CN118209733A - 一种快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents
一种快速检测cpv的荧光免疫层析试纸条及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条及其制备方法与应用，属于生物检测技术领域。为解决现有的检测CPV的方法存在的技术问题，本发明基于聚集诱导发光材料(AIE)的特性，结合CPV的VP2蛋白的特异性抗体制备出一种快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条，该试纸条能够检出培养物中病毒的最低限位为102.15TCID50/0.1mL，且与临床症状相似的其他犬源病毒，如：CPIV、CAV、CDV和RABV不发生反应，具有较好的特异性和灵敏性，并具有稳定性好、检测时间短等优点，为CPV的现场或者实验室的检测提供了一种快速检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)。CPV基因组由单股DNA组成，DNA量约占整个病毒粒子重量的25％～34％，DNA的分子质量为1.4×106～1.7×106，沉淀系数为23S～27S。我国已建立的用于检测CPV抗体的血清学方法有血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验、胶体金免疫层析试纸条等。酶联免疫吸附实验(ELISA)既可检测抗原又可检测抗体，该方法有高效、快速、灵敏的特点。但该方法无法分辨是野毒感染还是疫苗免疫。随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术为CPV的检测提供了一种灵敏可靠的检测技术，PCR检测敏感性高，特异性强，可分辨野毒感染和疫苗免疫。近年来，随着胶体金免疫层析方法的进一步发展，利用胶体金标记CPV单克隆抗体，制成检测CPV抗原的胶体金检测试纸已应用于兽医临床中。但胶体金免疫层析法存在灵敏度不高等缺陷。
综上所述，以上方法有些对操作环境和精密设备的需求较高，限制了其应用范围，有的方法虽方便快捷，但存在灵敏度不高，有假阳性的问题。因此，亟需建立一套快速简便、准确的检测方法，为CPV现地快检、病原的监测预警提供新型的检测技术与物质基础。
发明内容
为解决现有的检测CPV的方法存在的技术问题，本发明基于聚集诱导发光材料(AIE)的特性，结合CPV的VP2蛋白的特异性抗体制备出一种灵敏度高、特异性强、操作简单快速的检测CPV的荧光免疫层析试纸条。
为解决上述技术问题，并实现相应的技术效果，本发明提出了如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种用于快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜、吸水垫、结合垫和样品垫依次搭接在PVC底板上；所述的层析膜上设有检测线T和质控线C，其中，质控线C包被有羊抗鼠IgG，检测线T包被有抗CPV的单克隆抗体；所述的检测线T设置于靠近结合垫的一端，所述的质控线C设置于靠近吸水垫的一端；所述结合垫包被有荧光微球标记的抗CPV的单克隆抗体；所述荧光微球为由硬脂微球包裹具有AIE特性的化学发光材料(BF-TPA2)制备获得的纳米颗粒，BF-TPA2为一种聚集诱导发光材料，该类材料在聚集状态下表现出优异的发光性能，且具有良好的水溶性、稳定性、不容易猝灭性。
在本发明的一种实施方式中，所述样品垫为玻璃纤维素膜，所述结合垫为聚酯纤维素膜，所述层析膜为硝酸纤维素膜，所述吸水纸为棉绒材质。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述用于快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供上述用于快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)结合垫的制备：
①将结合垫置于结合垫封闭液中进行浸泡处理，然后烘干备用；
②将由硬脂微球包裹的BF-TPA2材料所制成的荧光微球经振荡后进行离心，取沉淀，利用双蒸水重悬，离心取沉淀，加入MES缓冲液重悬，再依次添加N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化荧光微球表面的羧基，经超声摇床条件下反应后、离心取沉淀，再用HEPES缓冲液重悬，超声，边振荡边加入抗CPV的单克隆抗体，经孵育后加入10％BSA封闭，经离心取沉淀，利用重悬液重悬，超声获得抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球溶液；
③将②中制备的抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球稀释后均匀喷洒在结合垫上，经烘干制成结合垫备用；
(2)样品垫的制备：将样品垫浸泡于样品垫封闭液中，经烘干备用；
(3)硝酸纤维膜的制备：
将抗CPV的单克隆抗体稀释后，加入包被液和蔗糖溶液混合后，喷于硝酸纤维膜的检测线T处，将羊抗鼠IgG抗体与检测线间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，作为质控线C，硝酸纤维膜经干燥备用；
(4)试纸条的组装：
