JPH05199878A - 山羊インシュリン様成長因子ｉ前駆体、該成長因子ｉおよび前駆体の各製造方法、並びにこれらに関与するｄｎａ、発現ベクター、宿主細胞 - Google Patents
山羊インシュリン様成長因子ｉ前駆体、該成長因子ｉおよび前駆体の各製造方法、並びにこれらに関与するｄｎａ、発現ベクター、宿主細胞Info
- Publication number
- JPH05199878A JPH05199878A JP34782091A JP34782091A JPH05199878A JP H05199878 A JPH05199878 A JP H05199878A JP 34782091 A JP34782091 A JP 34782091A JP 34782091 A JP34782091 A JP 34782091A JP H05199878 A JPH05199878 A JP H05199878A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- precursor
- growth factor
- igf
- dna
- insulin
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 山羊を由来とする新規なインシュリン様成長
因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）前駆体、および該前駆体やＩＧＦ
−Ｉの製造方法、並びにこれらの遺伝子操作に関与する
ＤＮＡ，発現ベクター，宿主細胞等を提供する。 【構成】 本発明に係る前駆体は、山羊を由来とする新
規なＩＧＦ−Ｉ前駆体であり、具体的には図１に示され
た−４９から１０５のアミノ酸配列を有する。また上記
前駆体をコードするＤＮＡも、図１に具体的に示され
る。
因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）前駆体、および該前駆体やＩＧＦ
−Ｉの製造方法、並びにこれらの遺伝子操作に関与する
ＤＮＡ，発現ベクター，宿主細胞等を提供する。 【構成】 本発明に係る前駆体は、山羊を由来とする新
規なＩＧＦ−Ｉ前駆体であり、具体的には図１に示され
た−４９から１０５のアミノ酸配列を有する。また上記
前駆体をコードするＤＮＡも、図１に具体的に示され
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞増殖作用と共にイ
ンシュリン様の代謝活性を有する増殖因子であるインシ
ュリン様成長因子Ｉ（以下ＩＧＦ−Ｉと略称する）の新
規な前駆体、および該前駆体やＩＧＦ−Ｉを製造する方
法、並びにこれらの遺伝子操作に関与するＤＮＡ，発現
ベクター，宿主細胞等に関するものである。
ンシュリン様の代謝活性を有する増殖因子であるインシ
ュリン様成長因子Ｉ（以下ＩＧＦ−Ｉと略称する）の新
規な前駆体、および該前駆体やＩＧＦ−Ｉを製造する方
法、並びにこれらの遺伝子操作に関与するＤＮＡ，発現
ベクター，宿主細胞等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＩＧＦ−Ｉは、細胞増殖作用と共にイン
シュリン様の代謝活性を有する増殖因子であり、７０個
のアミノ酸残基からなる塩基性単鎖ポリペプチドで構成
され、脳下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）の
作用を受けて主として肝臓で産生される。また骨組織の
成長を促進すると共に、筋肉や脂肪組織においてもイン
シュリン様の糖代謝作用等を示すと考えられている。
シュリン様の代謝活性を有する増殖因子であり、７０個
のアミノ酸残基からなる塩基性単鎖ポリペプチドで構成
され、脳下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）の
作用を受けて主として肝臓で産生される。また骨組織の
成長を促進すると共に、筋肉や脂肪組織においてもイン
シュリン様の糖代謝作用等を示すと考えられている。
【０００３】近年上記の様なエンドクリン作用に加え
て、オートクリン／パラクリン作用を示唆する次のよう
な報告がなされている。 肝臓以外の多くの組織（肺，腎臓，心臓等）におい
て、ＩＧＦ−Ｉ活性とそのｍＲＮＡの発現が見られる。 悪性腫瘍を含む様々な細胞培養系において、ＩＧＦ−
Ｉが産出され、またＩＧＦ−Ｉがこれらの細胞に対して
増殖活性を持つ。 細胞によるＩＧＦ−Ｉの産出はＧＨだけでなく、エス
トロゲン，ゴナドトロピン，インスリン，ＥＧＦ，ＴＧ
Ｆ−αおよびＦＳＨ等のホルモン並びに栄養状態により
調節されており、その機構はその細胞により多様であ
る。
て、オートクリン／パラクリン作用を示唆する次のよう
な報告がなされている。 肝臓以外の多くの組織（肺，腎臓，心臓等）におい
て、ＩＧＦ−Ｉ活性とそのｍＲＮＡの発現が見られる。 悪性腫瘍を含む様々な細胞培養系において、ＩＧＦ−
Ｉが産出され、またＩＧＦ−Ｉがこれらの細胞に対して
増殖活性を持つ。 細胞によるＩＧＦ−Ｉの産出はＧＨだけでなく、エス
トロゲン，ゴナドトロピン，インスリン，ＥＧＦ，ＴＧ
