オリーブー灰色、キャス
ターグレイ、ダークオリーブーグレイ、アイロングレ
イ、ダスキーグリーンーグレイ、ブラッキシュグレーン
ーグレイ、オリバセアスブラック（CastorGray, Dark O
live-gray, Iron Gray, Dusky Green-Gray, Blackish G
reen-Gray, Olivaceous Black) (Ridgway, R, 1912. Co
lor Standars and Nomenclature,Washigton, D,C, から
のカラーネームを利用）、反対面でも同様に、しばしば
老年部分においてはパッチあるいは透明から青白い灰色
の好気性菌糸の展開の綿状物を有し、場合により青白い
灰色から透明なセクターを有している。香味、硬化膜、
子座あるいは擬似包膜は不存在である。
【００１０】表面あるいは気中菌糸から生ずる菌糸体
は、１５−２５０×３−５μｍ、中隔を有し、直線状あ
るいは屈曲性であり、しばしば熟成中分岐状であり、頂
部は直線状、屈曲あるいは湾曲であり、平滑、薄いから
わずかに厚い壁を有し、３％KOH 中でオリーブーブラウ
ンからオリーブーグレイであり、４−１５の分生子を有
する。分生子産生細胞はポリトレティック、組み込まれ
た、不定形、仮軸のごときであり、通常分生子柄上の末
端であり、しばしば熟成中で節間を有し、分生子産生場
所での小さな孔の回りにわずかに暗い傷を有する。分生
子２１−３０×９−１３．５μｍ、通常３−中隔、しば
しば４−中隔、幅広い楕円形であり、二番目の間節、末
端細胞は屈曲、斜めに巻いており、わずかに平坦な傷を
有し、臍虫垂を有さず、平滑な青白いオリーブーブラウ
ンからオリーブーグレイであり、通常２つのわずかに暗
い中枢細胞を有する。３％KOH 中菌糸はオリーブーグレ
イからダークオリーブーグレイあるいはオリーブーブラ
ウンであり、中隔を有し、分岐がある。
は、１５−２５０×３−５μｍ、中隔を有し、直線状あ
るいは屈曲性であり、しばしば熟成中分岐状であり、頂
部は直線状、屈曲あるいは湾曲であり、平滑、薄いから
わずかに厚い壁を有し、３％KOH 中でオリーブーブラウ
ンからオリーブーグレイであり、４−１５の分生子を有
する。分生子産生細胞はポリトレティック、組み込まれ
た、不定形、仮軸のごときであり、通常分生子柄上の末
端であり、しばしば熟成中で節間を有し、分生子産生場
所での小さな孔の回りにわずかに暗い傷を有する。分生
子２１−３０×９−１３．５μｍ、通常３−中隔、しば
しば４−中隔、幅広い楕円形であり、二番目の間節、末
端細胞は屈曲、斜めに巻いており、わずかに平坦な傷を
有し、臍虫垂を有さず、平滑な青白いオリーブーブラウ
ンからオリーブーグレイであり、通常２つのわずかに暗
い中枢細胞を有する。３％KOH 中菌糸はオリーブーグレ
イからダークオリーブーグレイあるいはオリーブーブラ
ウンであり、中隔を有し、分岐がある。
【００１１】遺伝子クルブラリアは、優先的に３−４−
中隔、デマチウス科の隔膜分生子、及び非突出、丸い
臍、そして屈曲し、巻いた２番目の節間細胞を有する分
生子を生ずるポリトレティック分生子産生細胞の組み合
わせにより他の真菌遺伝子と区別される。遺伝子クルブ
ラリアにおいて、ルナータ種は比較的短く（＜３０μ
Ｍ）、通常３−中隔を有し、屈曲したそして平滑な分生
子により区別される。クルブラリア ルナータｖａｒ．
ルナータは遺伝子クルブラリアのタイプの種であり、培
養において支質形成がない点に特徴がある。クルブラリ
ア ルナータの種々のアエリアは培養における支質形成
によりさまざまなタイプのものと相違する。
中隔、デマチウス科の隔膜分生子、及び非突出、丸い
臍、そして屈曲し、巻いた２番目の節間細胞を有する分
生子を生ずるポリトレティック分生子産生細胞の組み合
わせにより他の真菌遺伝子と区別される。遺伝子クルブ
ラリアにおいて、ルナータ種は比較的短く（＜３０μ
Ｍ）、通常３−中隔を有し、屈曲したそして平滑な分生
子により区別される。クルブラリア ルナータｖａｒ．
ルナータは遺伝子クルブラリアのタイプの種であり、培
養において支質形成がない点に特徴がある。クルブラリ
ア ルナータの種々のアエリアは培養における支質形成
によりさまざまなタイプのものと相違する。
【００１２】ここで特許請求の範囲として請求している
生物学的に純粋な培養物であるクルブラリア ルナータ
は天然の環境から単離され微生物の混入がないものとし
て定義される。またここで特許請求の範囲として請求し
ているクルブラリア ルナータ培養物は天然環境から単
離され、式（Ｉ）の化合物の製造に影響を与える微生物
の混入がないものとして定義される。
生物学的に純粋な培養物であるクルブラリア ルナータ
は天然の環境から単離され微生物の混入がないものとし
て定義される。またここで特許請求の範囲として請求し
ているクルブラリア ルナータ培養物は天然環境から単
離され、式（Ｉ）の化合物の製造に影響を与える微生物
の混入がないものとして定義される。
【００１３】一般に特定の二次代謝産物の形成は予想し
得ないものであるが、本出願人は驚くべきことに株クル
ブラリア ルナータは式（Ｉ）の化合物であるスクアレ
ンシンテターゼ阻害剤を産生する能力において化学分類
的に同様であることを見いだした。これらの株は高速二
段階スクリーニング手法により容易に検知される。株は
単離され、液体栄養培地中で培養される。少量の試料は
定期的に除去され最終発酵ブロスは凍結保存される。こ
の少量の試料はスクリーニング手法の第一段階で使用さ
れる。この試料は有機溶媒で抽出される。この有機層は
濃縮され以下に述べるスクアレンシンセターゼ検定で試
験される。スクアレンシンセターゼ活性を示す化合物の
存在は試料のスクアレンシンセターゼ活性とコントロー
ルのスクアレンシンセターゼ活性との比較により決定さ
れる。スクアレンシンセターゼ検定において陽性を示す
発酵ブロスをスクリーニング手法の第二段階で試験す
る。凍結発酵ブロスを解凍し有機溶媒で抽出する。この
有機溶媒を濃縮し高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）により分析する。式（Ｉ）の化合物の存在は抽出
した試料のクロマトグラムと典型的（Ｉ）のクロマトグ
ラムとの比較により決定する。
得ないものであるが、本出願人は驚くべきことに株クル
ブラリア ルナータは式（Ｉ）の化合物であるスクアレ
ンシンテターゼ阻害剤を産生する能力において化学分類
的に同様であることを見いだした。これらの株は高速二
段階スクリーニング手法により容易に検知される。株は
単離され、液体栄養培地中で培養される。少量の試料は
定期的に除去され最終発酵ブロスは凍結保存される。こ
の少量の試料はスクリーニング手法の第一段階で使用さ
れる。この試料は有機溶媒で抽出される。この有機層は
濃縮され以下に述べるスクアレンシンセターゼ検定で試
験される。スクアレンシンセターゼ活性を示す化合物の
存在は試料のスクアレンシンセターゼ活性とコントロー
ルのスクアレンシンセターゼ活性との比較により決定さ
れる。スクアレンシンセターゼ検定において陽性を示す
発酵ブロスをスクリーニング手法の第二段階で試験す
る。凍結発酵ブロスを解凍し有機溶媒で抽出する。この
有機溶媒を濃縮し高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）により分析する。式（Ｉ）の化合物の存在は抽出
した試料のクロマトグラムと典型的（Ｉ）のクロマトグ
ラムとの比較により決定する。
【００１４】クルブラリア ルナータｖａｒ．ルナータ
ＭＦ５５７３はディリマリン、クエゾン市、フィリピン
で採集されたフィクス エラスティカの樹皮から回収さ
れた。樹皮ディスクは革パンチ（no.245, C.S. Osborne
＆Co., Harrison, NJ ）を使用して除去採集した。ディ
スクは約１cmの半径、０．３−１．０cmの厚さであり、
これは樹皮の厚さ及び木へのパンチを打つ力の量に依存
する。ディスクは繊維形成層に沿った断面の完全な樹皮
を含みしばしば外部木質部の薄板を含有する。各々の木
から採取したディスクは研究所への輸送のためマニラコ
イン包みに入れた。ディスクは１０％家庭用漂白剤中に
３分間浸し、減菌蒸留水で洗浄し、単離培地へ適用する
前にアルコールランプで短く燃焼させた。樹皮ディスク
を１００ミリ半径のプラスチック製ペトリ皿中の寒天培
地（１０ｇ麦芽抽出物、２ｇ酵母抽出物、１ｇプロピオ
ン酸ナトリウム、５ｇ脱水牛胆汁、１mgベノミル、５０
mgストレプトマイシンサルフェート、５０mgクロロテト
ラサイクリン、２０ｇ寒天、１リッター蒸留水）の下方
外部側に適用した。ペトリ皿を２４℃でインキュベート
し、樹皮ディスク及び寒天上の真菌コロニーの展開に対
してだいたい１日から二週間までの間で観察した。
ＭＦ５５７３はディリマリン、クエゾン市、フィリピン
で採集されたフィクス エラスティカの樹皮から回収さ