在PVC底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫进行连接，得到试纸条，检测线T设置于靠近结合垫的一端，质控线C设置于靠近吸水垫的一端。
在本发明的一种实施方式中，所述结合垫封闭液为含有5％海藻糖、2％BSA、0.5％Tween-20、0.5％Triton X-100的硼酸溶液。
在本发明的一种实施方式中，由硬脂微球包裹的BF-TPA2材料所制成的荧光微球的具体制备方法如下：将PS微球液分散于溶胀介质THF中，再将BF-TPA2溶于溶胀溶剂中，二者混合在一起之后进行溶胀反应；在溶胀反应期间，间隔1-2h进行1-10min的超声处理；溶胀反应结束后，在适当温度下通过蒸发去除溶胀剂，在蒸发掉溶胀剂后对微球液先进行1-15min的超声处理，再进行稀释去除溶胀介质后获得荧光微球沉淀物。
在本发明的一种实施方式中，步骤②的具体方法为100μL由硬脂微球包裹的BF-TPA2材料所制成的荧光微球加入1.5mL离心管中，振荡混匀；4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，用100μL的双蒸水重悬微球沉淀，再次在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃去上清，用1mL 20mM，pH＝5.6的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液重悬荧光微球，以清除荧光微球中的杂质，再依次加入25μL 10mg/mL的N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化荧光微球羧基后，120W超声5min后放入37℃、200rpm摇床摇晃反应1h，以活化荧光微球表面的羧基；4℃、12000rpm条件下离心10min以清除上清中未反应的EDC和NHS；加入1mL 20mM，pH＝8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液重悬微球沉淀，120W超声5min；然后将荧光微球边振荡边加入2.49mg/mL的抗CPV的单克隆抗体，在37℃摇床里孵育2h；再加入10μL 10％BSA封闭荧光微球表面活化的羧基，37℃摇床封闭1h，然后4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，用重悬液重悬，120W超声5min，使荧光微球均匀分散在溶液里，4℃保存备用。
在本发明的一种实施方式中，每1mL抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球溶液中含160μg抗CPV单克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述样品垫封闭液为含有0.5％Tween-20、2％PEG20000、2％BSA的硼酸溶液。
在本发明的一种实施方式中，硝酸纤维膜的制备方法具体如下：
将抗CPV的单克隆抗体稀释至1mg/mL，加入0.05M的包被液和1％的蔗糖溶液混合后，喷于硝酸纤维膜的检测线T处，将1mg/mL羊抗鼠IgG抗体与检测线间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，作为质控线C，硝酸纤维膜经干燥备用；
本发明的第四个目的是提供上述的用于快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条或上述的试剂盒在非疾病诊断目的的检测CPV中的应用。
在本发明的一种实施方式中，将样品稀释后滴加在试纸条加样孔中，室温静置20min，用紫外灯365nm照射试纸条观察结果，待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性；如果质控线不显色，则检测无效。
在本发明的一种实施方式中，当所述样品为粪便样品时，用无菌棉签沾取粪便，放入2mL离心管中，加入1mL PBS(pH7.4)，涡旋振荡，以12000rpm离心10min，收集上清；当所述样品为肛拭子样品时，收集肛试子，加入1mLPBS(pH7.4)，涡旋振荡，以12000rpm离心10min，收集上清。
在本发明的一种实施方式中，所述稀释为取10μL上述粪便样品或肛试子样品，加入90μL CPV稀释液进行稀释。
本发明的有益效果：
本发明提供的检测CPV的荧光免疫层析试纸条可用于CPV病原的特异性检测，该试纸条能够检出培养物中病毒的最低限位为102.15TCID50/0.1mL，且与临床症状相似的其他犬源病毒，如：CPIV、CAV、CDV和RABV不发生反应。本发明所制备的检测CPV的荧光免疫层析试纸条具有较好的特异性和灵敏性，并具有稳定性好、检测时间短等优点，为CPV的现场或者实验室的检测提供了一种快速检测方法。
附图说明
图1为抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球的透射电镜图及免疫电镜图；其中，图1中的A为抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球的透射电镜图，图1中的B为抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球的免疫电镜图；
图2为检测CPV的荧光免疫层析试纸条结构示意图及试纸条检测阳性样品与阴性样品对应的检测原理图；其中，图2中的A为检测CPV的荧光免疫层析试纸条结构示意图，图2中的B为试纸条检测阳性样品对应的检测原理图，图2中的C为试纸条检测阴性样品对应的检测原理图；