Ｆ−αおよびＦＳＨ等のホルモン並びに栄養状態により
調節されており、その機構はその細胞により多様であ
る。
【０００４】ＩＧＦ−Ｉはプロインシュリンと構造上高
い相同性を有しており、３個のＳ−Ｓ結合を有し、分子
量は約７ｋＤａである。プロインシュリンはＮ末端から
Ｂ，Ｃ，Ａ鎖よりなり、プロセシングの過程でＣ鎖が除
かれてインシュリンになるのに対し、プロＩＧＦ−Ｉは
Ｂ，Ｃ，Ａ，Ｄ，Ｅ鎖からなりＥ鎖が除かれてＩＧＦ−
Ｉになり、インシュリンで見られるようなＣ鎖の切断は
行なわれない。
い相同性を有しており、３個のＳ−Ｓ結合を有し、分子
量は約７ｋＤａである。プロインシュリンはＮ末端から
Ｂ，Ｃ，Ａ鎖よりなり、プロセシングの過程でＣ鎖が除
かれてインシュリンになるのに対し、プロＩＧＦ−Ｉは
Ｂ，Ｃ，Ａ，Ｄ，Ｅ鎖からなりＥ鎖が除かれてＩＧＦ−
Ｉになり、インシュリンで見られるようなＣ鎖の切断は
行なわれない。
【０００５】現在ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡは、ヒト、ラッ
ト、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、カエル’、ニワト
リ’、サケ’（’はＰＣＲ法による）で、またＩＧＦ−
Ｉ遺伝子は、ヒト、ラット、ヒツジ、ニワトリで単離さ
れている。この中でヒト、ラット、マウス、ヒツジでは
数種類のｃＤＮＡが報告されていて、択一的スプライシ
ングを含む調節機構が存在する。ヒト、ラットのＩＧＦ
−Ｉ遺伝子は６つのエキソンと５つのイントロンからな
り、大きさは７０ｋｂ以上にもなる。１９８６年にヒト
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子が単離されたにもかかわらず、発現量
の低さ及びその多様性のため、プロモーターの同定が進
まず、１９９１年にようやくヒト、ラット、ニワトリで
転写開始部位が決定された。
ト、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、カエル’、ニワト
リ’、サケ’（’はＰＣＲ法による）で、またＩＧＦ−
Ｉ遺伝子は、ヒト、ラット、ヒツジ、ニワトリで単離さ
れている。この中でヒト、ラット、マウス、ヒツジでは
数種類のｃＤＮＡが報告されていて、択一的スプライシ
ングを含む調節機構が存在する。ヒト、ラットのＩＧＦ
−Ｉ遺伝子は６つのエキソンと５つのイントロンからな
り、大きさは７０ｋｂ以上にもなる。１９８６年にヒト
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子が単離されたにもかかわらず、発現量
の低さ及びその多様性のため、プロモーターの同定が進
まず、１９９１年にようやくヒト、ラット、ニワトリで
転写開始部位が決定された。
【０００６】本発明の目的は、山羊を由来とする新規な
ＩＧＦ−Ｉ前駆体および該前駆体やＩＧＦ−Ｉの製造方
法、並びにこれらの遺伝子操作に関与するＤＮＡ、発現
ベクター、宿主細胞等を提供することにある。
ＩＧＦ−Ｉ前駆体および該前駆体やＩＧＦ−Ｉの製造方
法、並びにこれらの遺伝子操作に関与するＤＮＡ、発現
ベクター、宿主細胞等を提供することにある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明にかかる前駆体
は山羊を由来とする新規なＩＧＦ−Ｉ前駆体であり、具
体的には後記図 1に示された−４９から１０５のアミノ
酸配列を有する。また本発明にかかるＤＮＡは、上記Ｉ
ＧＦ−Ｉ前駆体をコードするものであり、具体的には後
記図 1に示されたヌクレオチド配列を有する。更に上記
ＤＮＡをプラスミドやファージなどに組み込むことによ
り、発現ベクターとなり、該発現ベクターによって宿主
転換される。本発明はＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−Ｉ前駆体の
製造方法にも関するものであり、上記の様にして形質転
換された宿主細胞を培養することによって、培養物から
ＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−Ｉ前駆体が採取できる。
は山羊を由来とする新規なＩＧＦ−Ｉ前駆体であり、具
体的には後記図 1に示された−４９から１０５のアミノ
酸配列を有する。また本発明にかかるＤＮＡは、上記Ｉ
ＧＦ−Ｉ前駆体をコードするものであり、具体的には後
記図 1に示されたヌクレオチド配列を有する。更に上記
ＤＮＡをプラスミドやファージなどに組み込むことによ
り、発現ベクターとなり、該発現ベクターによって宿主
転換される。本発明はＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−Ｉ前駆体の
製造方法にも関するものであり、上記の様にして形質転
換された宿主細胞を培養することによって、培養物から
ＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−Ｉ前駆体が採取できる。
【０００８】
【作用】本発明者は、これまで研究されなかった動物に