れた。樹皮ディスクは革パンチ（no.245, C.S. Osborne
＆Co., Harrison, NJ ）を使用して除去採集した。ディ
スクは約１cmの半径、０．３−１．０cmの厚さであり、
これは樹皮の厚さ及び木へのパンチを打つ力の量に依存
する。ディスクは繊維形成層に沿った断面の完全な樹皮
を含みしばしば外部木質部の薄板を含有する。各々の木
から採取したディスクは研究所への輸送のためマニラコ
イン包みに入れた。ディスクは１０％家庭用漂白剤中に
３分間浸し、減菌蒸留水で洗浄し、単離培地へ適用する
前にアルコールランプで短く燃焼させた。樹皮ディスク
を１００ミリ半径のプラスチック製ペトリ皿中の寒天培
地（１０ｇ麦芽抽出物、２ｇ酵母抽出物、１ｇプロピオ
ン酸ナトリウム、５ｇ脱水牛胆汁、１mgベノミル、５０
mgストレプトマイシンサルフェート、５０mgクロロテト
ラサイクリン、２０ｇ寒天、１リッター蒸留水）の下方
外部側に適用した。ペトリ皿を２４℃でインキュベート
し、樹皮ディスク及び寒天上の真菌コロニーの展開に対
してだいたい１日から二週間までの間で観察した。
【００１５】菌株ＭＦ５５７３はCurvularia lunata va
r. lunata と同定され、以下に記載するような形態学的
特徴を有する。
r. lunata と同定され、以下に記載するような形態学的
特徴を有する。
【００１６】コロニーは比較的速く成長し、１週間以内
に；コーンミール寒天上（Difco Laboratories）で３５
−４０mm；酵母−麦芽エキストラクト寒天上（１Ｌの蒸
留水中、１０ｇ麦芽エキストラクト、２ｇ酵母エキス、
２０ｇ寒天）で４０mm；V8ジュース寒天上（１Ｌの蒸留
水中２００mLＶ８ジュース Campbell Soup Co. 、３ｇ
CaCo3 、２０ｇ寒天）で４５−５０mmに達する。酵母−
麦芽寒天上で深部菌糸および気中菌糸を形成し、成長す
ると時にマージンは密で、微細な房で、マージンは無色
から淡いグレーで直に暗いグレーあるいは暗いオリーブ
グレー、CasterGray, Dark O1ive-Gray, Iron Gray, Du
sky Green-Gray, Blackish Green-Gray, Olivaceous Bl
ack である放射状の気菌糸、羽毛状から綿状あるいは柔
毛状の気菌糸を形成する（大文字の色名はRidgway, R.
1912. Color Standards and Nomenclature, Washingto
n, D.C.によるものである）。裏は同様であり、成長す
るに従い、しばしば無色から淡いグレーの気菌糸のパッ
チ状あるいは房状のものを形成する。そして時に淡いグ
レーから無色の扇状（sectors)、芳香（odors)、菌核
（sclerotia)、子座（stromata）を形成する、あるいは
擬似包膜のない気菌糸を形成する。
に；コーンミール寒天上（Difco Laboratories）で３５
−４０mm；酵母−麦芽エキストラクト寒天上（１Ｌの蒸
留水中、１０ｇ麦芽エキストラクト、２ｇ酵母エキス、
２０ｇ寒天）で４０mm；V8ジュース寒天上（１Ｌの蒸留
水中２００mLＶ８ジュース Campbell Soup Co. 、３ｇ
CaCo3 、２０ｇ寒天）で４５−５０mmに達する。酵母−
麦芽寒天上で深部菌糸および気中菌糸を形成し、成長す
ると時にマージンは密で、微細な房で、マージンは無色
から淡いグレーで直に暗いグレーあるいは暗いオリーブ
グレー、CasterGray, Dark O1ive-Gray, Iron Gray, Du
sky Green-Gray, Blackish Green-Gray, Olivaceous Bl
ack である放射状の気菌糸、羽毛状から綿状あるいは柔
毛状の気菌糸を形成する（大文字の色名はRidgway, R.
1912. Color Standards and Nomenclature, Washingto
n, D.C.によるものである）。裏は同様であり、成長す
るに従い、しばしば無色から淡いグレーの気菌糸のパッ
チ状あるいは房状のものを形成する。そして時に淡いグ
レーから無色の扇状（sectors)、芳香（odors)、菌核
（sclerotia)、子座（stromata）を形成する、あるいは
擬似包膜のない気菌糸を形成する。
【００１７】分生子柄は表面あるいは気菌糸から形成さ
れ、１５−２５０×３−５μm で隔壁を有し、直状（st
raight）あるいは曲状（flexuous）であり、成長すると
時に枝分れする。そして先端は直状（straight）、曲状
（curved）あるいは膝状に屈曲（geniculate）してお
り、滑面で、薄いかやや厚い壁を有し、３％ KOH中でオ
リーブブラウンからオリーブグレーを呈し、４−１５の
分生子を有する。分生子由来の細胞はpolytretic, inte
grated, indeterminate, sympodialであり、通常は分生
子柄の端に存在し、時に成長すると間にも存在し、分生
子由来の面側にある微孔を包むようにやや暗色のscarが
ある。分生子は２１−３０×９−１３．５μｍであり、
通常３つの隔壁を有し、時に４つの隔壁を有することも
ある。幅広の楕円状（elliptical）で、２節からなり、
末端細胞は曲状でしばしば斜めに膨張した、やや平らな
scarを基底部に有し、hilar appendix（突起）はなく、
滑面で、淡いオリーブブラウンからオリーブグレーを呈
し、通常は２つの中心細胞はやや暗色である。菌糸は３
％KOH 中で淡いオリーブグレーから暗いオリーブグレー
あるいはオリーブブラウンを呈し、隔壁を有し、枝分れ
がある。
れ、１５−２５０×３−５μm で隔壁を有し、直状（st
raight）あるいは曲状（flexuous）であり、成長すると
時に枝分れする。そして先端は直状（straight）、曲状
（curved）あるいは膝状に屈曲（geniculate）してお
り、滑面で、薄いかやや厚い壁を有し、３％ KOH中でオ
リーブブラウンからオリーブグレーを呈し、４−１５の
分生子を有する。分生子由来の細胞はpolytretic, inte
grated, indeterminate, sympodialであり、通常は分生
子柄の端に存在し、時に成長すると間にも存在し、分生
子由来の面側にある微孔を包むようにやや暗色のscarが
ある。分生子は２１−３０×９−１３．５μｍであり、
通常３つの隔壁を有し、時に４つの隔壁を有することも
ある。幅広の楕円状（elliptical）で、２節からなり、
末端細胞は曲状でしばしば斜めに膨張した、やや平らな
scarを基底部に有し、hilar appendix（突起）はなく、
滑面で、淡いオリーブブラウンからオリーブグレーを呈
し、通常は２つの中心細胞はやや暗色である。菌糸は３
％KOH 中で淡いオリーブグレーから暗いオリーブグレー
あるいはオリーブブラウンを呈し、隔壁を有し、枝分れ
がある。
【００１８】菌株ＭＦ５５７２はDilliman, Quezon Cit
y, Philippinesで採集された未同定の樹木の樹皮から得
られた。樹皮片はレザーパンチ（no. 245, C.S. Osborn
e ＆CO., Harrison, NJ ）を用いて打ち抜いた。片は直
径およそ１cm、樹皮の厚さと樹木をハンマーで打ち抜い
た時の力加減に依存して厚さ０．３−１．０cmである。
樹皮片は樹皮の形成層に沿った全ての部分を含有し、時
に外部木質部の外壁部を含む。各々の樹木からの樹皮片
は研究室に移送するためにマニラコインの包に置かれ
る。樹皮片は１０％家庭用漂白剤で３分間洗浄され、滅
菌蒸留水で洗い、単離培地に付する前に短時間アルコー
ルランプで燃やす。樹皮片を外側を下にするようにして
直径１００mmのプラスチックシャーレ上の寒天培地（１
０ｇ麦芽エキス、２ｇ酵母エキス、１ｇプロピオン酸ナ
トリウム、５ｇ無水牛胆汁、１mgベノミル、５０mg硫酸
ストレプトマイシン、５０mgクロロテトラサイクリン、
２０g 寒天、１リッター蒸留水）に付ける。シャーレを
２４℃にてインキュベートし、大体毎日、２週間くらい
まで樹皮片および寒天上にカビのコロニーが生えるまで
観察する。
y, Philippinesで採集された未同定の樹木の樹皮から得
られた。樹皮片はレザーパンチ（no. 245, C.S. Osborn
e ＆CO., Harrison, NJ ）を用いて打ち抜いた。片は直
径およそ１cm、樹皮の厚さと樹木をハンマーで打ち抜い
た時の力加減に依存して厚さ０．３−１．０cmである。
樹皮片は樹皮の形成層に沿った全ての部分を含有し、時
に外部木質部の外壁部を含む。各々の樹木からの樹皮片
は研究室に移送するためにマニラコインの包に置かれ
る。樹皮片は１０％家庭用漂白剤で３分間洗浄され、滅
菌蒸留水で洗い、単離培地に付する前に短時間アルコー
