JPH05184385A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、ＤＢＡ／１，ＣＥ／Ｊ，ＳＭ／
Ｊ，ＩＱＩ，ＰＬ／Ｊ，ＳＷＭ／Ｍｓ，ＲＩＩＩＳ／
Ｊ，ＲＦＭ／ＭｓＮｒｓ，およびＣ３Ｈ系統を基盤とす
る近交系やコンジェニックマウス系統のマウスのミトコ
ンドリアに存在する分子量66,000及び68,000の該抗原を
認識し、ＩｇＧ１／κサブクラスに属するモノクローナ
ル抗体Ａ、及びモノクローナル抗体Ｂを産生するハイブ
リドーマを提供するものである。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体により、細胞起
源の同定、特に一個体内のキメリズムの解析を効果的に
行なうことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は特定のマウス系統に特異
的に存在する抗原を認識するモノクローナル抗体および
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】マウス近交系はその遺伝背景を多くの遺
伝子マーカーによって特徴付けられている。これらのマ
ーカーは各マウス系統の分類において有効な手段であ
る。近年、遺伝子工学技術・発生工学技術が急速に開発
された。その内、２つ以上の遺伝的に独立した細胞集団
によってその個体を構成されるキメラマウスは１９６１
年にタルコフスキー（ネイチャー，１９０：８５７−８
６０）によって報告されて以来、発生機構、癌発生機構
や遺伝子発現の環境要因研究などにおいて非常に重要な
実験系として利用されている。キメラマウスの解析には
組織の解析が必須でありキメラ組織を形成する細胞の起
源を同定する為に多くの方法が開発された。それらの方
法には抗体を用いた免疫組織化学法による解析法も報告
されたが（Ｈ−２；Ponder, B. A.J. ら、J. Embryol.
Exp. Morpho., 76：83-93, 1983,ＧＰＩ；Oster-Granit
e, M.L. & J. Gearhart, Dev. Biol., 85:199-208,198
1.)十分有効なものとはいえなかった。というのは、一
個体内の全ての組織におけるキメリズムを効果的に解析
することができなかったからである。ポリクローナル抗
体を用いて、一個体内の全ての組織におけるキメリズム
を効果的に解析する方法は、日下部ら（J.Cell Biol.,1
07,257-265,1988)によって報告されている。しかし、こ
の方法においてはマウス系統間で相互に免疫して得られ
る抗体産生動物は非常に数が少なく、それぞれの抗体産
生動物の抗血清のマウス系統特異抗原に対する特異性は
個体によって様々であった。また最も重大な欠点は前記
抗血清が微量しか採取できないことであった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特定のマウ
ス系統に特異的に潜在する抗原を認識するモノクローナ
ル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供することを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定のマ
ウス系統に特異的に存在する抗原を認識するモノクロー
ナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを得ることに成功し、本発明を完成させるに至っ
た。すなわち、本発明は、ＤＢＡ／１，ＣＥ／Ｊ，ＳＭ
／Ｊ，ＩＱＩ，ＰＬ／Ｊ，ＳＷＭ／Ｍｓ，ＲＩＩＩＳ／
Ｊ，ＲＦＭ／ＭｓＮｒｓ，およびＣ３Ｈ系統を基盤とす
る近交系やコンジェニックマウス系統のマウスに特異的
に存在する抗原であって、Ｃ３Ｈ系統のマウスのミトコ
ンドリアに存在する分子量66,000及び68,000の該抗原を
認識し、ＩｇＧ１／κサブクラスに属するモノクローナ
ル抗体Ａ、及びモノクローナル抗体Ａを産生するハイブ
リドーマを提供するものである。

【０００５】以下に本発明を詳細に説明する。 （抗原溶液の取得）まず、本発明のモノクローナル抗体
の製造に使用する抗原溶液を以下のようにして得ること
ができる。Ｃ３Ｈ系統マウスの肝臓、筋肉、腎臓、脳、
小腸、大腸、胃、肺、精巣、卵巣、子宮の器官をトリス
−塩酸緩衝液等の緩衝液中にてホモゲナイズし、遠心分