着目し、特に山羊に由来するＩＧＦ−Ｉ前駆体の単離に
ついて様々な角度から検討を重ねた結果、ここに本発明
を完成するに至った。本発明の山羊ＩＧＦ−Ｉ前駆体を
コードするＤＮＡは、例えば後記実施例に示す方法に従
って製造することができるが、例えばＤＮＡ合成機を用
いる常法によっても当業者により容易に製造することが
できる。また本発明の山羊ＩＧＦ−ＩをコードするＤＮ
Ａを用いて、通常用いられる遺伝子工学の技術（例えば
Molecular cloning Second Edition Manitis,T.Cold Sp
ring Harbor Laboratry Press1989参照）に従い、本発
明の山羊ＩＧＦ−Ｉおよびその前駆体の発現ベクター、
それを含む形質転換体、それを培養することにより山羊
ＩＧＦ−Ｉおよびその前駆体を製造することができる。
着目し、特に山羊に由来するＩＧＦ−Ｉ前駆体の単離に
ついて様々な角度から検討を重ねた結果、ここに本発明
を完成するに至った。本発明の山羊ＩＧＦ−Ｉ前駆体を
コードするＤＮＡは、例えば後記実施例に示す方法に従
って製造することができるが、例えばＤＮＡ合成機を用
いる常法によっても当業者により容易に製造することが
できる。また本発明の山羊ＩＧＦ−ＩをコードするＤＮ
Ａを用いて、通常用いられる遺伝子工学の技術（例えば
Molecular cloning Second Edition Manitis,T.Cold Sp
ring Harbor Laboratry Press1989参照）に従い、本発
明の山羊ＩＧＦ−Ｉおよびその前駆体の発現ベクター、
それを含む形質転換体、それを培養することにより山羊
ＩＧＦ−Ｉおよびその前駆体を製造することができる。
【０００９】本発明で用いるベクターについては特に制
限されるものではなく、目的により適当なプラスミドや
ファージを選択することができる。また宿主細胞につい
ても特に限定されるものではなく、大腸菌や枯草菌など
の細菌および酵母、あるいは哺乳動物細胞等のいずれを
用いても本発明の目的が達成できる。
限されるものではなく、目的により適当なプラスミドや
ファージを選択することができる。また宿主細胞につい
ても特に限定されるものではなく、大腸菌や枯草菌など
の細菌および酵母、あるいは哺乳動物細胞等のいずれを
用いても本発明の目的が達成できる。
【００１０】
実施例１ （１）山羊肝臓ＲＮＡの抽出 山羊（父トカラ種、母シバ種の子供で生後３カ月、牡）
の肝臓の組織２ｇを液体窒素につけ数分間エマレーショ
ンにかけて粉末状にした。組織１ｇ当たり６ｍｌの６Ｍ
グアニジン・イソシアネート、０．５％サルコシルナト
リウム、０．１Ｍβーメルカプトエタノールを含むクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）をホモジナイザー
の溶液に入れ、粉末状の組織を加えた。ホモジナイザー
で約１０分間細胞を破壊した後、これを２２Ｇの注射針
に数回通して高分子のＤＮＡを分断した。日立１３ＰＡ
遠心管（ポリアロマー製）に３ｍｌの５．７Ｍ塩化セシ
ウム０．１ＭＥＤＴＡ溶液をクッションとしていれた上
に、試料を重層し、日立遠心器ＲＰＳ４０Ｔローターで
超遠心を行った（３０，０００ｒｐｍ、２４時間、１８
℃）。超遠心した試料の上清をＤＮＡのバンドの下まで
吸い取り遠心管側面を６Ｍグアニジン・イソシアネー
ト、０．５％サルコシルナトリウム、０．１Ｍβーメル
カプトエタノールを含むクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で２回洗った。更に下から５ｍｍの高さまで
塩化セシウム溶液を吸引して、２ｃｍの位置で遠心管を
切断した。残りの塩化セシウム溶液を除去した後、ＲＮ
Ａ沈澱に７０％エタノールを１ｍｌ加えた。１分間氷上
に置いた後、微量反応管に移して遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ，１０分）を行った。得られた沈澱を１ｍＭ
ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳを含むトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４００μｌに溶解させた。クロロホル
ム：ブタノール＝４：１の液を等量加え、激しく振とう
した後遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，３分）を行い、
上清を取り１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２．
５倍容のエタノールを加えてー７０℃、２０分間放置後
遠心分離（１２, ０００ｒｐｍ, ５分、０℃）を行い、
沈澱をエタノールで洗浄し、減圧乾燥後８０μｌの０．
５Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶かした。こうして得られた沈澱を全ＲＮ
Ａとした。
の肝臓の組織２ｇを液体窒素につけ数分間エマレーショ
ンにかけて粉末状にした。組織１ｇ当たり６ｍｌの６Ｍ
グアニジン・イソシアネート、０．５％サルコシルナト
