JPH0518887A

JPH0518887A - 微粒子の計測及び操作方法

Info

Publication number: JPH0518887A
Application number: JP3168244A
Authority: JP
Inventors: Akira Mizuno; 彰水野
Original assignee: Asahi Kogyosha Co Ltd
Current assignee: Asahi Kogyosha Co Ltd
Priority date: 1991-07-09
Filing date: 1991-07-09
Publication date: 1993-01-26
Anticipated expiration: 2016-02-26
Also published as: JP3138497B2

Abstract

(57)【要約】【目的】一個の細胞や生体高分子等の微粒子を捕捉す
ると共にこれを配向させかつ任意の位置に移動できるこ
とを可能とする。【構成】細胞や生体高分子などの微粒子の懸濁液をス
ライドガラス等のチャンバに収容し、その懸濁液中サン
プリングすべき微粒子にレーザビームを照射して捕捉
し、その捕捉した微粒子を静電力により電界方向に配向
させ、しかる後レーザビーム又はチャンバを移動させて
微粒子を輸送することを特徴としている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞や生体高分子等の
微粒子を捕捉すると共に配向し、これを計測したり輸送
したりする方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】バイオテクノロジーの分野において、細
胞や生体高分子などの微粒子の選別や計測等の操作は極
めて重要な支援技術である。静電力を用いた技術として
は、電気泳動或いは誘電泳動による細胞・タンパク等の
分離・計測操作が広く行われており、また細胞を含む液
滴を形成して静電力により選別するセルソータ，パルス
電圧を用いた細胞融合や遺伝子導入の技術が近年確立さ
れてきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、一個の
細胞や生体高分子等の微粒子に着目し、これを捕捉した
り任意の位置に移動したり或いは回転させるなどの操作
技術は確立されていない。

【０００４】そこで、本発明の目的は、上記課題を解決
し、一個の細胞や生体高分子等の微粒子を捕捉すると共
にこれを配向させかつ任意の位置に移動できる微粒子の
計測・選別方法提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明は、細胞や生体高分子などの微粒子の懸濁液中
に、レーザビームを照射してサンプリングすべき微粒子
を捕捉し、その捕捉した微粒子を静電力により電界方向
に配向させて微粒子の計測を行う方法にあり、また電界
方向を変えて微粒子を回転させる方法にあり、さらに細
胞などの微粒子の懸濁液をスライドガラス等のチャンバ
に収容し、その懸濁液中サンプリングすべき微粒子にレ
ーザビームを照射して捕捉し、その捕捉した微粒子を静
電力により電界方向に配向させ、しかる後レーザビーム
又はチャンバを移動させて微粒子を輸送する方法にあ
る。

【０００６】

【作用】上記構成によれば、サンプリングすべき微粒子
にレーザビームを照射することで、微粒子はレーザビー
ムの光軸に閉じ込められてトラップされ、次に静電力で
電界方向に配向させ、その状態で微粒子形状を計測した
り、トラップした微粒子を輸送したり或いは電界方向を
変えて回転させるなどすることで、種々の操作が行え
る。

【０００７】

【実施例】以下、本発明の一実施例を添付図面に基づい
て詳述する。

【０００８】先ず本発明における方法を実施する装置を
図１，２により説明する。

【０００９】図１において、１は顕微鏡の概略を示し、
その下方に前後左右及び上下方向に移動自在なＸＹＺス
テージ２を有する。このステージ２上には、スライドガ
ラス等のチャンバ３が設けられる。このチャンバ３に
は、細胞，大腸菌，ＤＮＡ，原生動物等の微粒子の懸濁
液をサンプルとして収容してある。

【００１０】このサンプルへのレーザビームの照射は、
レーザ光源４から水平なレーザビームＬ_Iがビームスプ
リッタ５に入射して９０度下向きにされ、対物レンズ６
を通して、サンプル内の微粒子に集束され、その反射ビ
ームＬ_Rが対物レンズ６を通り、ビームスプリッタ５を
通り、散乱光をカットするブロッキングフィルタ７を通
してビデオカメラ８に撮影される。このビデオカメラ８
にはビデオカセットレコーダ（ＶＣＲ）９が接続され、
かつ撮影された画像がモニターＴＶ１０でモニタできる
ようになっている。