離した後、上清を回収する。上清に硫安を添加し、遠心
分離した後、沈澱を回収する。得られた沈澱をトリス−
塩酸緩衝液等に再溶解した後、不溶成分を遠心分離する
ことにより除いて上清を回収する。上清を分子ふるいカ
ラムクロマトグラフィーで分画する。各分画のグルコー
スフォスフェートイソメラーゼ活性を検索し、活性のあ
る分画を一つにまとめた後、ＰＢＳ、生理食塩水等を外
液として用いて透析して得られたものが抗原溶液であ
る。 （免疫方法）上記の様にして得られる抗原溶液を使用し
て種々のマウス系統、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、
ウシ等を免疫する。

【０００６】また、上記の抗原溶液をアジュバントと混
合して用いることもできる。アジュバントとしては結核
菌を含むフロインド完全アジュバントや菌体を含まない
フロインド完全アジュバント、ミョウバン、百日ぜき死
菌体、大腸菌リポポリサッカライドやニトロセルロース
製やセルロースアセテート製の微粒子を使用することが
できる。

【０００７】アジュバントを使用する場合には、該抗原
溶液と該アジュバンドを約１：１の容量比で使用して、
例えばＰＢＳ、生理食塩水等に懸濁して０．１〜１mg/m
l の抗原懸濁液を調製することができる。上記の抗原懸
濁液を被免疫動物に接種する。例えばマウスを免疫する
場合には上記の抗原溶液と完全フロインドアジュバンド
の懸濁液を初回免疫では３００μｌで、追加免疫では１
００μｌを３回〜５回、１〜２週間隔で、例えば鼡径リ
ンパ節内投与、皮内投与、脾内投与、腹腔内投与、血管
内投与することにより効率良くマウスを免疫することが
できる。

【０００８】免疫動物における抗体産生の有無は、該動
物から血液を採取し、室温にて血液凝固させ、３０００
回転／分の遠心分離により血清を採集し、この血清を用
いて、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ３Ｈ系マウス胎仔から調整し
た初代培養細胞を１％酢酸を含む９５％エタノールで固
定した標本を免疫組織化学的に染色することにより検索
した。 （抗体産生細胞の調製）上記の様にして得られた免疫動
物からリンパ節細胞、脾臓細胞、胸線細胞、リンパ節細
胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を分離することにより
抗体産生細胞を得ることができる。例えば脾臓細胞を抗
体産生細胞として使用する場合には、脾臓を摘出した後
に、例えば、イーグル最小基本培地（以下ＭＥＭとい
う）やＲＰＭＩ１６４０培地（キブコ製）で数回洗浄す
ることにより抗体産生細胞を得ることができる。 （ミエローマ細胞の調製）細胞融合に使用するミエロー
マ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの
種々の動物の細胞株を適用できる。使用する細胞株は、
好ましくは薬剤抵抗性のものであり、未融合の状態では
選択培地で生存できず、融合した状態で生存できる性質
を有するものであることが好ましい。最も普通に用いら
れるのは、８−アザグアニン抵抗性の細胞株であり、こ
れはヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase)を欠損
し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地
（以下ＨＡＴ培地という）に生育できない性質を有す
る。また、いわゆる「非分泌型」の細胞株であることが
好ましい。この様な細胞株の具体例としては、マウスミ
エローマ・ＭＯＰＣ−２１ライン由来のＰ３−Ｘ６３−
Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６・
５・３（Ｘ６３．６・５・３）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１），Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ
２）、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３Ａｇ１・２・
３（Ｙ３・Ａｇ１．２．３）、ヒトミエローマＵ−２６
６−ＡＲ１、ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２などを挙げる