リウム、０．１Ｍβーメルカプトエタノールを含むクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）をホモジナイザー
の溶液に入れ、粉末状の組織を加えた。ホモジナイザー
で約１０分間細胞を破壊した後、これを２２Ｇの注射針
に数回通して高分子のＤＮＡを分断した。日立１３ＰＡ
遠心管（ポリアロマー製）に３ｍｌの５．７Ｍ塩化セシ
ウム０．１ＭＥＤＴＡ溶液をクッションとしていれた上
に、試料を重層し、日立遠心器ＲＰＳ４０Ｔローターで
超遠心を行った（３０，０００ｒｐｍ、２４時間、１８
℃）。超遠心した試料の上清をＤＮＡのバンドの下まで
吸い取り遠心管側面を６Ｍグアニジン・イソシアネー
ト、０．５％サルコシルナトリウム、０．１Ｍβーメル
カプトエタノールを含むクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で２回洗った。更に下から５ｍｍの高さまで
塩化セシウム溶液を吸引して、２ｃｍの位置で遠心管を
切断した。残りの塩化セシウム溶液を除去した後、ＲＮ
Ａ沈澱に７０％エタノールを１ｍｌ加えた。１分間氷上
に置いた後、微量反応管に移して遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ，１０分）を行った。得られた沈澱を１ｍＭ
ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳを含むトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４００μｌに溶解させた。クロロホル
ム：ブタノール＝４：１の液を等量加え、激しく振とう
した後遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，３分）を行い、
上清を取り１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２．
５倍容のエタノールを加えてー７０℃、２０分間放置後
遠心分離（１２, ０００ｒｐｍ, ５分、０℃）を行い、
沈澱をエタノールで洗浄し、減圧乾燥後８０μｌの０．
５Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶かした。こうして得られた沈澱を全ＲＮ
Ａとした。
【００１１】（２）ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡの調製 ０．５Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で平衝化したオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムタイプ７（ファルマシア製）に、濃度が１ｍｇ／
ｍｌになるように、上記で得られたＲＮＡに０．５Ｍ塩
化カリウム、０．０１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を加え７０℃で３分間反応させて氷水中で急冷した
試料を重層し、０．５Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、さらにカラムを２倍容
（４ｍｌ）の０．１Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリス
・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。最後に０．０
１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でｐｏｌｙ
（Ａ）ｍＲＮＡを溶出させた。ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ
を含む画分をエタノール沈澱し、ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮ
Ａ３０μｇを得た。
（ｐＨ７．５）で平衝化したオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムタイプ７（ファルマシア製）に、濃度が１ｍｇ／
ｍｌになるように、上記で得られたＲＮＡに０．５Ｍ塩
化カリウム、０．０１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を加え７０℃で３分間反応させて氷水中で急冷した
試料を重層し、０．５Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、さらにカラムを２倍容
（４ｍｌ）の０．１Ｍ塩化カリウム、０．０１Ｍトリス
・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。最後に０．０
１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でｐｏｌｙ
（Ａ）ｍＲＮＡを溶出させた。ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ
を含む画分をエタノール沈澱し、ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮ
Ａ３０μｇを得た。
【００１２】（３）ｃＤＮＡの合成 アマシャム社製のｃＤＮＡ合成キット「ｃＤＮＡ合成シ
ステムプラス」を用い実施例１（２）で得られたｐｏｌ
ｙ（Ａ）ｍＲＮＡ５μｇをグブラー・ホフマン法（Gubl
er, U and Hoffman, B.J., Gene. 25(1983) pp263-269
参照）に従って第１鎖ｃＤＮＡ、さらに第２鎖ｃＤＮＡ
の合成を行い、ｃＤＮＡ１μｇを得た。
ステムプラス」を用い実施例１（２）で得られたｐｏｌ
ｙ（Ａ）ｍＲＮＡ５μｇをグブラー・ホフマン法（Gubl
er, U and Hoffman, B.J., Gene. 25(1983) pp263-269
参照）に従って第１鎖ｃＤＮＡ、さらに第２鎖ｃＤＮＡ
の合成を行い、ｃＤＮＡ１μｇを得た。
【００１３】（４）ｃＤＮＡのクローニングおよび山羊
ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡの単離 上記のようにして得られたｃＤＮＡ１μｇをアマシャム
社製ｃＤＮＡクローニングキット「ｃＤＮＡクローニン
グシステムλｇｔ１１」を用いλｇｔアダプター法（Uu
ynh, T. V., Young, R. A. and Daivis, R. W. pp49-78
in DNA Cloning: a practical approach, edited by
D. M. Glover, IRL press 1985 参照）に従ってλｇｔ
１１にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０株に
感染させたところ３．５Ｘ１０6 ｐｆｕからなるライブ
ラリーを得た。このうち４Ｘ１０5個のプラークをプロ
ーブとしてヒトＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ（M. Jansen et al,
Nature 306(1983) pp609-611 参照）を用いてプラーク
ハイブリダイゼーション（Maniatis, T. Molecular clo
ning Cold Spring Harbor Laboratory 1982 参照）を行
った。その結果、２個の陽性シグナルを得た。
ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡの単離 上記のようにして得られたｃＤＮＡ１μｇをアマシャム
社製ｃＤＮＡクローニングキット「ｃＤＮＡクローニン
グシステムλｇｔ１１」を用いλｇｔアダプター法（Uu
ynh, T. V., Young, R. A. and Daivis, R. W. pp49-78
in DNA Cloning: a practical approach, edited by
D. M. Glover, IRL press 1985 参照）に従ってλｇｔ
１１にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０株に
感染させたところ３．５Ｘ１０6 ｐｆｕからなるライブ
ラリーを得た。このうち４Ｘ１０5個のプラークをプロ
ーブとしてヒトＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ（M. Jansen et al,
Nature 306(1983) pp609-611 参照）を用いてプラーク
ハイブリダイゼーション（Maniatis, T. Molecular clo
ning Cold Spring Harbor Laboratory 1982 参照）を行
った。その結果、２個の陽性シグナルを得た。
【００１４】このようにしてして得られたプラークから
ファージを回収しＤＮＡを精製した（Maniatis, T. Mol
ecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory 1982
参照）。このＤＮＡをクローニング部位で切断するた
め、Eco RIアダプター部位に存在するBam HI 制限酵素
部位で切断を行った。得られた断片に対しヒトＩＧＦ−
ＩｃＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行
った（Maniatis, T. Molecular cloning Cold Spring H
arbor Laboratory 1982 参照）。その結果、約1.4,1.0,
0.4kb の断片が検出された。1.4kb がｃＤＮＡの全長
で、1.0kb と0.4kbの断片はそのBam HIによる切断断片
と思われる。
ファージを回収しＤＮＡを精製した（Maniatis, T. Mol
ecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory 1982
参照）。このＤＮＡをクローニング部位で切断するた
め、Eco RIアダプター部位に存在するBam HI 制限酵素