ルランプで燃やす。樹皮片を外側を下にするようにして
直径１００mmのプラスチックシャーレ上の寒天培地（１
０ｇ麦芽エキス、２ｇ酵母エキス、１ｇプロピオン酸ナ
トリウム、５ｇ無水牛胆汁、１mgベノミル、５０mg硫酸
ストレプトマイシン、５０mgクロロテトラサイクリン、
２０g 寒天、１リッター蒸留水）に付ける。シャーレを
２４℃にてインキュベートし、大体毎日、２週間くらい
まで樹皮片および寒天上にカビのコロニーが生えるまで
観察する。
【００１９】菌株ＭＦ５５７２はCurvularia lunata va
r.aeria と同定され、以下に記載するような形態学的特
徴を有する。
r.aeria と同定され、以下に記載するような形態学的特
徴を有する。
【００２０】コロニーは比較的速く成長し、１週間以内
に；コーンミール寒天上（Difco Laboratories）で３０
−３５mm；酵母−麦芽エキストラクト寒天上（１リッタ
ーの蒸留水中、１０ｇ麦芽エキストラクト、２ｇ酵母エ
キス、２０ｇ寒天）で３０−３５mm；Ｖ８ジュース寒天
上（１リッターの蒸留水中２００mLＶ８ジュースCampbe
ll Soup Co.,３ｇCaCO3,２０ｇ寒天）で４０−５５mmに
達する。酵母−麦芽寒天上で深部菌糸および気中菌糸を
形成し、横面から形成され、早期にはベルベット状から
羽毛状で、成長すると羽毛状から柔毛状であり、マージ
ンをやや形成し、平らから波状で、マージンは無色から
淡いグレーで直ちに暗いグレー様オリーブ、グレーから
暗いオリーブグレー、Smoke Gray, Light Grayish Oliv
e, DeepOlive-Gray, Dark Olive-Gray, Iron Gray, Cas
tor Gray を呈する（大文字の色名はRidgway, R. 1912.
Color Standards and Nomenclature, Washington, D.
C.によるものである）。裏面はマージンまで黄色様グレ
ーであり、直ちにオリーブ様グレー、成長するに従い、
暗いオリーブブラックスポットやパッチを寒天に形成
し、しばしば加齢部に無色から淡いグレーの気菌糸のパ
ッチや房を形成し、odor状で、pseudotheciaはない。菌
の表面は３週間を過ぎると、通常直状（straight）から
曲状（curved）、円柱形（cylindrical)、指状（finger
-like)の子座（stromata）を形成し、０．５−１mmの尾
を有し、加齢部からコロニー表面へ投射している。子座
（stromata）形成は富栄養培地でよく形成され、このよ
うな培地は例えば、ポテト−デキストロース寒天、オー
トミール寒天、グルコース−酵母−麦芽エキス寒天であ
る。
に；コーンミール寒天上（Difco Laboratories）で３０
−３５mm；酵母−麦芽エキストラクト寒天上（１リッタ
ーの蒸留水中、１０ｇ麦芽エキストラクト、２ｇ酵母エ
キス、２０ｇ寒天）で３０−３５mm；Ｖ８ジュース寒天
上（１リッターの蒸留水中２００mLＶ８ジュースCampbe
ll Soup Co.,３ｇCaCO3,２０ｇ寒天）で４０−５５mmに
達する。酵母−麦芽寒天上で深部菌糸および気中菌糸を
形成し、横面から形成され、早期にはベルベット状から
羽毛状で、成長すると羽毛状から柔毛状であり、マージ
ンをやや形成し、平らから波状で、マージンは無色から
淡いグレーで直ちに暗いグレー様オリーブ、グレーから
暗いオリーブグレー、Smoke Gray, Light Grayish Oliv
e, DeepOlive-Gray, Dark Olive-Gray, Iron Gray, Cas
tor Gray を呈する（大文字の色名はRidgway, R. 1912.
Color Standards and Nomenclature, Washington, D.
C.によるものである）。裏面はマージンまで黄色様グレ
ーであり、直ちにオリーブ様グレー、成長するに従い、
暗いオリーブブラックスポットやパッチを寒天に形成
し、しばしば加齢部に無色から淡いグレーの気菌糸のパ
ッチや房を形成し、odor状で、pseudotheciaはない。菌
の表面は３週間を過ぎると、通常直状（straight）から
曲状（curved）、円柱形（cylindrical)、指状（finger
-like)の子座（stromata）を形成し、０．５−１mmの尾
を有し、加齢部からコロニー表面へ投射している。子座
（stromata）形成は富栄養培地でよく形成され、このよ
うな培地は例えば、ポテト−デキストロース寒天、オー
トミール寒天、グルコース−酵母−麦芽エキス寒天であ
る。
【００２１】分生子柄は気菌糸から形成され、３０−２
００×３−５μｍで隔壁を有し、直状（straight）ある
いは曲状（flexuous）であり、成長すると時に枝分れす
る。そして頂端は直状（straight）、曲状（curved）あ
るいは膝状に屈曲（geniculate）しており、滑面で、薄
いかやや厚い壁を有し、３％KOH 中でオリーブブラウン
からオリーブグレーを呈し、２−１０の分生子を有す
る。分生子由来の細胞はpolytretic, intergrated, ind
eterminate, sympodial であり、通常は分生子柄の端に
存在し、時に成長すると間にも存在し、分生子由来の面
側にある微孔を包むようにやや暗色のscarがある。分生
子は１８−２８×９−１４μｍであり、通常３つの隔壁
を有し、幅広の楕円状（elliptical）で、２節からな
り、末端細胞は曲状ではっきりと膨張し、やや平らなsc
arを基底部に有し、hilar appendix（突起）はなく、滑
面で、淡いオリーブブラウンからオリーブグレーを呈
し、通常は２つの中心細胞はやや暗色である。菌糸は３
％KOH 中で淡いオリーブグレーから暗いオリーブグレー
あるいはオリーブブラウンを呈し、隔壁を有し、枝分れ
がある。子座器官はtextura intricata で、細胞は３％
KOH で無色である。
００×３−５μｍで隔壁を有し、直状（straight）ある
いは曲状（flexuous）であり、成長すると時に枝分れす
る。そして頂端は直状（straight）、曲状（curved）あ
るいは膝状に屈曲（geniculate）しており、滑面で、薄
いかやや厚い壁を有し、３％KOH 中でオリーブブラウン
からオリーブグレーを呈し、２−１０の分生子を有す
る。分生子由来の細胞はpolytretic, intergrated, ind
eterminate, sympodial であり、通常は分生子柄の端に
存在し、時に成長すると間にも存在し、分生子由来の面
側にある微孔を包むようにやや暗色のscarがある。分生
子は１８−２８×９−１４μｍであり、通常３つの隔壁
を有し、幅広の楕円状（elliptical）で、２節からな
り、末端細胞は曲状ではっきりと膨張し、やや平らなsc
arを基底部に有し、hilar appendix（突起）はなく、滑
面で、淡いオリーブブラウンからオリーブグレーを呈
し、通常は２つの中心細胞はやや暗色である。菌糸は３
％KOH 中で淡いオリーブグレーから暗いオリーブグレー
あるいはオリーブブラウンを呈し、隔壁を有し、枝分れ
がある。子座器官はtextura intricata で、細胞は３％
KOH で無色である。
【００２２】構造式（Ｉ）の化合物はカビを同化できる
炭素、窒素を含有した水性栄養培地中で培養することに
より得ることができる。培養は好ましくは好気条件が良
い。栄養培地は鉱物塩や消泡剤も含有する。
炭素、窒素を含有した水性栄養培地中で培養することに
より得ることができる。培養は好ましくは好気条件が良
い。栄養培地は鉱物塩や消泡剤も含有する。
【００２３】栄養培地中の炭素源として好ましいのはグ
ルコース、グリセリン、澱粉、デキストリン等の炭水化
物である。他の炭素源はマルトース、マンノース、シュ
ークロース等である。更にオートフラワー、コーンミー
ル、粟、コーン等の混合栄養源も利用可能な炭素源とし
て使用される。培地中で使用される炭素源の正確な量は
ある程度他の培地成分に依存するが、通常重量％で０．
５から５％の間である。このような炭素源は単独である
いは数種の炭素源を同じ培地中で組合せて使用すること
ができる。
ルコース、グリセリン、澱粉、デキストリン等の炭水化
物である。他の炭素源はマルトース、マンノース、シュ
ークロース等である。更にオートフラワー、コーンミー
ル、粟、コーン等の混合栄養源も利用可能な炭素源とし
て使用される。培地中で使用される炭素源の正確な量は
ある程度他の培地成分に依存するが、通常重量％で０．
５から５％の間である。このような炭素源は単独である
いは数種の炭素源を同じ培地中で組合せて使用すること
ができる。
【００２４】好ましい窒素源はグリシン、メチオニン、
プロリン、トレオニン等のアミノ酸である。酵母エキス