ことができる。 （細胞融合）細胞融合は、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０な
どの動物細胞培養用培地中で１０⁷ 〜１０⁸ 個のミエロ
ーマ細胞と抗体産生細胞を細胞数として混合比１：４〜
１０で混合して行う。細胞融合は３７℃水浴中で２〜３
分間行なわれる。細胞融合促進剤としては平均分子量1,
000 〜6,000 のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をは
じめ、ポリビニールアルコール、ウイルスなどが使用さ
れる。特に、ＰＥＧ（分子量４０００）を用いることが
好ましい。 （選択培地におけるハイブリドーマの選別）細胞融合処
理後の細胞からハイブリドーマを選別するには選択培地
における選択的増殖により行う。例えば、細胞を１５％
ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希
釈し、マイクロタイタープレート上に５×１０⁴ 〜１×
１０ ⁵ 個／ウエル程度となる様にまき、各ウエルにＨＡ
Ｔ培地等の選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換
して培養する。例えば、ミエローマ細胞として８−アザ
グアニン抵抗性株、選択培地としてＨＡＴ培地を用いれ
ば、未融合のミエローマ細胞は培養１０日目ぐらいまで
に死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞もin vitro
では長期間生育できない。従って、培養１０〜１４日目
から生育してくる細胞は全てハイブリドーマである。 （抗マウス系統特異抗体産生ハイブリドーマの検索）抗
マウス系統特異抗体の検索は、各マウス系統由来の胎仔
培養細胞を用いて行い、さらにウエスタンブロット法に
おいてその特異性を確認する。すなわち、各マウス系統
（Ｃ３ＨとＢＡＬＢ／ｃを用いた）の９〜１０日目の胎
仔を燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクスバランス
ソルト緩衝液（ＨＢＳＳ）等の緩衝液で洗浄後、メスま
たはカミソリを用いて細切し、トリプシン溶液中にて消
化し単独の細胞とする。この細胞を仔牛血清含有培地の
添加によって酵素活性を不活化し、滅菌したスライドグ
ラスまたはカバーグラス上で培養する。２４〜４８時間
後、グラスに付着した細胞をグラスごと１％酢酸を含有
する９５％エタノール固定液にて約１〜１．５時間固定
後、無水エタノールで脱水を行い、乾燥させ−２０〜−
８０℃の冷凍庫中で使用まで保存する。使用に際して
は、これらの固定細胞を再度ＰＢＳ中で湿潤状態に戻し
てから非特異的吸着をブロックする為に、５％正常ヤギ
血清と１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ
によって２０〜３０分間の反応を行う。ブロッキング液
を濾紙等で吸い取った後、ハイブリドーマの培養上清を
それぞれのマウス系統由来の細胞と約１〜１．５時間反
応させる。ＰＢＳ、トリス塩酸食塩水（ＴＢＳ）等によ
って洗浄後、蛍光標識抗マウス抗体によって、抗原−抗
体結合物を検出する。抗原と結合力のある抗体を産生し
ている培養上清を添加された細胞中には、以上の操作で
細胞質内に蛍光を発する顆粒が検出できる（陽性の反応
性）。Ｃ３Ｈの細胞にのみ陽性の反応性を示すハイブリ
ドーマ上清を選択する。

【０００９】ウエスタンブロット法による特異性の認識
法は以下に従った。Ｃ３Ｈ系統マウスの肝臓、腎臓等を
摘出し、１ｇの組織重量に対して１０mlのＰＢＳ、ＴＢ
Ｓ等の緩衝液を加えた後、超音波破砕機によって組織を
ホモゲナイズする。ホモゲネートを４０，０００回転／
分の超遠心分離によって、分離し上清の可溶性成分を回
収する。この蛋白液をβ−メルカプトエタノール存在下
で熱変性させた後、常法に従って、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い蛋白成分を分離させる。電
気泳動は１０％均一ポリアクリルアミドゲルや４〜１５
％不均一ポリアクリルゲル等を使用できる。泳動後、ゲ
ルをニトロセルロース製やナイロン製のメンブレンと密
着させ１０〜２０％のメタノールを含むＳＤＳ不含のト