部位で切断を行った。得られた断片に対しヒトＩＧＦ−
ＩｃＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行
った（Maniatis, T. Molecular cloning Cold Spring H
arbor Laboratory 1982 参照）。その結果、約1.4,1.0,
0.4kb の断片が検出された。1.4kb がｃＤＮＡの全長
で、1.0kb と0.4kbの断片はそのBam HIによる切断断片
と思われる。
【００１５】（５）塩基配列の決定 上記で得られた1.0kb および0.4kb のBam HI断片を宝酒
造製の塩基配列決定キット「Ｍ１３ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｋｉｔ」を用い、ジデオキシ法（Sanger, F, Sci
ence, 214(1981) pp1205-1210 参照）で Ｍ１３ｍｐ１
９にクローニングし塩基配列の一部を決定した。その結
果を図３に示した。
造製の塩基配列決定キット「Ｍ１３ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｋｉｔ」を用い、ジデオキシ法（Sanger, F, Sci
ence, 214(1981) pp1205-1210 参照）で Ｍ１３ｍｐ１
９にクローニングし塩基配列の一部を決定した。その結
果を図３に示した。
【００１６】実施例２ 実施例１と同様の方法でヤギ肝臓よりＲＮＡを抽出し、
オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによってｍＲＮＡを分
画し、このｍＲＮＡ１μｇをアマシャム社製ｃＤＮＡ合
成キット「ｃＤＮＡ合成システムプラス」をもちいて第
１鎖ｃＤＮＡを合成した。
オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによってｍＲＮＡを分
画し、このｍＲＮＡ１μｇをアマシャム社製ｃＤＮＡ合
成キット「ｃＤＮＡ合成システムプラス」をもちいて第
１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００１７】実施例１で得られた塩基配列から、ヤギＩ
ＧＦ−ＩｃＤＮＡと他種のＩＧＦ−ＩｃＤＮＡは非常に
高い相同性を有することが予想された。そこで次の配列
を有するオリゴヌクレオチドを全自動ＤＮＡ合成機（Ｍ
ｏｄｅｌ ３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社製）を用いて合成した。 Ａ：５’ＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣ３’：２２ｍｅｒ Ｂ：５’ＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧ３’ ：２０ｍｅｒ Ａはヒト（Rotwein, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
3(1986) pp77参照）、ラット（Roberts, C.T. Biochemi
cal and Biophysical Research Communication 146(198
7) pp1154 参照）、ヒツジ（Wong, E. A DNA 8(1989)
649 参照）ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ５’非翻訳領域で保存さ
れていた配列を、Ｂは実施例１で得られた配列をもとに
合成した。
ＧＦ−ＩｃＤＮＡと他種のＩＧＦ−ＩｃＤＮＡは非常に
高い相同性を有することが予想された。そこで次の配列
を有するオリゴヌクレオチドを全自動ＤＮＡ合成機（Ｍ
ｏｄｅｌ ３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社製）を用いて合成した。 Ａ：５’ＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣ３’：２２ｍｅｒ Ｂ：５’ＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧ３’ ：２０ｍｅｒ Ａはヒト（Rotwein, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
3(1986) pp77参照）、ラット（Roberts, C.T. Biochemi
cal and Biophysical Research Communication 146(198
7) pp1154 参照）、ヒツジ（Wong, E. A DNA 8(1989)
649 参照）ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡ５’非翻訳領域で保存さ
れていた配列を、Ｂは実施例１で得られた配列をもとに
合成した。
【００１８】ＰＣＲ（polymerase chain reaction ）反
応はHenry A.Erlich(1989)PCR Technology Stockton Pr