（加水分解物、壊死物）、乾燥酵母、トマトペースト、
大豆粉、ペプトン、コーンスティープリカー、ディステ
ィラーズソルブル、麦芽エキス等の混合栄養源も良い。
アンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等）の無機窒素源も使用さ
れる。様々な窒素源が単独あるいは混合物として培地に
対する重量％で０．２から９０％の間で使用される。
プロリン、トレオニン等のアミノ酸である。酵母エキス
（加水分解物、壊死物）、乾燥酵母、トマトペースト、
大豆粉、ペプトン、コーンスティープリカー、ディステ
ィラーズソルブル、麦芽エキス等の混合栄養源も良い。
アンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等）の無機窒素源も使用さ
れる。様々な窒素源が単独あるいは混合物として培地に
対する重量％で０．２から９０％の間で使用される。
【００２５】炭素および窒素源は通常組合わせて使用さ
れるが、純物質である必要はない。やや不純物質である
ほうが微量の成長因子、ビタミン、鉱物を含有してい
る。炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムあるいはカリウ
ム、塩化ナトリウムあるいはカリウム、マグネシウム
塩、銅塩、コバルト塩（これだけに限定されないが）等
の鉱物塩も栄養培地に添加される。マンガン、鉄、モリ
ブデン、亜鉛等の微量金属も含まれる。更に必要ならポ
リエチレングリコールあるいはシリコーンのような消泡
剤も添加してよい。特に培養液がひどく泡立つ場合は使
用する。
れるが、純物質である必要はない。やや不純物質である
ほうが微量の成長因子、ビタミン、鉱物を含有してい
る。炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムあるいはカリウ
ム、塩化ナトリウムあるいはカリウム、マグネシウム
塩、銅塩、コバルト塩（これだけに限定されないが）等
の鉱物塩も栄養培地に添加される。マンガン、鉄、モリ
ブデン、亜鉛等の微量金属も含まれる。更に必要ならポ
リエチレングリコールあるいはシリコーンのような消泡
剤も添加してよい。特に培養液がひどく泡立つ場合は使
用する。
【００２６】本発明の化合物の好ましい生産方法は生産
菌の胞子あるいは菌体を適切な培地に植菌し、好気条件
下で培養することである。
菌の胞子あるいは菌体を適切な培地に植菌し、好気条件
下で培養することである。
【００２７】醗酵工程は通常、最初に保存菌体物を栄養
種母培地に植菌し、時に２段階のステップを通じて活性
化合物の生産における種母として生長菌体物を得る。植
菌後、フラスコを２０から３０℃の温度で、好ましくは
２５から２８℃の間で撹拌しながら振盪培養する。撹拌
速度は４００rpm まで、好ましくは２００から２２０rp
m の間であるのがよい。植菌したフラスコ２から１０日
間、好ましくは２から４日間振盪培養する。生長が十分
である時、これは通常２から４日であるが、培養物を生
産培地の入ったフラスコに添加する。第２ステージの種
母を、特に大きめの容器で培養する時は使用する。この
後、培養生長物を２番目のフラスコに添加し、同様の条
件下で、短めの時間振盪培養する。
種母培地に植菌し、時に２段階のステップを通じて活性
化合物の生産における種母として生長菌体物を得る。植
菌後、フラスコを２０から３０℃の温度で、好ましくは
２５から２８℃の間で撹拌しながら振盪培養する。撹拌
速度は４００rpm まで、好ましくは２００から２２０rp
m の間であるのがよい。植菌したフラスコ２から１０日
間、好ましくは２から４日間振盪培養する。生長が十分
である時、これは通常２から４日であるが、培養物を生
産培地の入ったフラスコに添加する。第２ステージの種
母を、特に大きめの容器で培養する時は使用する。この
後、培養生長物を２番目のフラスコに添加し、同様の条
件下で、短めの時間振盪培養する。
【００２８】植菌後、醗酵生産培地を３から５０日間、
好ましくは１４から３０日間撹拌するかあるいはしない
で（液体か固体培養かによって変化する）振盪培養す
る。醗酵は好気条件下２０から４０℃の温度で行う。撹
拌を行う時は２００から４００rpm で行う。最適な結果
を得るためには、温度を２２から２８℃で、最も好まし
くは２４から２６℃で行う。活性化合物生産に適した栄
養培地のpHは３．５から８．５であり、最も好ましくは
４．５から７．０である。所望の化合物の産生に対し適
当な期間の培養後、醗酵フラスコを集め活性物質を単離
する。
好ましくは１４から３０日間撹拌するかあるいはしない
で（液体か固体培養かによって変化する）振盪培養す
る。醗酵は好気条件下２０から４０℃の温度で行う。撹
拌を行う時は２００から４００rpm で行う。最適な結果
を得るためには、温度を２２から２８℃で、最も好まし
くは２４から２６℃で行う。活性化合物生産に適した栄
養培地のpHは３．５から８．５であり、最も好ましくは
４．５から７．０である。所望の化合物の産生に対し適
当な期間の培養後、醗酵フラスコを集め活性物質を単離
する。
【００２９】液体菌体醗酵のpHは１から９の間に調整し
（好ましくは３から５）、好ましくはメタノールのよう
な水と混合する溶媒と混ぜ、菌体を濾過する。活性化合
物をその後、水性濾過物より以下の様な数種の方法で単
離する。 １．水性濾過物をメチルエチルケトン、酢酸エチル、ジ
エチルエーテル、ジクロロメタンのような水と混合しな
い溶媒を用い、好ましくはpHを３から５に調整した後に
液体−液体分配抽出を行う。 ２．水性濾過物をSp２０７やＨＰ−２０のような有機マ
トリックスに添加し、９０／１０メタノール／水あるい
は９０／１０アセトン／水のような有機溶媒（水性ある
いは非水性）で溶出するような液体−固体抽出法。 ３．水性濾過物から活性化合物をイオン交換樹脂に吸着
させる。イオン交換樹脂はダウエックス１（Cl- ）を用
い、９０／１０メタノール／３０％NH4C1 のような強イ
オン性の有機／水性溶媒で溶出する。この溶出物は上述
の方法１あるいは２によって脱塩できる。 これらの３つの方法は活性化合物の更なる精製に使用さ
れる。
（好ましくは３から５）、好ましくはメタノールのよう
な水と混合する溶媒と混ぜ、菌体を濾過する。活性化合
物をその後、水性濾過物より以下の様な数種の方法で単
離する。 １．水性濾過物をメチルエチルケトン、酢酸エチル、ジ
エチルエーテル、ジクロロメタンのような水と混合しな
い溶媒を用い、好ましくはpHを３から５に調整した後に
液体−液体分配抽出を行う。 ２．水性濾過物をSp２０７やＨＰ−２０のような有機マ
トリックスに添加し、９０／１０メタノール／水あるい
は９０／１０アセトン／水のような有機溶媒（水性ある
いは非水性）で溶出するような液体−固体抽出法。 ３．水性濾過物から活性化合物をイオン交換樹脂に吸着
させる。イオン交換樹脂はダウエックス１（Cl- ）を用
い、９０／１０メタノール／３０％NH4C1 のような強イ
オン性の有機／水性溶媒で溶出する。この溶出物は上述
の方法１あるいは２によって脱塩できる。 これらの３つの方法は活性化合物の更なる精製に使用さ
れる。
【００３０】上述の方法によって得られた活性化合物を
含有する画分を減圧濃縮し、粗製活性化合物を得る。そ
の後、粗製活性化合物を通常は、吸着や分配クロマトグ
ラフィーおよび沈澱等の数種の単離工程に供される。各
々の単離工程で各画分は集められ、生物検定やＨＰＬＣ
分析の結果に従って併せる。
含有する画分を減圧濃縮し、粗製活性化合物を得る。そ
の後、粗製活性化合物を通常は、吸着や分配クロマトグ
ラフィーおよび沈澱等の数種の単離工程に供される。各
々の単離工程で各画分は集められ、生物検定やＨＰＬＣ
分析の結果に従って併せる。
【００３１】クロマトグラフィーによる分離はイオン性
あるいは非イオン性吸着剤による因習的なカラムクロマ
トグラフィーによって遂行される。シリカゲルを吸着剤
として用いる時は、メタノール／クロロホルム／酢酸／
水のようなアルコール／塩素化炭水化物／有機酸混合溶
媒を展開溶媒として使用する。逆相クロマトグラフィー
には好ましい吸着剤はC8かC18 が結合したシリカゲルで
ある。逆相クロマトグラフィーの好ましい展開溶媒はア
セトニトリルと０．１％リン酸あるいはトリフルオロ酢
酸のような低pHの水性緩衝液の混合溶媒である。活性化
合物は非極性溶媒からキニン塩として沈殿する。沈殿の
好ましい溶媒はジエチルエーテルである。
あるいは非イオン性吸着剤による因習的なカラムクロマ
トグラフィーによって遂行される。シリカゲルを吸着剤
として用いる時は、メタノール／クロロホルム／酢酸／
水のようなアルコール／塩素化炭水化物／有機酸混合溶
媒を展開溶媒として使用する。逆相クロマトグラフィー
には好ましい吸着剤はC8かC18 が結合したシリカゲルで
ある。逆相クロマトグラフィーの好ましい展開溶媒はア