リス−グリシン（０．０２５Ｍ−０．１９５Ｍ）溶液中
で、４℃、１０時間、５０〜７５Ｖの電圧にてゲル内に
分離した蛋白をメンブレン上に平行移動させる。蛋白を
ブロットされたメンブレンを５％正常ヤギ血清と１％Ｂ
ＳＡを含むＴＢＳ（ブロッキング液）に室温で３０分間
浸し、蛋白の非特異吸着部位をブロックする。続けて、
免疫組織化学法によって陽性反応を示したハイブリドー
マ上清と室温で１６時間反応させた後、冷ＴＢＳにて各
１５分間、３回洗浄後、ブロッキング液にて１０μｇ／
mlの濃度に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と３時間室
温で反応した後、同様に洗浄し、更に、ブロッキング液
にて４０μｇ／mlの濃度に希釈したマウスＰＡＰ液にて
２時間反応する。冷ＴＢＳにて十分に洗浄後、発色液に
て陽性蛋白の検出をし、分子量66,000および68,000の蛋
白を認識するハイブリドーマ上清を選択する。 （クローニング）上記の各ウエルの中には２種以上のハ
イブリドーマが生育している可能性があるので、限界希
釈法などによりクローニングを行い、モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを取得する。 （抗体の産生）モノクローナル抗体は、上記のようにし
て得られたハイブリドーマを１０〜１５％ウシ胎児血清
含有ＲＰＭＩ１６４０培地などの動物細胞培養用培地ま
たは無血清培地で培養し、その培養上清液から得ること
ができる。その細胞培養法および条件は通常の動物細胞
培養法のものを適宜に応用すればよい。一方、さらに大
量に抗体を生産する方法として、プリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油
を腹腔内に投与したハイブリドーマの親ミエローマ細胞
の由来動物と同系動物、または未処置のヌードマウスの
腹腔内にハイブリドーマを注入して大量に増殖させる方
法を採用することができる。ハイブリドーマは１０〜１
８日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃
度（約１〜２０mg／ml）の抗体が生産される。精製を必
要とする場合には、腹水を硫安分画後、ＤＥＡＥセルロ
ースイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡやプ
ロテインＧを用いたアフィニテイカラムクロマトグラフ
ィー等によって精製することによって目的を達成するこ
とができる。

【００１０】上記のようにして得られるハイブリドーマ
の例として、１７−６株及び１８−１５株等を挙げるこ
とができ、これらのハイブリドーマからはＣ３Ｈ系統マ
ウス由来の細胞を認識するモノクローナル抗体が得られ
る。上記のハイブリドーマ１７−６株及び１８−１５株
は、平成３年１２月１６日付けで、工業技術院微生物工
業技術研究所に受託番号微工研菌寄第１２６４０号及び
第１２６４１号としてそれぞれ受託された。

【００１１】

〔実施例１〕

ハイブリドーマの取得 １. 抗原の取得 Ｃ３Ｈ系統マウスの肝臓、筋肉および腎臓の１００ｇを
0.１％メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡを含有す
る５０mMのトリエタノールアミン緩衝液（pH8.２）の５
００mlにてホモゲナイズし、40,000回転／分で９０分間
の遠心分離後、上清を回収した。濃縮の為に、上清に硫
安を添加して８０％硫安分画とし、10,000回転／分で３
０分間遠心分離した後、沈澱を回収した。さらに0.３Ｍ
ＫＣｌを含有する他は上記のトリエタノールアミン緩
衝液と同じ組成を有する緩衝液に沈澱を再溶解した後、
不溶成分を10,000回転／分で３０分間遠心して除いて上
清を回収した。上清を分子ふるいカラムクロマトグラフ
ィーであるセファクリルＳ−３００を通すことによって
分画した。各分画のグルコースフォスフェートイソメラ
ーゼ活性を検索し、活性のある分画を一つにまとめた
後、ＰＢＳを外液として透析し、抗原溶液として得た。
この抗原溶液にＰＢＳを添加して、抗原溶液の濃度を１
mg／mlとした。 ２. 免疫 １で得られた抗原溶液（１mg／ml）を完全フロインドア
ジュバントと１：１で混合し、超音波破砕機でエマルジ
ョンを形成させた後、（ＢＡＬＢ／ｃ×ＳＪＬ／Ｊ）Ｆ
１（雌、７〜８週齢）の鼡径リンパ節内および皮内に0.
