JPH05215753A - エプスタイン−バー−ウイルス感染の検出方法 - Google Patents
エプスタイン−バー−ウイルス感染の検出方法Info
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- JPH05215753A JPH05215753A JP28595592A JP28595592A JPH05215753A JP H05215753 A JPH05215753 A JP H05215753A JP 28595592 A JP28595592 A JP 28595592A JP 28595592 A JP28595592 A JP 28595592A JP H05215753 A JPH05215753 A JP H05215753A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 エプスタイン−バーウイルスによる感染およ
びその急性と一過性感染とを識別する検出方法を提供す
る。 【構成】 生物学的液体中のエプスタイン−バーウイル
スのエンベロープ抗原およびコア抗原の存在の有無を螢
光測定により検出する方法であって、抗補体免疫螢光技
術、および抗原としてのＰ３ＨＲ−１細胞の使用を含ん
でなる。
びその急性と一過性感染とを識別する検出方法を提供す
る。 【構成】 生物学的液体中のエプスタイン−バーウイル
スのエンベロープ抗原およびコア抗原の存在の有無を螢
光測定により検出する方法であって、抗補体免疫螢光技
術、および抗原としてのＰ３ＨＲ−１細胞の使用を含ん
でなる。
Description
【０００１】エプスタイン−バー（Epstein-Barr）ウイ
ルス（ＥＢＶ）による感染は、診断的有意性を有し、種
々のＥＢＶ抗原および血清学的試験によって検出され得
る種々の抗体の出現によって特徴付けられる。ＥＢＶ診
断において、急性および一過性ＥＢＶ感染の間を区別し
得ることが特に必要である。
ルス（ＥＢＶ）による感染は、診断的有意性を有し、種
々のＥＢＶ抗原および血清学的試験によって検出され得
る種々の抗体の出現によって特徴付けられる。ＥＢＶ診
断において、急性および一過性ＥＢＶ感染の間を区別し
得ることが特に必要である。
【０００２】ＥＢＶは、感染性単核細胞症（ＩＭ）の病
因物であり、世界中に分布し、成人の８０−９０％に感
染している。発展途上国において、一次感染は生まれて
最初の１０年間で起こる。開発国においては、一次感染
は、通常若い成人に起こる。子供の感染は、普通無症候
性であるが、希に古典的ＩＭを伴うことがある。これと
は対照的に、一次ＥＢＶ感染を有する若い成人の５０−
７０％は、軽いものから重篤な病状を示す。
因物であり、世界中に分布し、成人の８０−９０％に感
染している。発展途上国において、一次感染は生まれて
最初の１０年間で起こる。開発国においては、一次感染
は、通常若い成人に起こる。子供の感染は、普通無症候
性であるが、希に古典的ＩＭを伴うことがある。これと
は対照的に、一次ＥＢＶ感染を有する若い成人の５０−
７０％は、軽いものから重篤な病状を示す。
【０００３】ＥＢＶは、バーキットリンパ腫（主とし
て、アフリカおよびニューギニアにおける子供の腫瘍で
ある）および中国南方の個体に慢性感染をもって高い発
症率を有する鼻咽頭の鼻咽頭癌（未分化の鱗状細胞癌）
の病因に関連するものと長い間考えられていた。今日、
急性および一過性ＥＢＶ感染を検出するために種々の血
清学的方法が組合わされ、また、ＩｇＧクラスおよびＩ
ｇＭクラスの抗体間を区別することもしばしば必要であ
った。しかしながら、種々の試験法を使用しても、結論
的な結果を導くことは必ずしも出来なかった。更に、試
験場において種々の血清学的試験を実施することは、極
めて複雑であり、かつ費用が嵩む。
て、アフリカおよびニューギニアにおける子供の腫瘍で
ある）および中国南方の個体に慢性感染をもって高い発
症率を有する鼻咽頭の鼻咽頭癌（未分化の鱗状細胞癌）
の病因に関連するものと長い間考えられていた。今日、
急性および一過性ＥＢＶ感染を検出するために種々の血
清学的方法が組合わされ、また、ＩｇＧクラスおよびＩ
ｇＭクラスの抗体間を区別することもしばしば必要であ
った。しかしながら、種々の試験法を使用しても、結論
的な結果を導くことは必ずしも出来なかった。更に、試