セトニトリルと０．１％リン酸あるいはトリフルオロ酢
酸のような低pHの水性緩衝液の混合溶媒である。活性化
合物は非極性溶媒からキニン塩として沈殿する。沈殿の
好ましい溶媒はジエチルエーテルである。
【００３２】本発明において微生物の醗酵培養物中で形
成される化合物の内在性スクアレン合成酵素の阻害活性
は以下に記載する標準的なin vitro系によって評価でき
る：
成される化合物の内在性スクアレン合成酵素の阻害活性
は以下に記載する標準的なin vitro系によって評価でき
る：
【００３３】ラット肝ミクロソームの調製 雄のチャールズリバー（Charles River)ＣＤラット（１
２０から１５０ｇ）を０．１％のロバスタチンを含有す
る餌で４日間飼育した。これらのラットから肝を採り、
氷で冷却した５０mMＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、５mM
ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）pH７．５との
５当量（mL／ｇ）でPotter-Elvehjem 型組織粉砕機を用
いてホモゲナイズした。ホモジネートを４℃にて２回、
２０，０００ｘｇで１５分間遠心し各々沈殿物を除去し
た。上澄を４℃、１００，０００ｘｇにて１時間遠心し
た。得られたミクロソーム沈澱物を上記のホモゲナイズ
用緩衝液に再び懸濁し、もとのホモジネートと同様に
１：５に希釈した。このミクロソームは約７mg／mLの濃
度のタンパク質を含む。ミクロソーム懸濁液を少量ずつ
−７０℃で保存した。この中のスクアレン合成酵素活性
は少なくとも数ケ月は安定である。
２０から１５０ｇ）を０．１％のロバスタチンを含有す
る餌で４日間飼育した。これらのラットから肝を採り、
氷で冷却した５０mMＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、５mM
ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）pH７．５との
５当量（mL／ｇ）でPotter-Elvehjem 型組織粉砕機を用
いてホモゲナイズした。ホモジネートを４℃にて２回、
２０，０００ｘｇで１５分間遠心し各々沈殿物を除去し
た。上澄を４℃、１００，０００ｘｇにて１時間遠心し
た。得られたミクロソーム沈澱物を上記のホモゲナイズ
用緩衝液に再び懸濁し、もとのホモジネートと同様に
１：５に希釈した。このミクロソームは約７mg／mLの濃
度のタンパク質を含む。ミクロソーム懸濁液を少量ずつ
−７０℃で保存した。この中のスクアレン合成酵素活性
は少なくとも数ケ月は安定である。
【００３４】プレニルトランスフェラーゼの部分精製 プレニルトランスフェラーゼは酵素的に同位体ラベルし
たファルネシルピロリン酸の調製に使用した。プレニル
トランスフェラーゼはRilling の方法（Methods in Enz
ymology １１０, １２５−１２９（１９８５））により
検定でき、活性単位は３０℃における標準検定で１分間
当たり１μmoleのファルネシルピロリン酸を合成する酵
素量で示される。５％コレスチルアミンおよび０．１％
ロバスタチンで飼育した２３匹の４０日齢の雄ラットの
肝臓を１０mMメルカプトエタノール、２mMＥＤＴＡ、２
５mMロイペプチン、０．００５％フェニルメチルスルホ
ニルフルオリドpH７．０およびaprotinin ／mL量の０．
１トリプシン阻害剤の１リッター溶液の入ったWaring b
lender中でホモゲナイズした。ホモジネート２０，００
０xgにて２０分間遠心した。上澄を６Ｎ HOAc を用いて
pH５．５に調整し、１００，０００xgにて１時間遠心し
た。この上澄を３Ｎ KOH用いてpH７．０に調整し、３５
−６０％硫酸アンモニウムの画分を集めた。６０％にお
ける沈殿物を６０mLの１０mMリン酸カリウム、１０mMメ
ルカプトエタノール、１mMＥＤＴＡpH７．０（緩衝液
Ａ）に溶解し、１リッターの緩衝液Ａで２回透析した。
この透析画分を緩衝液Ａで平衡された１２．５ｘ５cmの
ＤＥＡＥ-sepharose４Ｂカラムに付した。カラムを７０
０mLの緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａから１００mMリン酸
カリウム、１０mMメルカプトエタノール、１mMＥＤＴＡ
pH７．０まで１リッターの濃度勾配溶出を行った。０．
２０ユニット／mg以上の特異的活性を有する画分を合
せ、固体硫酸アンモニウムを６０％飽和になるまで添加
し、沈殿させた。この沈殿物を８mLの１０mM Tris 、１
０mMβ−メルカプトエタノールpH７．０（緩衝液Ｂ）に
溶解した。再溶解した沈澱物をＢ緩衝液に溶解した１．
５倍量の飽和硫酸アンモニウムを添加し６０％飽和にし
た。この硫酸アンモニウム懸濁液は０．２３ユニット／
mgの特異的活性を示す３．５ユニット／mLを有し、これ
はイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ活性を有して
いなかった。この硫酸アンモニウム懸濁液を〔４−
14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸合成に使用し、この活性
は４℃で少なくとも６ケ月は保存安定であった。
たファルネシルピロリン酸の調製に使用した。プレニル
トランスフェラーゼはRilling の方法（Methods in Enz
ymology １１０, １２５−１２９（１９８５））により
検定でき、活性単位は３０℃における標準検定で１分間
当たり１μmoleのファルネシルピロリン酸を合成する酵
素量で示される。５％コレスチルアミンおよび０．１％
ロバスタチンで飼育した２３匹の４０日齢の雄ラットの
肝臓を１０mMメルカプトエタノール、２mMＥＤＴＡ、２
５mMロイペプチン、０．００５％フェニルメチルスルホ
ニルフルオリドpH７．０およびaprotinin ／mL量の０．
１トリプシン阻害剤の１リッター溶液の入ったWaring b
lender中でホモゲナイズした。ホモジネート２０，００
０xgにて２０分間遠心した。上澄を６Ｎ HOAc を用いて
pH５．５に調整し、１００，０００xgにて１時間遠心し
た。この上澄を３Ｎ KOH用いてpH７．０に調整し、３５
−６０％硫酸アンモニウムの画分を集めた。６０％にお
ける沈殿物を６０mLの１０mMリン酸カリウム、１０mMメ
ルカプトエタノール、１mMＥＤＴＡpH７．０（緩衝液
Ａ）に溶解し、１リッターの緩衝液Ａで２回透析した。
この透析画分を緩衝液Ａで平衡された１２．５ｘ５cmの
ＤＥＡＥ-sepharose４Ｂカラムに付した。カラムを７０
０mLの緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａから１００mMリン酸
カリウム、１０mMメルカプトエタノール、１mMＥＤＴＡ
pH７．０まで１リッターの濃度勾配溶出を行った。０．
２０ユニット／mg以上の特異的活性を有する画分を合
せ、固体硫酸アンモニウムを６０％飽和になるまで添加
し、沈殿させた。この沈殿物を８mLの１０mM Tris 、１
０mMβ−メルカプトエタノールpH７．０（緩衝液Ｂ）に
溶解した。再溶解した沈澱物をＢ緩衝液に溶解した１．
５倍量の飽和硫酸アンモニウムを添加し６０％飽和にし
た。この硫酸アンモニウム懸濁液は０．２３ユニット／
mgの特異的活性を示す３．５ユニット／mLを有し、これ
はイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ活性を有して
いなかった。この硫酸アンモニウム懸濁液を〔４−
14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸合成に使用し、この活性
は４℃で少なくとも６ケ月は保存安定であった。
【００３５】〔４−14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸の酵
素的合成 〔４−14Ｃ〕イソペンテニルピロリン酸（４７．９mCi/
mmole)５５mCi からロータリーエヴァポレートにより溶
媒（エタノール：０．１５Ｎ NH4OH、１：１）を除去し
た。６００μｌの１００mM Tris 、１０mM MgCl2、４mM
ジチオスレイトールpH７．５を添加し、溶液を１．５mL
のエッペンドルフ遠心管に移した。２０mMの２５０ml溶
液のゲラニルピロリン酸および５０mlのプレニルトラン
スフェラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液を反応を開始さ
せるために添加した。このインキュベート物は９００ml
中、５mmole のゲラニルピロリン酸、１．１５mmole の
イソペンテニルピロリン酸、6 mmole のMgCl2 、０．１