３mlを初回免疫し、４週間後、上記のエマルジョン0.3m
l を用いて第一回目のブースター注射を行い、その一週
間後に尾静脈から採血した。抗体産生の有無をＣ３Ｈお
よびＢＡＬＢ／ｃ系統マウス胎仔から作製した培養細胞
の免疫組織化学法および免疫ウエスタンブロット法によ
り検索した。

【００１２】抗マウス系統特異抗体の産生の有無は、各
マウス系統由来の胎仔培養細胞を用いて行い、さらにウ
エスタンブロット法においてその特異性を確認した。先
ず、初回の免疫の後、１カ月目に最初の追加免疫を施
し、一週間後、各マウスの尾から採血した。血液は室温
で凝固させた後、３０００回転／分で２０分間遠心後、
血清を回収した。これらの抗血清の検定の為に、各マウ
ス系統（Ｃ３ＨとＢＡＬＢ／ｃを用いた）の１０日目の
胎仔より調整した初代培養細胞を免疫組織化学的に染色
し、抗体産生の有無を調べた。細胞の調整法としては各
マウス系統の胎仔を取り出した後、ＰＢＳで洗浄し、メ
スまたはカミソリを用いて細切し、０．２５％トリプシ
ンに０．２５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液中にて消化し
単独の細胞とし、１０％仔牛血清含有培地の添加によっ
て酵素活性を不活化した後、滅菌したスライドグラスま
たはカバーグラス上で培養した。２４時間野に、グラス
に付着した細胞をグラスごとに氷温の１％酢酸を含む９
５％エタノール固定液にて１時間固定後、無水エタノー
ルで脱水後、再び水まで戻しＰＢＳにて十分洗浄した。
非特異的吸着をブロックする為に、５％正常ヤギ血清と
１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（ブロッキ
ング液）によって３０分間、室温で反応を行ない、ブロ
ッキング液を濾紙等で吸い取った後、各抗血清をブロッ
キング液にて１００倍に希釈したものを、それぞれのマ
ウス系統由来の固定細胞に重層し、室温で１時間反応さ
せた後、冷ＰＢＳによって各１５分間、３回洗浄した。
続けて、ブロッキング液にて１０μｇ／mlの濃度に希釈
した蛍光標識抗マウス抗体（ザイメット社）と室温にて
１時間反応させた後、同様に洗浄し、マウント液として
４０〜５０％グリセリン含有ＰＢＳを用いて封入した
後、蛍光顕微鏡下で抗原−抗体結合物を検出した。免疫
染色反応は全て湿潤箱内で行い操作中は標本を乾燥させ
なかった。抗原と結合力のある抗体を含有してる抗血清
は、以上の操作で細胞質内に陽性の顆粒を検出した。Ｃ
３Ｈの細胞にのみ陽性の反応性を示す抗血清をもつマウ
スを選択した。

【００１３】ウエスタンブロット法による特異性の検定
は以下に従った。Ｃ３Ｈ系統マウスの肝臓、腎臓等を摘
出し、１ｇの組織重量に対して１０mlのＰＢＳ、ＴＢＳ
等を加えて超音波破砕機によって組織をホモゲナイズす
る。ホモゲネートを40,000回転／分にて超遠心分離によ
り分離し上清の可溶性成分を回収する。この蛋白液をβ
−メルカプトエタノール存在下で熱変性させた後、常法
に従ってＳＤＳ−ポリアクリルミアドゲル電気泳動を行
った。ゲルは１０cm×１０cm×１mmのミニゲルで、４％
スタッキングゲル・１０％均一分離用ポリアクリルアミ
ドスラブゲルを使用した。泳動後、ゲルをニトロセルロ
ースメンブレンと密着させ１０％のメタノールを含むＳ
ＤＳ不含のトリスーグリシン（０．０２５Ｍ−０．１９
５Ｍ）溶液中にて、４℃、１０時間、５０Ｖの電圧にて
蛋白をメンブレン上に移動させた。メンブレンを５％正
常ヤギ血清と１％ＢＳＡを含むＴＢＳ（ブロッキング
液）に室温で３０分間浸し、蛋白の非特異吸着部位をブ
ロックした。続けて、免疫組織化学法によって陽性反応
を示した血清をブッキング液にて２００倍に希釈した溶
液と室温で２時間反応した後、冷ＴＢＳにて各１５分
間、３回洗浄後、再び、ブロッキング液にて１０μｇ／
mlの濃度に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と２時間室
温で反応した後、同様に洗浄し、更に、ブロッキング液
て４０μｇ／mlの濃度に希釈したマウスＰＡＰ液にて２
時間反応した。冷ＴＢＳにて十分に洗浄後に、発色液
（ジアミノベンチジン２０mg、塩化コバルト１５mgを５
０mlのＴＢＳ、pH７．６に溶解し、５０μｌの過酸化水
素水を添加した溶液）に浸して、陽性バンドを検出し、
分子量66,000および68,000の蛋白を認識する抗血清を選
択した。

【００１４】抗体価の低いもの（免疫組織化学に用いた
抗血清の希釈度による抗体価１０〜２０倍希釈）や抗体
産生の無かった個体には最大５回まで２週間毎に上記の
エマルジョン0.3ml を鼡径リンパ節内および皮内に注射
して免疫を継続した。最終的に、Ｃ３Ｈ細胞のみを特異
的に識別しＢＡＬＢ／ｃ細胞は認識しない抗体を産生し
ているマウスに上記のエマルジョン0.3ml を注射するこ