験場において種々の血清学的試験を実施することは、極
めて複雑であり、かつ費用が嵩む。
【０００４】急性または一過性のＥＢＶ感染の存在また
は不在を検出し得る極めて簡単な方法が、本発明の範囲
内において見出された。急性感染は、ＥＢＶのエンベロ
ープ抗原に対する抗体の存在により特徴付けられ、その
一方、一過性感染は、ＥＢＶコア抗原に対する抗体の存
在によって特徴付けられる。本発明による方法は、ＥＢ
Ｖのエンベロープ抗原に対する抗体およびコア抗原に対
する抗体を、単一の試験方法により同定することを初め
て可能とした。
は不在を検出し得る極めて簡単な方法が、本発明の範囲
内において見出された。急性感染は、ＥＢＶのエンベロ
ープ抗原に対する抗体の存在により特徴付けられ、その
一方、一過性感染は、ＥＢＶコア抗原に対する抗体の存
在によって特徴付けられる。本発明による方法は、ＥＢ
Ｖのエンベロープ抗原に対する抗体およびコア抗原に対
する抗体を、単一の試験方法により同定することを初め
て可能とした。
【０００５】従って、本発明は、螢光測定法および螢光
顕微鏡的評価による、生物学的液体中のエプスタイン−
バーウイルスのエンベロープ抗原に対する抗体およびコ
ア抗原に対する抗体の存在または不在を同定する方法に
関し、該方法は、抗補体免疫螢光技術の使用および抗原
としてのＰ３ＨＲ−１の使用を含む。
顕微鏡的評価による、生物学的液体中のエプスタイン−
バーウイルスのエンベロープ抗原に対する抗体およびコ
ア抗原に対する抗体の存在または不在を同定する方法に
関し、該方法は、抗補体免疫螢光技術の使用および抗原
としてのＰ３ＨＲ−１の使用を含む。
【０００６】抗補体免疫螢光技術は、当業者が周知の技
術であり、更には、Edwin H.-Lennette による“Serolo
gische Diagnose der Infektionskrankheiten ”（感染
性疾患の血清学的診断）の第３３頁、第パラグラフ（Vi
rion Edition、Cham、１９８９）に記述されている。Ｐ
３ＨＲ−１細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）に番号ＡＴＣＣ ＨＴＢ ６
２のもとに寄託されており、ここから随時入手可能であ
る。
術であり、更には、Edwin H.-Lennette による“Serolo
gische Diagnose der Infektionskrankheiten ”（感染
性疾患の血清学的診断）の第３３頁、第パラグラフ（Vi
rion Edition、Cham、１９８９）に記述されている。Ｐ
３ＨＲ−１細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）に番号ＡＴＣＣ ＨＴＢ ６
２のもとに寄託されており、ここから随時入手可能であ
る。
【０００７】螢光顕微鏡的評価において対比染色、特に
エバンスブルー（Evan's Blue ）を使用することは好都
合である。
エバンスブルー（Evan's Blue ）を使用することは好都
合である。
【０００８】本発明による方法は、生物学的液体、特に
血清または血漿試料について実施される。
血清または血漿試料について実施される。
【０００９】該方法は、生物学的液体をスライド上に固
定化されたＰ３ＨＲ−１細胞とインキュベートし、非結
合抗体を洗浄により除去し、ならびに、抗原−抗体複合
体と補体とのインキュベーションおよび引続く抗補体
の、および螢光化合物の接合体とのインキュベーショ
ン、非結合接合体の洗浄除去、および螢光顕微鏡による
評価によって結合抗体を検出することを含んでなる。
定化されたＰ３ＨＲ−１細胞とインキュベートし、非結
合抗体を洗浄により除去し、ならびに、抗原−抗体複合
体と補体とのインキュベーションおよび引続く抗補体
の、および螢光化合物の接合体とのインキュベーショ
ン、非結合接合体の洗浄除去、および螢光顕微鏡による
評価によって結合抗体を検出することを含んでなる。
【００１０】いずれの哺乳動物補体をも補体として使用
できるが、モルモット補体が好ましい。
できるが、モルモット補体が好ましい。
【００１１】螢光化合物により標識される抗補体は、同
様に任意の哺乳動物種から得ることができるが、当然の
ことながら補体を得た哺乳動物種と異なるものから得
る。これに関して特に好適には、モルモット補体に対す
るヤギ抗体である。モルモットＣ３補体に対するヤギ抗