【００１１】またチャンバ３の底面には、図２に示すよ
うに五角形状のアルミ電極（例えば厚さ２０μｍ）１
１，１１が設けられると共にその尖端１１ａ，１１ａ
が、所定間隔ｔ（例えばｔ＝５０μｍ）置いてて互いに
向き合うように張り付けられる。この電極１１，１１に
は、周波数１ＭＨｚの０〜８０Ｖの交流電圧を印加する
電源装置１２が接続される。

【００１２】以上において、レーザ光源４からのレーザ
ビームＬ_Iが対物レンズ６を通して絞り、チャンバ３の
底面に焦点を結び、かつその反射ビームＬ_Rをモニター
ＴＶ１０でモニタしながらサンプル中の捕捉すべき微粒
子にレーザビームＬ_Iを照射する。

【００１３】微粒子に、レーザビームＬ_Iを照射する
と、光の屈折が生じ、光子の運動量が変化し、これによ
り微粒子に力が働く。この力は、光圧力又は輻射圧力と
いい、光軸方向に沿って、かつレーザ出射方向に働く駆
動力と、光軸と垂直方向に働く閉じ込め力とに分解でき
る。この光軸方向の光圧力の大きさは、微粒子の屈折率
とレーザの光強度によって決まる。閉じ込め圧力は、レ
ーザ光強度がビーム中心部で大きく、周辺部で小さいこ
とに起因し、その大きさはレーザ光強度の光軸に垂直な
面でのグレディエントに依存し、微粒子の屈折率が周囲
媒質の屈折率より大きい場合、そのグレディエント光強
度に応じてビーム中心に向かう力が生じる。従ってレー
ザビームＬ_Iを照射された微粒子は光軸方向に移動する
と共に光軸上に閉じ込められ、チャンバ３の底面でトラ
ップされる。或いはレーザビームを急激に絞ると、出射
方向への駆動力と焦点直後のビーム拡がりによる焦点方
向へ引き戻すグレデエント力とのつり合った点で微粒子
がトラップされる。

【００１４】この微粒子をトラップした位置が電極１
１，１１間に位置しているとき、電極１１，１１に交流
電圧を印加し、その間に電界を形成すると、微粒子は、
静電力により電界方向に配向される。これにより染色体
などの軟らかい微粒子も配向するので形状の画像認識な
どによる高精度計測を容易に行うことが可能となる。こ
の後、レーザビームＬ_I又はチャンバ３を、実施例では
ＸＹＺステージ２を移動することで、配向した微粒子を
トラップした状態で輸送できる。これにより個々の微粒
子を所定の場所に輸送し各種の操作が行える。

【００１５】また図３は本発明の他の実施例を示すもの
である。図３（ａ）に示すように、チャンバ底面に微粒
子のトラップ位置を中心に１８０度対向し、かつ放射状
に配列された複数対の電極１５ａ，１５ｂ，１５ｃが設
けられ、これら対向した電極１５ａ，１５ｂ，１５ｃ間
にそれぞれ電源装置１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃが接続され
る。この電源装置１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃは、各電極１
５ａ，１５ｂ，１５ｃに回転電界がかかるよう図３
（ｂ）に示すよう各高周波電圧Ａ〜Ｃの電圧波形が順次
位相がずれた高周波電圧を各電極１５ａ，１５ｂ，１５
ｃに印加できるようになっている。

【００１６】この図３の実施例においては、レーザビー
ムでトラップされた微粒子ｐが各電極１５ａ，１５ｂ，
１５ｃ間に形成される電界方向に配向されるが、各電極
１５ａ，１５ｂ，１５ｃ間の電界を順次切り替えること
で図示の矢印に示したように回転できる。このように微
粒子を回転させることで、微粒子は確実に電界方向に配
向できると共に微粒子を種々の角度から観察できる。