８ユニットのプレニルトランスフェラーゼを含してい
た。インキュベーションは３７℃にて行った。インキュ
ベーション中混合物はファルネシルピロリン酸のマグネ
シウム錯体を新たに形成し、白濁した。〔４−14Ｃ〕フ
ァルネシルピロリン酸をエッペンドルフ遠心管を用いて
３分間、１４，０００rpm で遠心し、集めた。上澄を除
去し、沈殿物を１．０mLの５０mMＨＥＰＥＳ、５mMＥＤ
ＴＡ、pH７．５に溶解した。収率は〔４−14Ｃ〕ファル
ネシルピロリン酸５０．７mCi （９２％）であった。
〔４−14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸は−７０℃にて少
量ずつ保存した。
素的合成 〔４−14Ｃ〕イソペンテニルピロリン酸（４７．９mCi/
mmole)５５mCi からロータリーエヴァポレートにより溶
媒（エタノール：０．１５Ｎ NH4OH、１：１）を除去し
た。６００μｌの１００mM Tris 、１０mM MgCl2、４mM
ジチオスレイトールpH７．５を添加し、溶液を１．５mL
のエッペンドルフ遠心管に移した。２０mMの２５０ml溶
液のゲラニルピロリン酸および５０mlのプレニルトラン
スフェラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液を反応を開始さ
せるために添加した。このインキュベート物は９００ml
中、５mmole のゲラニルピロリン酸、１．１５mmole の
イソペンテニルピロリン酸、6 mmole のMgCl2 、０．１
８ユニットのプレニルトランスフェラーゼを含してい
た。インキュベーションは３７℃にて行った。インキュ
ベーション中混合物はファルネシルピロリン酸のマグネ
シウム錯体を新たに形成し、白濁した。〔４−14Ｃ〕フ
ァルネシルピロリン酸をエッペンドルフ遠心管を用いて
３分間、１４，０００rpm で遠心し、集めた。上澄を除
去し、沈殿物を１．０mLの５０mMＨＥＰＥＳ、５mMＥＤ
ＴＡ、pH７．５に溶解した。収率は〔４−14Ｃ〕ファル
ネシルピロリン酸５０．７mCi （９２％）であった。
〔４−14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸は−７０℃にて少
量ずつ保存した。
【００３６】スクアレン合成検定 反応は１６×１２５mmネジ付き試験管中で行った。１回
の検定混合物は以下の溶液から調製した： mL １回の検定 ５０回の検定の量 １．２５０mM HEPES pH 7.5 ２０ １０００ ２．NaF 110 mM １０ ５００ ３．MgCl2 55 mM １０ ５００ ４．ジチオスレイトール 30 mM １０ ５００ ５．NADPH 10 mM （直前調製） １０ ５００ ６．〔４−14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸 47.9 mCi/mmole および0.025 mCi/3.0 mL 3.０ １５０ ７．H2O ２４ １２００ 検定混合物を真空ポンプで脱ガスし、窒素で置換した。
スクアレン合成酵素阻害剤の溶液をDMSOあるいはMeOHで
調製し、１：１２０希釈のミクロソーム性タンパク質を
元のホモゲナイズ用緩衝液で調製した。各々の反応に、
８７mLの検定混合物と３mLの阻害剤溶液（コントロール
はDMSOあるいはMeOH）を併せ、湯浴中で３０℃にて暖
め、その後反応を開始させるために１０mLの１：１２０
希釈のミクロソームタンパク質（検定中０．６mg全タン
パク質）を添加した。反応は２０分後、１００mLの４０
％KOH と９５％EtOH１：１混合溶液を添加することによ
り停止させた。停止させた混合物を６５℃にて３０分間
加熱した。これを冷却し、１０mLのヘプタンを添加し、
混合液をかき混ぜた。２ｇの活性アルミナを添加し、混
合液を再びかき混ぜた。アルミナをそのままにして５mL
のヘプタン層を除去した。１０mLのシンチレーション溶
液をヘプタン溶液に添加し、放射活性を液体シンチレー
ションで計数した。
の検定混合物は以下の溶液から調製した： mL １回の検定 ５０回の検定の量 １．２５０mM HEPES pH 7.5 ２０ １０００ ２．NaF 110 mM １０ ５００ ３．MgCl2 55 mM １０ ５００ ４．ジチオスレイトール 30 mM １０ ５００ ５．NADPH 10 mM （直前調製） １０ ５００ ６．〔４−14Ｃ〕ファルネシルピロリン酸 47.9 mCi/mmole および0.025 mCi/3.0 mL 3.０ １５０ ７．H2O ２４ １２００ 検定混合物を真空ポンプで脱ガスし、窒素で置換した。
スクアレン合成酵素阻害剤の溶液をDMSOあるいはMeOHで
調製し、１：１２０希釈のミクロソーム性タンパク質を
元のホモゲナイズ用緩衝液で調製した。各々の反応に、
８７mLの検定混合物と３mLの阻害剤溶液（コントロール
はDMSOあるいはMeOH）を併せ、湯浴中で３０℃にて暖
め、その後反応を開始させるために１０mLの１：１２０
希釈のミクロソームタンパク質（検定中０．６mg全タン
パク質）を添加した。反応は２０分後、１００mLの４０
％KOH と９５％EtOH１：１混合溶液を添加することによ
り停止させた。停止させた混合物を６５℃にて３０分間
加熱した。これを冷却し、１０mLのヘプタンを添加し、
混合液をかき混ぜた。２ｇの活性アルミナを添加し、混
合液を再びかき混ぜた。アルミナをそのままにして５mL
のヘプタン層を除去した。１０mLのシンチレーション溶
液をヘプタン溶液に添加し、放射活性を液体シンチレー
ションで計数した。
【００３７】阻害％は以下の式で計算する： １−（試料−ブランク）／（コントロール−ブランク）
×１００ 以下の実施例で使用した培地の組成は以下の様に示して
おく。ＹＭＥ プレーティング培地 組成物 量 酵母エキス ４．０ｇ 麦芽エキス １０．０ｇ グルコース ４．０ｇ 蒸留水 １０００mL 寒天 ２５．０ｇＫＦ種母培地 微量元素混合物 １リッター当たり ｇ／リッター コーンスティープリカー ５ｇ FeSO4 ・7H2O 1.０ トマトペースト ４０ｇ MnSO4 ・4H2O 1.０ オート粉 １０ｇ CuCl2 ・2H2O 0.０２５ グルコース １０ｇ CaCl2 ・2H2O 0.１ 微量元素混合物 １０mL H3BO3 0.０５６ pH6.８に調整（殺菌前） (NH4)6MO7O24 ・4H2O 0.０１９ ５０mL／ノンバッフル250mL 容三角スラスコ ZnSO4. 7H2O 0.２ ２０分間オートクレーブ（121 ℃、15psi ） １リッターの0.６Ｎ HClに溶解生産培地 ＢＲＦ ブラウンライス 5.０ｇ／ノンバッフル２５０mL容 三角フラスコ 基本液＃２ ２0.０mL／フラスコ 基本液＃２ ｇ／リッター 酵母エキス 1.０ 酒石酸ナトリウム 0.５ KH2PO4 0.５ 蒸留水 １００0.０mL （pHは無調整） オートクレーブ１５分間（１２１℃、１５psi ） １5.０ mL の蒸留水添加／フラスコ オートクレーブ２０分間（１２１℃、１５psi ） Ｆ１培地 破砕とうもろこし １0.０ｇ／ノンバッフル２５０mL容 三角フラスコ 基本液＃３ １0.０mL／フラスコ基本液＃３ ｇ／リッター Ardamine PH 0.２ KH2PO4 0.１ MgSO4 ・7H2O 0.１ 酒石酸ナトリウム 0.１ FeSO4 ・ H2O 0.０１ ZnSO4 ・7H2O 0.０１ 蒸留水 １００0.０mL （pHは無調整) オートクレーブ１５分間（１２１℃、１５psi) １5.０mLの蒸留水を添加 オートクレーブ２０分間（１２１℃、１５psi) ＬＳＦ１培地 ｇ／リッター グリセロール ７５．０ グルコース １０．０ Ardamine PH ５．０ 大豆ミール ５．０ トマトペースト ５．０ クエン酸ナトリウム ２．０ (NH4)2SO4 ２．０ 殺菌前にpH７．０に調整 ４５mLのノンバッフル２５０mL三角フラスコ オートクレーブ２０分間（１２１℃、１５psi)
×１００ 以下の実施例で使用した培地の組成は以下の様に示して