ess pp.7に基づいて行った。ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，
Ｃ，Ｔ）各々２００μＭ，５０ｍＭ 塩化カリウム、１
０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．４），１．５ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム、１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、
ＡｍｐTaq ポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ，ＡＢ合成オ
リゴヌクレオチド各々０．２５μＭ，ｃＤＮＡは上記の
１μｇのｍＲＮＡから合成したうちの１／５量を用い、
総量は１００μｌで反応を行った。反応条件は９５℃；
１分、５５℃；２分、７２℃；３分、このサイクルを３
２回行った。反応終了後、フェノール／クロロホルム抽
出を２回行った。上清に対し１／１０量酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．２）２．５倍量エタノールを加えて沈澱後回
収した。
応はHenry A.Erlich(1989)PCR Technology Stockton Pr
ess pp.7に基づいて行った。ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，
Ｃ，Ｔ）各々２００μＭ，５０ｍＭ 塩化カリウム、１
０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．４），１．５ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム、１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、
ＡｍｐTaq ポリメラーゼ２．５ｕｎｉｔｓ，ＡＢ合成オ
リゴヌクレオチド各々０．２５μＭ，ｃＤＮＡは上記の
１μｇのｍＲＮＡから合成したうちの１／５量を用い、
総量は１００μｌで反応を行った。反応条件は９５℃；
１分、５５℃；２分、７２℃；３分、このサイクルを３
２回行った。反応終了後、フェノール／クロロホルム抽
出を２回行った。上清に対し１／１０量酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．２）２．５倍量エタノールを加えて沈澱後回
収した。
【００１９】Ａの合成オリゴヌクレオチドにはＫｐｎＩ
制限酵素切断部位が、ＢにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部
位があるので、この２つの制限酵素で反応し、１％アガ
ロースゲル電気泳動法により分画後プラスミドベクター
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（Stratagene社製）
のＫｐｎＩ ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位にクローニン
グした。ＡｍｐTaq ポリメラーゼは読み間違いが０．２
５％の割合で生じるという報告もあるので、別々に単離
した５個のクローンについて塩基配列を決定した。塩基
配列は全自動ＤＮＡシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ ３７３
Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）Ｔ
ａｑダイプライマーサイクルシーケンシングキット（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決
定した。５つのクローンの塩基配列の比較から０．１２
％の読み間違いがあった。実施例１で得られた塩基配列
と、ＰＣＲ法で得られた塩基配列とで重複した部分（３
８１ｂｐ〜５９０ｂｐ）は配列が完全に一致した（図１
および図２参照）。そこでこの２つの塩基配列をあわせ
て山羊ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡの塩基配列とした。これを図
１に示す。
制限酵素切断部位が、ＢにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部
位があるので、この２つの制限酵素で反応し、１％アガ
ロースゲル電気泳動法により分画後プラスミドベクター
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（Stratagene社製）
のＫｐｎＩ ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位にクローニン
グした。ＡｍｐTaq ポリメラーゼは読み間違いが０．２
５％の割合で生じるという報告もあるので、別々に単離
した５個のクローンについて塩基配列を決定した。塩基