【００１７】次に実験例を説明する。

【００１８】レーザ光源４としてＹＡＧレーザ（連続発
振、波長１．０６μｍ、ＴＥＭ₀₀モード、最大出力約５
００ｍＷ）とアルゴンイオンレーザ（連続発振、波長４
８８ｎｍ，５１４ｎｍ、ＴＥＭ₀₀モード、最大出力約２
Ｗ）を用いた。直径５mmに拡げられたレーザビームＬ_I
は顕微鏡１（オリンパスＢＨ−２）に導入され、対物レ
ンズ６（オリンパスＡ４０ＰＬ，開口数０．５）により
チャンバ３であるスライドガラス上に焦点を結びサンプ
ルをトラップする。集光されたレーザのスポットの直径
は約１０μｍである。レーザ出力は、ビームスプリッタ
５で約５０％減衰され、対物レンズ６で約２０％減衰さ
れる。従って以下レーザ出力の表示は、対物レンズ６を
出射したレーザを測定した値を示す。またサンプルの動
作はモニターＴＶ１０で観察すると共にＶＣＲ９に記録
した。サンプルには、イースト菌（直径３〜５μｍ，長
さ４〜７μｍ）、大腸菌（直径１μｍ，長さ約２〜３μ
ｍ）、ミドリムシ（直径約２０μｍ，長さ５０〜８０μ
ｍ）を用い、また輸送実験としてポリエチレンラテック
ス粒子（直径０．７〜３．０μｍ）を用いた。これらは
脱イオン水に懸濁してサンプルとした。

【００１９】実験例１一個のイースト菌と大腸菌を、それぞれ出力１００ｍＷ
のＹＡＧレーザでレーザトラップした。これら細胞はレ
ーザでトラップされると、細胞の長軸がレーザの入射方
向と一致する方向にトラップされているのが観察され
た。次に周波数１ＭＨｚの交流電圧を電極１１，１１に
印加すると、細胞は電界方向に配向することが観察され
た。この時の電界強度はイースト菌については１０⁵Ｖ
／ｍ、大腸菌では５×１０³Ｖ／ｍであった。この条件
において配向に要した時間は、イースト菌については
０．４秒、大腸菌については０．６秒であった。

【００２０】実験例２光学的にトラップした微粒子は、スライドガラス表面上
でレーザースポットを移動させるか顕微鏡のステージを
移動させるかさせることにより、輸送することができ
る。この目的のため輸送実験を行い、その輸送最高速度
を測定した。

【００２１】この実験においては、イースト菌と粒子径
の違うラテックス微粒子（直径３．０μｍ、１．０μ
ｍ、０．７μｍの三種類）を用い、レーザでトラップし
た状態からステージを移動し、その速度を上げてトラッ
プ状態から開放された時の速度を光り輸送の最高速度と
した。また適宜レーザ出力を変えてその最高速度を測定
した。尚このポリエチレンラテックス微粒子の屈折率は
イースト菌と略同じ値であり、かつ略球形であるために
採用した。

【００２２】この実験結果を図４に示した。図４から判
るように、各微粒子は、レーザ出力が大きくなれば光輸
送の最大速度も上昇し略比例関係にあることが認められ
る。またイースト菌（直径３μｍ，長さ４μｍ）のレー
ザ出力に対する最高速度の関係は、直径３．０μｍのラ
テックス微粒子と略同じであることが判った。またラテ
ックス微粒子の直径が小さくなれば同じレーザ出力でも
その最高速度は遅くなることが判った。この理由は、最
高速度は、レーザビームの断面強度分布や閉じ込め力の
大きさを決定するグレーディエントで変化し、粒子径が
小さければそのグレデエント強度が小さくなるからと考
えられる。

【００２３】実験例３上述した実験で微粒子は光圧力によりトラップされ、静
電力で配向され、さらに光輸送されることを説明した
が、微粒子が生物である場合、レーザ光の照射及び電界
の影響によりダメージを受け、光輸送しても生物が死ん
でいる状態では、その後の操作に支障を来すこととなり
かねない。この場合、電界による影響は少なくレーザの
照射による影響が大きい。そこで、サンプルとして自ら
常に動き回っている大腸菌とミドリムシについてレーザ
照射によるダメージを実験的に評価した。

【００２４】この際、大腸菌とミドリムシの大きさを考
慮して、大腸菌に対しては、直径１０μｍ、ミドリムシ
に対しては直径２０μｍのレーザスポットを照射し、大
腸菌とミドリムシの活動が止まるまでの時間を測定し
た。