图3为检测CPV的荧光免疫层析试纸条的结果判定示意图；
图4为检测CPV的荧光免疫层析试纸条的灵敏度检测结果图；
图5为检测CPV的荧光免疫层析试纸条的特异性检测结果图；
图6为检测CPV的荧光免疫层析试纸条的重复性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
以下实施例中涉及的实验方法如无特别说明均为常规方法，所使用的材料、试剂、酶、细胞、质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用CPV病毒、抗CPVVP2蛋白的单克隆抗体、试纸条稀释液均购买于长春市西诺生物科技有限公司；所用聚苯乙烯硬脂微球购买于聚集诱导发光高等研究院。
实施例1：检测CPV的荧光免疫层析试纸条的制备方法
1、结合垫的制备
(1)荧光微球标记的抗CPV的单克隆抗体的制备
由硬脂微球包裹的BF-TPA2材料所制成的荧光微球的具体制备方法如下：将PS微球液分散于溶胀介质THF中，再将BF-TPA2溶于溶胀溶剂中，二者混合在一起之后进行溶胀反应；在溶胀反应期间，间隔1-2h进行1-10min的超声处理；溶胀反应结束后，在适当温度下通过蒸发去除溶胀剂，在蒸发掉溶胀剂后对微球液先进行1-15min的超声处理，再进行稀释去除溶胀介质后获得荧光微球沉淀物。
取两份100μL由硬脂微球包裹的BF-TPA2材料所制成的荧光微球，分别加入1.5mL离心管中，振荡混匀；4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，用100μL的双蒸水重悬微球沉淀，再次在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃去上清，用1mL 20mM，pH＝5.6的MES溶液重悬荧光微球，以清除荧光微球中的杂质，再依次加入25μL 10mg/mL的EDC和25μL 10mg/mLNHS，120W超声5min后放入37℃、200rpm摇床摇晃反应1h，以活化荧光微球表面的羧基；4℃、12000rpm条件下离心10min以清除上清中未反应的EDC和NHS；加入1mL 20mM，pH＝8.0的HEPES缓冲液重悬微球沉淀，120W超声5min；然后将荧光微球边振荡边加入2.49mg/mL的抗CPV的单克隆抗体，在37℃摇床里孵育2h；再加入10μL 10％BSA封闭荧光微球表面活化的羧基，37℃摇床封闭1h，然后4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，用重悬液重悬，120W超声5min，使荧光微球均匀分散在溶液里，4℃保存备用。通过透射电镜观察上述获得的微球形态，如图1中的A所示，荧光微球呈现球形。微球与抗CPV单抗偶联免疫电镜下的结果如图1中的B所示，由该图可知荧光微球周围有大量胶体金颗粒，表明荧光微球与单抗成功偶联。
(2)荧光微球结合垫的制备
在37℃～38℃条件下，将结合垫浸泡于结合垫封闭液(含有质量分数为5％海藻糖、2％BSA、0.5％Tween-20、0.5％Triton X-100的硼酸溶液)中2h，取出置于烘箱中烘干12h。将制备的荧光微球标记的抗CPV单克隆抗体1:4稀释后，用喷膜仪均匀喷洒在结合垫上，置于37℃烘箱中干燥2～3h，取出后储存在4℃，密封保存。
2、样品垫的预处理
在37℃～38℃条件下，将样品垫浸泡于样品垫封闭液(含有质量分数为0.5％Tween-20、2％PEG20000、2％BSA的硼酸溶液)中2h，取出置于烘箱中烘干12h，将试纸条放入含有干燥剂的密封袋内，密封干燥后备用。
3、检测线和质控线的制备
将抗CPV的单克隆抗体稀释至1mg/mL，加入0.05M的PBS缓冲液和1％的蔗糖溶液混合后，喷于检测线T处。将1mg/mL羊抗鼠IgG抗体与质控线间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，作为质控线C，线划好后置于37℃～38℃干燥2～3h。将试纸条放入含有干燥剂的密封袋内，密封后备用。
4、试纸条的组装
在PVC底板上依次将层析膜、吸水垫、结合垫和样品垫进行连接，得到试纸条，所述的检测线T设置于靠近结合垫的一端，所述的质控线C设置于靠近吸水垫的一端。按照试纸条卡壳的大小对试纸条进行切条，然后将切条后的试纸条装入试纸条卡壳中。其中试纸条的结构示意图如图2中的A所示，阳性样品与阴性样品对应的检测原理图分别见图2中的B和图2中的C。
实施例2：检测CPV的荧光免疫层析试纸条的使用方法及其敏感性、特异性及重复性评价
1、CPV荧光免疫层析检测试纸条检测CPV病毒
(1)样品稀释：用CPV稀释液分别将CPV(阳性样品)和不含有CPV的细胞培养液上清(阴性样品)稀释100倍，即向99μL稀释液中加入1μL样本，用移液器混匀。将试纸条平放于操作台面，加样孔朝上，向加样孔中加入100μL稀释后的样品，室温静置20min，用紫外灯365nm照射试纸条观察结果。
(2)结果判定：结果判定应在加样后20min内进行。待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性；如果质控线不显色，则检测无效，应更换试纸条重新检测，如图3所示。
2、CPV荧光免疫层析检测试纸条灵敏度、特异性和重复性检测
(1)CPV荧光免疫层析检测试纸条的灵敏度检测