おく。ＹＭＥ プレーティング培地 組成物 量 酵母エキス ４．０ｇ 麦芽エキス １０．０ｇ グルコース ４．０ｇ 蒸留水 １０００mL 寒天 ２５．０ｇＫＦ種母培地 微量元素混合物 １リッター当たり ｇ／リッター コーンスティープリカー ５ｇ FeSO4 ・7H2O 1.０ トマトペースト ４０ｇ MnSO4 ・4H2O 1.０ オート粉 １０ｇ CuCl2 ・2H2O 0.０２５ グルコース １０ｇ CaCl2 ・2H2O 0.１ 微量元素混合物 １０mL H3BO3 0.０５６ pH6.８に調整（殺菌前） (NH4)6MO7O24 ・4H2O 0.０１９ ５０mL／ノンバッフル250mL 容三角スラスコ ZnSO4. 7H2O 0.２ ２０分間オートクレーブ（121 ℃、15psi ） １リッターの0.６Ｎ HClに溶解生産培地 ＢＲＦ ブラウンライス 5.０ｇ／ノンバッフル２５０mL容 三角フラスコ 基本液＃２ ２0.０mL／フラスコ 基本液＃２ ｇ／リッター 酵母エキス 1.０ 酒石酸ナトリウム 0.５ KH2PO4 0.５ 蒸留水 １００0.０mL （pHは無調整） オートクレーブ１５分間（１２１℃、１５psi ） １5.０ mL の蒸留水添加／フラスコ オートクレーブ２０分間（１２１℃、１５psi ） Ｆ１培地 破砕とうもろこし １0.０ｇ／ノンバッフル２５０mL容 三角フラスコ 基本液＃３ １0.０mL／フラスコ基本液＃３ ｇ／リッター Ardamine PH 0.２ KH2PO4 0.１ MgSO4 ・7H2O 0.１ 酒石酸ナトリウム 0.１ FeSO4 ・ H2O 0.０１ ZnSO4 ・7H2O 0.０１ 蒸留水 １００0.０mL （pHは無調整) オートクレーブ１５分間（１２１℃、１５psi) １5.０mLの蒸留水を添加 オートクレーブ２０分間（１２１℃、１５psi) ＬＳＦ１培地 ｇ／リッター グリセロール ７５．０ グルコース １０．０ Ardamine PH ５．０ 大豆ミール ５．０ トマトペースト ５．０ クエン酸ナトリウム ２．０ (NH4)2SO4 ２．０ 殺菌前にpH７．０に調整 ４５mLのノンバッフル２５０mL三角フラスコ オートクレーブ２０分間（１２１℃、１５psi)
【００３８】以下の実施例は式（Ｉ）の化合物の調製を
例示しているが、これだけに限定されるものではない。
例示しているが、これだけに限定されるものではない。
【００３９】実施例１ Ａ．ＭＦ５５７３の培養 菌株ＭＦ５５７３をＫＦ種母培地にガラスの引っ掻き棒
を用いて胞子と菌糸の混合物を植菌した。菌は殺菌した
培地に保存した。ＫＦ種母フラスコを６６時間、２５
℃、２２０rpm 、湿度８５％で振盪培養した。培養終了
時に２．０mL部分を無菌的に２５Ｆ１固体生産培地フラ
スコに移植した。これらの生産用フラスコを２５℃、２
６日間培養した。培養終了時４５mLの７０％メタノール
を固体培地に各々添加し、手で小片に破砕した。菌体を
更に破砕し、溶媒が細胞と接触するようにフラスコをジ
ャイロトリーシェーカーに乗せ、２２０rpm にて３０分
間撹拌した。撹拌後、各々のフラスコ中の内容物を全て
( 固体および全て) を注ぎながら２リッターのビーカー
に集めた。 Ｂ．化合物Ｉの単離 ２５個のフラスコから集めた固体醗酵物の７０％メタノ
ール抽出液に1 リッターのメタノールを添加した。この
溶液を激しく撹拌した。撹拌後、混合液を濾過し、１９
００mLの濾過物を得た。残った菌体を再度２リッターの
メタノールで抽出、撹拌し、濾過し、１８５０mLの濾液
を得た。濾液７５０mLを合せ、混合液を１５００mLの水
で希釈した。この３リッターを３００mLのDowex 1(C
1- ) カラムに３０mL／min の割合で吸着させた。５０
０mLのCH3CN/H2O(６０：４０）で洗浄し、１リッターの
CH3CN ／０．０５Ｍクエン酸緩衝液pH５．５で溶出させ
た。更に１リッターのCH3CN ／０．０５Ｍクエン酸緩衝
液pH４．０、１リッターのCH3CN ／０．０５Ｍクエン酸
緩衝液pH３．０で溶出させた。１リッターのCH3CN ／
０．０５Ｍクエン酸緩衝液pH３．０溶出画分を６００mL
まで濃縮し、水で１５００mLに希釈し、pHを４．０に調
整した。この調製物を１００mLのＨＰ−２０に１０mL／
min の割合で吸着させ、水およびメタノール／H2O(５
０：５０）で洗浄し、１００％メタノールで溶出させ
た。１００％メタノール溶出物を濃縮乾固し、１mLのCH
3CN ／水性H3PO4 pH２．５（６０：４０）に溶解し、こ
の調製したものの１００μ1 を０．９×２５cm Phenome
nex(３０％炭素付加）Ｃ18カラムに供し、移動層として
CH3CN ／水性H3PO4pH２．５（６０：４０）を用いた。
スクアレン合成検定において活性が確認された画分は化
合物（Ｉ）を得たことを示している。
を用いて胞子と菌糸の混合物を植菌した。菌は殺菌した
培地に保存した。ＫＦ種母フラスコを６６時間、２５
℃、２２０rpm 、湿度８５％で振盪培養した。培養終了
時に２．０mL部分を無菌的に２５Ｆ１固体生産培地フラ
スコに移植した。これらの生産用フラスコを２５℃、２
６日間培養した。培養終了時４５mLの７０％メタノール
を固体培地に各々添加し、手で小片に破砕した。菌体を
更に破砕し、溶媒が細胞と接触するようにフラスコをジ
ャイロトリーシェーカーに乗せ、２２０rpm にて３０分
間撹拌した。撹拌後、各々のフラスコ中の内容物を全て
( 固体および全て) を注ぎながら２リッターのビーカー
に集めた。 Ｂ．化合物Ｉの単離 ２５個のフラスコから集めた固体醗酵物の７０％メタノ
ール抽出液に1 リッターのメタノールを添加した。この
溶液を激しく撹拌した。撹拌後、混合液を濾過し、１９
００mLの濾過物を得た。残った菌体を再度２リッターの
メタノールで抽出、撹拌し、濾過し、１８５０mLの濾液
を得た。濾液７５０mLを合せ、混合液を１５００mLの水
で希釈した。この３リッターを３００mLのDowex 1(C
1- ) カラムに３０mL／min の割合で吸着させた。５０
０mLのCH3CN/H2O(６０：４０）で洗浄し、１リッターの
CH3CN ／０．０５Ｍクエン酸緩衝液pH５．５で溶出させ
た。更に１リッターのCH3CN ／０．０５Ｍクエン酸緩衝
液pH４．０、１リッターのCH3CN ／０．０５Ｍクエン酸
緩衝液pH３．０で溶出させた。１リッターのCH3CN ／
０．０５Ｍクエン酸緩衝液pH３．０溶出画分を６００mL
まで濃縮し、水で１５００mLに希釈し、pHを４．０に調
整した。この調製物を１００mLのＨＰ−２０に１０mL／
min の割合で吸着させ、水およびメタノール／H2O(５
０：５０）で洗浄し、１００％メタノールで溶出させ
た。１００％メタノール溶出物を濃縮乾固し、１mLのCH
3CN ／水性H3PO4 pH２．５（６０：４０）に溶解し、こ
の調製したものの１００μ1 を０．９×２５cm Phenome
nex(３０％炭素付加）Ｃ18カラムに供し、移動層として
CH3CN ／水性H3PO4pH２．５（６０：４０）を用いた。
スクアレン合成検定において活性が確認された画分は化
合物（Ｉ）を得たことを示している。
【００４０】実施例２ Ａ．ＭＦ５５７２の培養 菌株ＭＦ５５７２をＫＦ種母培地にガラスの引っ掻き棒
を用いて胞子と菌糸の混合物を植菌した。菌は殺菌した
培地に保存した。ＫＦ種母フラスコを４９時間、２５
℃、２２０rpm 、湿度８５％で振盪培養した。培養終了
時に２．０mL部分を無菌的に１９ＢＲＦ固体生産培地お
よび１５ＬＳＦ１液体生産培地に移植した。これらの生
産用フラスコを２５℃、湿度８５％、静止培養（ＢＲＦ
フラスコ)およびジャイロトリーシェーカー上にて２２
０rpm で４１日間培養した。培養終了時５０mLのメチル
エチルケトンをＢＲＦ生産フラスコに添加し、手で固体
を小片に破砕した。ＬＳＦ１フラスコを１００％メタノ
ール４５mlで抽出した。溶媒添加後、ＢＲＦフラスコの
菌体を更に破砕し、溶媒が細胞と接触するようにフラス
コをジャイロトリーシェーカーに乗せ、２２０rpm にて
３０分間撹拌した。撹拌後、各々のフラスコ中の内容物
の全て( 固体および全て) を注ぎながら１リッターのビ
ーカー２個に集めた。 Ｂ．化合物Ｉの単離 ５０mLのメチルエチルケトンを添加した１３のフラスコ
を併せ、濾過し、冷却下保存した。保存しておくと、こ
の混合液の液量は気化により２７５mLまで減少した。こ
の抽出物の１００mLをpH３．０に調整し、１００mLの酢
酸エチルで抽出した。１００mLの酢酸エチル抽出物の５
mLを濃縮乾固し、０．５mLのCH3CN ／水性H3PO4pH ２．
５（６０：４０）に溶解した。この調製物を濾過し、不
溶物を取り除き、２５０μ1 の濾液を、移動層としてCH
3CN ／水性H3PO4pH ２．５（６０：４０）を用い０．９
×２５cm Phenomenex(３０％炭素化）Ｃ18カラムに供し
た。スクアレン合成検定において活性が確認された画分
は化合物（Ｉ）を得たことを示した。
を用いて胞子と菌糸の混合物を植菌した。菌は殺菌した
培地に保存した。ＫＦ種母フラスコを４９時間、２５
℃、２２０rpm 、湿度８５％で振盪培養した。培養終了
時に２．０mL部分を無菌的に１９ＢＲＦ固体生産培地お
よび１５ＬＳＦ１液体生産培地に移植した。これらの生
産用フラスコを２５℃、湿度８５％、静止培養（ＢＲＦ
フラスコ)およびジャイロトリーシェーカー上にて２２
０rpm で４１日間培養した。培養終了時５０mLのメチル
エチルケトンをＢＲＦ生産フラスコに添加し、手で固体
を小片に破砕した。ＬＳＦ１フラスコを１００％メタノ
ール４５mlで抽出した。溶媒添加後、ＢＲＦフラスコの
菌体を更に破砕し、溶媒が細胞と接触するようにフラス