とにより最終免疫を施した。 ３. ハイブリドーマの調製 最終免疫から３〜４日後にマウスの脾細胞を取り出し、
血清不含のＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。マウスミ
エローマ（ＮＳ−１）も同様に洗浄し、脾細胞とミエロ
ーマ細胞を５：１で混合して遠心後、細胞ペレットに５
０％ＰＥＧ４０００（シーケム社）・ＲＰＭＩ１６４０
溶液１mlを徐々に添加して３７℃で３分間、細胞融合を
行わせた。更に、ＲＰＭＩ１６４０溶液を徐々に加え、
ＰＥＧ溶液を希釈し最終的に１０mlとした。再び遠心
し、細胞塊を２０％ウシ胎仔血清・ＨＡＴ含有ＲＰＭＩ
１６４０培地にＮＳ−１の細胞数として１×１０⁵ 個／
0.１mlとなるように懸濁させ、予めフィーダー細胞とし
ての腹腔マクロファージ（５×１０³ 個／ウエル）を培
養してある９６ウエルマイクロプレートに0.１mlずつま
いた。フィーダー細胞である腹腔マクロファージは、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスにプリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油0.５ml／匹を
腹腔内に投与してから約一週間経過した後に、腹腔内を
培養液で洗浄し、この培養液を回収することによって得
た。その後、３〜４日毎に培地の半分量を新しいＨＡＴ
培地に交換した。７日目あたりから、いくつかのウエル
でハイブリドーマの生育が認められた。１０〜１４日目
あたりから３日毎に培地の半分量をＨＴ培地（ＨＡＴ培
地からアミノプテリンを除去した培地）に交換し、交換
開始後、１０日目あたりからは正常の２０％ウシ胎児血
清含有ＲＰＭＩ１６４０培地によって培養を継続した。 ４. 抗体産生細胞の検索 ハイブリドーマが生育してきたウエルの上清に目的の抗
体が生産されているかどうかは、Ｃ３ＨとＢＡＬＢ／ｃ
マウス系統由来の胎仔培養細胞を用いた免疫組織化学法
によった。さらにウエスタンブロット法によってその特
異性を確認した。 (1) 免疫組織化学法 両マウス系統の１０日目胎仔を子宮から取り出し、燐酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、メス及びカミソリ
を用いて細切し、0.２５％トリプシンと0.２５％ＥＤＴ
Ａからなる溶液中にて消化し、単独細胞とした。１０％
仔牛血清含有培地の添加によって酵素活性を不活化し、
遠心後、細胞塊を１０％仔牛血清含有培地に再懸濁し、
滅菌したスライドグラスまたはカバーグラス上で培養し
た。２４〜４８時間後、グラスに付着した細胞をグラス
ごと冷９５％エタノールと１％酢酸からなる固定液にて
約１時間固定後、無水エタノール中で脱水を行い、風乾
後、−２０℃の冷凍庫中で使用まで保存した。使用に際
しては、これらの固定細胞をＰＢＳ中で湿潤状態に戻し
た後、抗体の非特異的吸着をブロックする為に、５％正
常ヤギ血清と１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによって２０
〜３０分間の反応を行い、ブロッキング液を濾紙等で吸
い取った後、ハイブリドーマ培養上清の約２０〜５０μ
ｌずつをそれぞれの系統から作製した上記の固定細胞に
重層して約１時間室温で反応させた。ＰＢＳによって十
分洗浄した後、蛍光標識抗マウス抗体（５μｇ／ml）と
約４０分〜１時間室温で反応させた後、４０〜５０％グ
リセリン含有ＰＢＳにて封入し、蛍光顕微鏡下で抗原−
抗体結合物を検出した。抗原と結合力のある抗体を産生
している培養上清を加えた細胞は、以上の操作で細胞質
内に多数の蛍光を発する部位が顆粒状に検出できた（陽
性の反応性）。 (2) 抗体溶液の調製 Ｃ３Ｈの細胞にのみ陽性の反応性を示すハイブリドーマ
上清を選択し、さらに限界希釈法によりクローニングを
行った。単一のクローンが存在していることを顕微鏡下
で確認した後、これらのハイブリドーマの培養上清につ
いて上記の免疫組織化学法の操作を施して検索し、陽性
の反応性を示すハイブリドーマを得た。このようなクロ
ーニングを３回行って単一クローン由来のハイブリドー
マ、１７−６株と１８−１５株の２株を得ることができ
た。更に、これらのハイブリドーマの培養上清を４５％
硫安分画によって濃縮し、ＰＢＳを外液として透析し
て、抗体溶液を得た。 (3) ウエスタンブロット法 Ｃ３Ｈ及びＢＡＬＢ／ｃマウス系統の肝臓抽出物の可溶
性成分を常法によってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動後、ニトロセルロース膜（１０×１０cm四方）上
に泳動分離した蛋白を電気的に移動吸着させた。そし
て、ニトロセルロース膜は非特異的吸着を全てブロック
する為に５mlの５％正常ヤギ血清と１％ＢＳＡを含有す
るＴＢＳ（５０mMトリス−塩酸緩衝生理食塩水、pH7.