将CPV TCID50/100μL为104.25的病毒五倍比稀释后，滴加到试纸条样品垫上，用细胞培养液上清作为阴性对照，用CPV稀释液作为空白对照，观察是否有T线出现，建立试纸条的灵敏度。检测结果显示：当CPV病毒稀释到TCID50/100μL为101.45时只有C线显现，没有T线出现，呈阴性；当CPV病毒稀释到TCID50/100μL为102.15时C线和T线同时显现，呈阳性(见图4)，可见，检测线能达到TCID50/100μL为102.15，说明制备的CPV荧光免疫层析检测试纸条具有较高的灵敏度。
(2)CPV荧光免疫层析检测试纸条的特异性检测
将CPV、CPIV(犬副流感病毒)、CAV(犬腺病毒)、CDV(犬瘟病毒)和RABV(狂犬病毒)分别用CPV稀释液稀释到100倍，滴加到试纸条的样品垫上，检测结果显示：只有滴加了CPV的试纸条T线和C线都出现，呈现阳性，其余的全部只有C线显现，呈阴性(见图5)，该检测结果说明制备的CPV荧光免疫层析检测试纸条具有特异性。
(3)CPV荧光免疫层析检测试纸条的重复性检测
将CPVTCID50/100μL为104.25的病毒五倍比稀释，每个稀释倍数做三个重复试纸条，结果显示，每个稀释倍数试纸条结果稳定，试纸条重复性良好(见图6)。
综上所述，本发明制备的试纸条与PCR方法具有较高的符合率，且本试纸条可对CPV感染犬的情况进行早期检测，具有灵敏、快速、特异性强等特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于快速检测CPV的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC底板、样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜、吸水垫、结合垫和样品垫依次搭接在PVC底板上；层析膜上设有检测线T和质控线C，其中，质控线C包被有羊抗鼠IgG，检测线T包被有抗CPV的单克隆抗体；检测线T设置于靠近结合垫的一端，质控线C设置于靠近吸水垫的一端；结合垫包被有荧光微球标记的抗CPV的单克隆抗体，荧光微球为由硬脂微球包裹BF-TPA2获得的纳米颗粒，BF-TPA2为一种聚集诱导发光材料。
2.一种含有权利要求1所述荧光免疫层析试纸条的试剂盒。
3.权利要求1所述荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)结合垫的制备：将结合垫置于结合垫封闭液中进行浸泡处理，然后烘干备用；将由硬脂微球包裹的BF-TPA2材料所制成的荧光微球经振荡离心取沉淀，双蒸水重悬离心取沉淀，加入MES缓冲液重悬，再依次添加EDC和NHS，经超声、振荡反应后离心取沉淀，HEPES缓冲液重悬，超声后加入抗CPV的单克隆抗体，孵育后加入10％BSA封闭，离心取沉淀，重悬液重悬、超声获得抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球溶液；抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球溶液稀释后均匀喷洒在结合垫上，经烘干制成结合垫备用；
(2)样品垫的制备：将样品垫浸泡于样品垫封闭液中，经烘干备用；
(3)硝酸纤维膜的制备：将抗CPV的单克隆抗体稀释后，加入包被液和蔗糖溶液混合后，喷于硝酸纤维膜的检测线T处，将羊抗鼠IgG抗体与检测线间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，作为质控线C，硝酸纤维膜经干燥备用；
(4)试纸条的组装：在PVC底板上依次将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫进行连接，得到试纸条，检测线T设置于靠近结合垫的一端，质控线C设置于靠近吸水垫的一端。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，结合垫封闭液为含有5％海藻糖、2％BSA、0.5％Tween-20、0.5％Triton X-100的硼酸溶液。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，每1mL抗CPV的单克隆抗体标记的荧光微球溶液中含160μg抗CPV单克隆抗体。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述样品垫封闭液为含有0.5％Tween-20、2％PEG20000、2％BSA的硼酸溶液。
7.权利要求1所述荧光免疫层析试纸条或权利要求2所述试剂盒在非疾病诊断目的的检测CPV中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将样品稀释后滴加在试纸条加样孔中，室温静置20min，用紫外灯365nm照射试纸条观察结果，待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性；如果质控线不显色，则检测无效。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，当样品为粪便样品或肛试子时，预处理方法为样品中加入1mLPBS，振荡后离心收集上清。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述稀释为取10μL预处理后的样品，加入90μL CPV稀释液进行稀释。
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