コをジャイロトリーシェーカーに乗せ、２２０rpm にて
３０分間撹拌した。撹拌後、各々のフラスコ中の内容物
の全て( 固体および全て) を注ぎながら１リッターのビ
ーカー２個に集めた。 Ｂ．化合物Ｉの単離 ５０mLのメチルエチルケトンを添加した１３のフラスコ
を併せ、濾過し、冷却下保存した。保存しておくと、こ
の混合液の液量は気化により２７５mLまで減少した。こ
の抽出物の１００mLをpH３．０に調整し、１００mLの酢
酸エチルで抽出した。１００mLの酢酸エチル抽出物の５
mLを濃縮乾固し、０．５mLのCH3CN ／水性H3PO4pH ２．
５（６０：４０）に溶解した。この調製物を濾過し、不
溶物を取り除き、２５０μ1 の濾液を、移動層としてCH
3CN ／水性H3PO4pH ２．５（６０：４０）を用い０．９
×２５cm Phenomenex(３０％炭素化）Ｃ18カラムに供し
た。スクアレン合成検定において活性が確認された画分
は化合物（Ｉ）を得たことを示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 マリア ティー．ディエス−マタス スペイン，28010 マドリッド，シー／オ リド，４, (72)発明者 メアリ ナリン オムステッド アメリカ合衆国，07090 ニュージャーシ ィ，ウエストフィールド，ウエストフィー ルド アヴェニュー 634 (72)発明者 フェルナンド ペラエス スペイン，28038 マドリッド，シー／カ ミノ デ ヴァルデッリバス，10
Claims (8)
- 【請求項１】 スクアレンシンセターゼ活性を阻害し、
回収可能な量の： 【化１】 を産生する発酵ブロスを産生することができるクルブラ
リア ルナータの生物学的に純粋な培養物。 - 【請求項２】 スクアレンシンセターゼ活性を阻害し、
回収可能な量の： 【化２】 を産生する発酵ブロスを産生することができるクルブラ
リア ルナータの培養物。 - 【請求項３】 （ａ）クルブラリア ルナータｖａｒ．
ルナータ、ＭＦ５５７３（ＡＴＣＣ７４０６７）、
（ｂ）クルブラリア ルナータｖａｒ．ルナータの活性
変異体、ＭＦ５５７３（ＡＴＣＣ７４０６７）、（ｃ）
クルブラリア ルナータｖａｒ．アエリア、ＭＦ５５７
２（ＡＴＣＣ７４０６６）、（ｄ）クルブラリア ルナ
ータｖａｒ．アエリアの活性変異体、ＭＦ５５７２（Ａ
ＴＣＣ７４０６６）からなる群から選択される請求項１
記載の生物学的に純粋な培養物。 - 【請求項４】 （ａ）クルブラリア ルナータｖａｒ．
ルナータ、ＭＦ５５７３（ＡＴＣＣ７４０６７）、
（ｂ）クルブラリア ルナータｖａｒ．ルナータの活性
変異体、ＭＦ５５７３（ＡＴＣＣ７４０６７）、（ｃ）
クルブラリア ルナータｖａｒ．アエリア、ＭＦ５５７
２（ＡＴＣＣ７４０６６）、（ｄ）クルブラリア ルナ
ータｖａｒ．アエリアの活性変異体、ＭＦ５５７２（Ａ
ＴＣＣ７４０６６）からなる群から選択される請求項２
記載の培養物。 - 【請求項５】 以下の化合物の製造に適した条件下でク
ルブラリア ルナータを培養し、この化合物を回収する
ことからなる構造式： 【化３】 の化合物の製造方法。 - 【請求項６】 培養を２５−４２日間で行うことを特徴
とする請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 クルブラリア ルナータ株が（ａ）ＭＦ
５５７３（ＡＴＣＣ７４０６７）、（ｂ）ＭＦ５５７３
の活性変異体（ＡＴＣＣ７４０６７）、（ｃ）ＭＦ５５
７２（ＡＴＣＣ７４０６６）、（ｄ）ＭＦ５５７２の活
性変異体（ＡＴＣＣ７４０６６）からなる群から選択さ
れる請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 培養を２５−４２日間で行うことを特徴
とする請求項７記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/715,535 US5200342A (en) | 1991-06-14 | 1991-06-14 | Squalene synthetase inhibitors and processes therefrom |
| US715535 | 1991-06-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05222050A true JPH05222050A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=24874442
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4197405A Pending JPH05222050A (ja) | 1991-06-14 | 1992-06-15 | 新規スクアレンシンセターゼ阻害剤及びそれからの製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5200342A (ja) |
| EP (1) | EP0522715A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05222050A (ja) |
| CA (1) | CA2071143A1 (ja) |
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| WO1993017557A1 (en) * | 1992-03-09 | 1993-09-16 | Merck & Co., Inc. | Cholesterol lowering compounds produced by directed biosynthesis |
| US5430055A (en) * | 1994-04-08 | 1995-07-04 | Pfizer Inc. | Inhibitor of squalene synthase |
| US20020058299A1 (en) * | 2000-11-16 | 2002-05-16 | Billups Richard A. | Mycologic genera specific selective agar and method of manufacture |
| CN110079626B (zh) * | 2019-03-28 | 2021-06-01 | 河南科技大学 | 用于新月弯孢菌遗传多样性和亲缘关系分析的ssr引物及应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5053425A (en) * | 1990-03-21 | 1991-10-01 | Merck & Co., Inc. | Novel anti-fungal compounds |
| IL97535A0 (en) * | 1990-03-21 | 1992-06-21 | Merck & Co Inc | Squalene synthetase inhibitor dioxabicyclo(1,2,3)octanes,their production and pharmaceutical compositions containing them |
| US5026554A (en) * | 1990-09-13 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of inhibiting fungal growth using squalene synthetase inhibitors |
-
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- 1991-06-14 US US07/715,535 patent/US5200342A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-06-12 EP EP19920305393 patent/EP0522715A1/en not_active Withdrawn
- 1992-06-12 CA CA002071143A patent/CA2071143A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-15 JP JP4197405A patent/JPH05222050A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2071143A1 (en) | 1992-12-15 |
| EP0522715A1 (en) | 1993-01-13 |
| US5200342A (en) | 1993-04-06 |
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