配列は全自動ＤＮＡシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ ３７３
Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）Ｔ
ａｑダイプライマーサイクルシーケンシングキット（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決
定した。５つのクローンの塩基配列の比較から０．１２
％の読み間違いがあった。実施例１で得られた塩基配列
と、ＰＣＲ法で得られた塩基配列とで重複した部分（３
８１ｂｐ〜５９０ｂｐ）は配列が完全に一致した（図１
および図２参照）。そこでこの２つの塩基配列をあわせ
て山羊ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡの塩基配列とした。これを図
１に示す。
【図１】本発明に係るＩＧＦ−Ｉ前駆体のアミノ酸配列
およびそれに対応するＤＮＡのヌクレオチド配列を示す
図である。
およびそれに対応するＤＮＡのヌクレオチド配列を示す
図である。
【図２】山羊ＩＧＦ−ＩのｃＤＮＡのマップである。
【図３】山羊ＩＧＦ−ＩｃＤＮＡの一部分の塩基配列を
示す図である。
示す図である。
Claims (8)
- 【請求項１】 山羊インシュリン様成長因子Ｉ前駆体。
- 【請求項２】 図１に示された−４９から１０５のアミ
ノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の山
羊インシュリン様成長因子Ｉ前駆体。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２に記載の山羊イ
ンシュリン様成長因子Ｉ前駆体をコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 図１に示されたヌクレオチド配列を有す
ることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項３または４に記載のＤＮＡを含有
している発現ベクター。 - 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターによって
形質転換された宿主細胞。 - 【請求項７】 請求項６に記載の宿主細胞を培地に培養
し、培養物から山羊インシュリン様成長因子Ｉ前駆体を
採取することを特徴とする山羊インシュリン様成長因子
Ｉ前駆体の製造方法。 - 【請求項８】 請求項６に記載の宿主細胞を培地に培養
し、培養物から山羊インシュリン様成長因子Ｉを採取す
ることを特徴とする山羊インシュリン様成長因子Ｉの製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34782091A JPH05199878A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 山羊インシュリン様成長因子ｉ前駆体、該成長因子ｉおよび前駆体の各製造方法、並びにこれらに関与するｄｎａ、発現ベクター、宿主細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34782091A JPH05199878A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 山羊インシュリン様成長因子ｉ前駆体、該成長因子ｉおよび前駆体の各製造方法、並びにこれらに関与するｄｎａ、発現ベクター、宿主細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05199878A true JPH05199878A (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=18392818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34782091A Withdrawn JPH05199878A (ja) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | 山羊インシュリン様成長因子ｉ前駆体、該成長因子ｉおよび前駆体の各製造方法、並びにこれらに関与するｄｎａ、発現ベクター、宿主細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05199878A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010146059A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
-
1991
- 1991-12-02 JP JP34782091A patent/JPH05199878A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010146059A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990311 |