体が特に好ましい。多くの異なる化合物が螢光化合物と
して適当であるが、フルオレセインイソチオシアネート
が特に好ましい。
様に任意の哺乳動物種から得ることができるが、当然の
ことながら補体を得た哺乳動物種と異なるものから得
る。これに関して特に好適には、モルモット補体に対す
るヤギ抗体である。モルモットＣ３補体に対するヤギ抗
体が特に好ましい。多くの異なる化合物が螢光化合物と
して適当であるが、フルオレセインイソチオシアネート
が特に好ましい。
【００１２】例 a.必要な試薬類 1)インビトロ培養Ｐ３ＨＲ−１細胞： アセトン／メタ
ノール固定細胞を有するそれぞれ６個のウエルをもった
２枚のスライドを入れた真空封止ガラスチューブ。 2)対照血清 (a) エンベロープおよびコア抗原が負； (b) エンベロープ抗原が正、コア抗原が負； (c) エンベロープおよびコア抗原が正。 3)補体： 凍結乾燥モルモット血清 4)接合体： フルオレセインイソチオシアネートにより
標識されたモルモット補体Ｃ３に対する凍結乾燥ヤギ抗
体。 5)pH７．３±０．１のリン酸緩衝食塩水。 6)エバンスブルー： 保存溶液（１：１０００重量／体
積）を使用した。
ノール固定細胞を有するそれぞれ６個のウエルをもった
２枚のスライドを入れた真空封止ガラスチューブ。 2)対照血清 (a) エンベロープおよびコア抗原が負； (b) エンベロープ抗原が正、コア抗原が負； (c) エンベロープおよびコア抗原が正。 3)補体： 凍結乾燥モルモット血清 4)接合体： フルオレセインイソチオシアネートにより
標識されたモルモット補体Ｃ３に対する凍結乾燥ヤギ抗
体。 5)pH７．３±０．１のリン酸緩衝食塩水。 6)エバンスブルー： 保存溶液（１：１０００重量／体
積）を使用した。
【００１３】b.試験方法 1) 患者の血清または対照血清をＰＢＳ中に１：１０
（０．０１＋０．０９ml）に希釈し、密封し、５６゜に
て３０分間で不活性化した。２０マイクロリットルの希
釈血清をスライドのウエルにピペットでとり、負および
正の対照を含めた。 2) スライドを気密した湿潤チェンバー内で３７゜にて
３０分間インキュベートした。 3) 血清希釈物をウエルから吸引除去し、次いで該スラ
イドをＰＢＳにて注意深く洗浄した。該スライドをディ
ッシュ中に置き、ＰＢＳにより５分間、充分に２回洗浄
した。過剰の緩衝溶液を、完全な乾燥を防止しつつ注意
深く除去した。 4) ＰＢＳ中の２０マイクロリットルのモルモット補体
１：１０を、すべてのウエルにただちに加えた（スライ
ドの数に応じて０．０１＋０．０９、０．０２＋０．１
８等）。 5) ステップ２と同様に３７゜にて３０分間インキュベ
ーションを行なった。 6) インキュベーションの間に、スライドの数に応じて
必要な接合体溶液の量を調製した。これは、次のスキー
ムに基づいて行なわれる：
（０．０１＋０．０９ml）に希釈し、密封し、５６゜に
て３０分間で不活性化した。２０マイクロリットルの希
釈血清をスライドのウエルにピペットでとり、負および
正の対照を含めた。 2) スライドを気密した湿潤チェンバー内で３７゜にて
３０分間インキュベートした。 3) 血清希釈物をウエルから吸引除去し、次いで該スラ
イドをＰＢＳにて注意深く洗浄した。該スライドをディ
ッシュ中に置き、ＰＢＳにより５分間、充分に２回洗浄
した。過剰の緩衝溶液を、完全な乾燥を防止しつつ注意
深く除去した。 4) ＰＢＳ中の２０マイクロリットルのモルモット補体
１：１０を、すべてのウエルにただちに加えた（スライ
ドの数に応じて０．０１＋０．０９、０．０２＋０．１
８等）。 5) ステップ２と同様に３７゜にて３０分間インキュベ
ーションを行なった。 6) インキュベーションの間に、スライドの数に応じて
必要な接合体溶液の量を調製した。これは、次のスキー
ムに基づいて行なわれる：
【００１４】 スライド ＰＢＳ 接合体* エバンスブルー 最終体積 の数 (ml) (ml) 保存溶液(ml) (ml) １ ０．１０５ ０．０３ ０．０１５ ０．１５ ２ ０．２１ ０．０６ ０．０３ ０．３０ ４ ０．４２ ０．１２ ０．０６ ０．６０ ６ ０．６３ ０．１８ ０．０９ ０．９０ 等。* 接合体の作用溶液の場合は１：５である。
【００１５】7) ステップ4)と同様に洗浄を行なった。 8) ２０マイクロリットルの接合体希釈物を、各ウエル