【００２５】このダメージ測定に用いたレーザは、波長
４８８ｎｍと５１４ｎｍのアルゴンイオンガスレーザと
波長１０６０ｎｍのＹＡＧレーザである。

【００２６】表１は大腸菌のレーザによるダメージ結果
を示したものである。

【００２７】

【表１】

【００２８】この表１から大腸菌は、アルゴンイオンガ
スレーザ出力が１０ｍＷと小さければ、ダメージが比較
的少ないが、出力が大きくなると活動時間が短くなり、
５０ｍＷの出力で１０秒以内で動きは止まってしまっ
た。また波長が短い方がよりダメージを受けやすい。ま
たＹＡＧレーザに関しては、レーザ出力１００ｍＷで、
７２００秒（２時間）照射した後でも細胞分裂を行って
おり、全くダメージを受けないことが判った。

【００２９】表２はミドリムシのレーザによるダメージ
結果を示したものである。

【００３０】

【表２】

【００３１】この表２からミドリムシは大腸菌よりも、
アルゴンイオンガスレーザ照射によるダメージを受けや
すく、５０ｍＷの出力で１秒以内で動きは止まってしま
った。このミドリムシが大腸菌よりダメージを受ける
理由は、ミドリムシは体内に葉緑素を持っており、これ
が可視光領域の波長にあるアルゴンガスレーザ光を透過
するよりも吸収するために、よりダメージを受けやすい
ものと考えられる。

【００３２】ＹＡＧレーザに関しては、レーザ出力２０
０ｍＷで、３００秒照射してもダメージは観察されなか
った。このＹＡＧレーザの波長は近赤外光の領域にあ
り、葉緑素は吸収することなく透過できるため、ダメー
ジを受けないものと考えられる。また測定時間が３００
秒照射のデータしか取れなかったが、これはミドリムシ
がレーザビームスポットより大きく、鞭毛で動き回る力
が大きいため最大でも、３００秒でビームスポットから
逃げ出してしまい、さらに長時間の観察はできなかった
からである。

【００３３】上述の実施例においては、ＡｒレーザとＹ
ＡＧレーザの例を示したが、この他の気体レーザ、固体
レーザ或いは高出力の半導体レーザを使用してもよい。
また電極１２はチャンバ３内に固定した例を示したが、
任意に移動できるように構成してもよい。

【００３４】実験例４図３に示した電極１５ａ〜ｃ（各電極１５ａ〜ｃの間隔
は５０μｍ）が設けられたチャンバ内に大腸菌，イース
ト菌の懸濁液を各々滴下し、レーザビームで、電極１５
ａ〜ｃの中心にトラップさせた。この後、３対の電極１
５ａ〜ｃに、１ＭＨｚ１０⁶Ｖ／ｍの高周波電圧を順次
切り替えて印加することで、それぞれ大腸菌，イースト
菌を回転操作することができた。

【００３５】

【発明の効果】以上要するに本発明によれば、サンプリ
ングすべき微粒子にレーザビームを照射することで、微
粒子はレーザビームの光軸に閉じ込められてトラップさ
れ、次に静電力で電界方向に配向させることで、また、
その状態でトラップした微粒子を輸送することで、種々
の操作が行える。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法を説明するための装置の一例を示
す概略図である。

【図２】図１のチャンバの詳細を示す平面図である。

【図３】図２の他の例を示す図である。

【図４】本発明において、光トラップした微粒子のレー
ザ出力と光輸送の最高速度の関係を示す図である。

【符号の説明】

３チャンバ４レーザ光源１１電極１２電源装置

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞や生体高分子などの微粒子の懸濁液
中に、レーザビームを照射してサンプリングすべき微粒
子を捕捉し、その捕捉した微粒子を静電力により電界方
向に配向させて微粒子の計測を行うことを特徴とする微
粒子の計測方法。
【請求項２】細胞や生体高分子などの微粒子の懸濁液
中に、レーザビームを照射してサンプリングすべき微粒
子を捕捉し、その捕捉した微粒子を静電力により電界方
向に配向させると共に電界方向を変えて微粒子を回転さ
せることを特徴とする微粒子の操作方法。
【請求項３】細胞や生体高分子などの微粒子の懸濁液
をスライドガラス等のチャンバに収容し、その懸濁液中
サンプリングすべき微粒子にレーザビームを照射して捕
捉し、その捕捉した微粒子を静電力により電界方向に配
向させ、しかる後レーザビーム又はチャンバを移動させ
て微粒子を輸送することを特徴とする微粒子の操作方
法。