にただちに加えた。 9) ステップ３）と同様に３７゜にて３０分間インキュ
ベーションを行なった。 10) ステップ4)と同様にスライドを処理した。 11) スライドを螢光顕微鏡を用いて評価した。７５Ｗキ
セノンランプ、４９０nm励起フィルタおよび５２０nm遮
断フィルタを備えた標準的螢光顕微鏡を使用した；組入
れカバーガラスを有した水（または塩）投入式レンズを
使用すると有利である。
にただちに加えた。 9) ステップ３）と同様に３７゜にて３０分間インキュ
ベーションを行なった。 10) ステップ4)と同様にスライドを処理した。 11) スライドを螢光顕微鏡を用いて評価した。７５Ｗキ
セノンランプ、４９０nm励起フィルタおよび５２０nm遮
断フィルタを備えた標準的螢光顕微鏡を使用した；組入
れカバーガラスを有した水（または塩）投入式レンズを
使用すると有利である。
【００１６】c. 結果の解釈は、(1) エンベロープ抗原
の染色された細胞質および／または膜細胞（細胞の５−
１０％）または(2) 染色されたコア抗原細胞（細胞の９
０％以上）の存在、および(3) 負の場合における螢光の
不在に基づく。
の染色された細胞質および／または膜細胞（細胞の５−
１０％）または(2) 染色されたコア抗原細胞（細胞の９
０％以上）の存在、および(3) 負の場合における螢光の
不在に基づく。
【００１７】正の試験 (1) 急性感染 ＥＢＶのエンベロープ抗原に対する抗体は、約５−１０
％の螢光性細胞質および／または膜細胞を生成する（図
１参照）。(2) 一過性感染 ＥＢＶのコア抗原に対する抗体は、細胞の９０％以上の
染色を生じる（図２参照）。染色は、明らかに識別可能
な明るい螢光として、急性の場合および一過性の場合の
両者における感染の証拠である。
％の螢光性細胞質および／または膜細胞を生成する（図
１参照）。(2) 一過性感染 ＥＢＶのコア抗原に対する抗体は、細胞の９０％以上の
染色を生じる（図２参照）。染色は、明らかに識別可能
な明るい螢光として、急性の場合および一過性の場合の
両者における感染の証拠である。
【００１８】(3) 負の試験 螢光は観察されず、すべての細胞はエバンスブルー対比
染色の存在のために赤色に見える。
染色の存在のために赤色に見える。
【図１】図１は本発明による急性感染の検出に係る螢光
顕微鏡写真である。
顕微鏡写真である。
【図２】図２は本発明による一過性感染の検出に係る螢
光顕微鏡写真である。
光顕微鏡写真である。
Claims (9)
- 【請求項１】 生物学的液体中のエプスタイン−バーウ
イルスの、抗補体免疫螢光技術および引続く螢光顕微鏡
的評価による検出方法であって、単独の抗原としてエプ
スタイン−バーウイルスのエンベロープ抗原に対する抗
体およびコア抗原に対する抗体の両者を同定し得るＰ３
ＨＲ−１細胞を使用することを含んでなる方法。 - 【請求項２】 螢光顕微鏡的評価において対比染色を使
用する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 対比染色としてエバンスブルーを使用す
る請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 生物学的液体をスライド上に固定化した
Ｐ３ＨＲ−１細胞と共にインキュベートし、非結合抗体
を洗浄により除去し、ならびに結合抗体を、該抗原−抗
体複合体と補体とのインキュベーションおよび抗補体の
接合体と螢光化合物の接合体の引続くインキュベーショ
ン、非結合接合体の洗浄除去および螢光顕微鏡による評
価によって検出する請求項１−３のいずれか一つに記載
の方法。 - 【請求項５】 生物学的液として、血清または血漿を使
用する請求項１−４のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項６】 補体としてモルモット補体を使用する請
求項３に記載の方法。 - 【請求項７】 接合体として螢光化合物により標識され
た、モルモット補体に対する抗体類、特にヤギ抗体類を
使用する請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 モルモットＣ３補体に対するヤギ抗体を
使用する請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 螢光化合物としてフルオレセインイソチ
オシアネートを使用する請求項８に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH312891 | 1991-10-25 | ||
| CH03128/91-0 | 1991-10-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05215753A true JPH05215753A (ja) | 1993-08-24 |
Family
ID=4249221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28595592A Pending JPH05215753A (ja) | 1991-10-25 | 1992-10-23 | エプスタイン−バー−ウイルス感染の検出方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0538703B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05215753A (ja) |
| CA (1) | CA2081131A1 (ja) |
| DE (1) | DE59202707D1 (ja) |
| ES (1) | ES2075993T3 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4438833A1 (de) * | 1994-10-31 | 1996-05-02 | Bayer Ag | Verfahren zur analytischen Trennung von Viren |
| EP0834742A1 (de) * | 1996-10-01 | 1998-04-08 | Gull Laboratories GmbH | Spezifischer Anti-EBNA-1-Test mittels antikomplementärer Immunfluoreszenz |
| DE69836132T2 (de) | 1997-04-08 | 2007-03-29 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc., Neenah | Wegwerfbekleidung und ihre herstellung |
| CN102207500A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-10-05 | 中国兽医药品监察所 | 补体结合酶联免疫吸附试验 |
-
1992
- 1992-10-12 ES ES92117392T patent/ES2075993T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-12 DE DE59202707T patent/DE59202707D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-12 EP EP19920117392 patent/EP0538703B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-22 CA CA 2081131 patent/CA2081131A1/en not_active Abandoned
- 1992-10-23 JP JP28595592A patent/JPH05215753A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS=1981 * |
| PROC NATL ACAD SCI USA=1978 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0538703A1 (de) | 1993-04-28 |
| EP0538703B1 (de) | 1995-06-28 |
| DE59202707D1 (de) | 1995-08-03 |
| ES2075993T3 (es) | 1995-10-16 |
| CA2081131A1 (en) | 1993-04-26 |
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