６）で２０分間室温で処理した後、続けて(2) で得た抗
体溶液５ml（抗体の最終濃度は、５〜１０μｇ／mlにな
るようにブロッキング液にて濃度調整してある）を添加
して１６時間反応させた。ＴＢＳで十分に洗浄した後、
ブロッキング液で希釈した１０μg/mlのウサギ抗マウス
抗体５ ml を１時間反応させた後、ＴＢＳで十分に洗浄
した後、５mlのマウスＰＡＰ（peroxidase-anti-peroxi
dase）４０μg ／mlと１時間反応させた。ＴＢＳで洗浄
した後、ジアミノベンチジン−コバルト塩酸−過酸化水
素水反応液（ジアミノベンチジン２０mg、コバルト塩酸
１５mg及び過酸化水素水５０μｌを５０mlＴＢＳに溶解
したもの）によって発色反応を行った。１７−６株及び
１８−１５株の産生するモノクローナル抗体は、Ｃ３Ｈ
マウスの肝臓抽出物の66,000及び68,000ダルトンの蛋白
バンドを認識し、他の蛋白や他のマウス系統のいかなる
蛋白も認識しないことがわかった。 〔実施例２〕 モノクローナル抗体の産生 ハイブリドーマ１７−６株、１８−１５株をそれぞれ２
０％仔牛血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で９６ウエルプ
レート、２５cm² フラスコ、７５cm² フラスコとスケー
ルアップしながら培養し、培養上清を集めた。更に高濃
度の抗体を得る為に各ハイブリドーマをそれぞれヌード
マウスの腹腔内に注入し、腹水癌化させた。１０日ほど
後に、腹水を回収し、プロテインＧによるアフィニテイ
カラム法によって抗体を精製調製した。抗体の特異性の
検定は、実施例１と同様のモノクローナル抗体の免疫組
織化学法及びウェスタンブロット法に従って行った。 〔参考例１〕 モノクローナル抗体の性質 １ モノクローナル抗体のサブクラスの決定 ９６穴ソフトマイクロタイタープレートに各モノクロー
ナル抗体をコートし、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキ
ングした後、ＭＯＮＯＡＢＩＤ ＥＩＡ ＫＩＴ（ＺＹ
ＭＥＤ社製）により抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＧ１抗体、抗
ＩｇＧ２ａ抗体、抗ＩｇＧ２ｂ抗体、抗ＩｇＧ３抗体、
抗ＩｇＭ抗体との反応をみて、各モノクローナル抗体の
サブクラスを決定した。またＬ鎖の抗λ抗体、抗κ抗体
との反応を調べてタイプを決定した。その結果、１７−
６株が産生するモノクローナル抗体はＩｇＧ１／κのサ
ブクラスに、１８−１５株が産生するモノクローナル抗
体はＩｇＧ１／κのサブクラスに属することが判明し
た。以下、１７−６株が産生するモノクローナル抗体を
モノクローナル抗体Ａ、１８−１５株が産生するモノク
ローナル抗体をモノクローナル抗体Ｂと記す。 ２ モノクローナル抗体によるマウス系統の検索 以下に述べるマウス系統について、モノクローナル抗体
Ａの系統特異性をウエスタンブロット法により検討し
た。その結果、ＤＢＡ／１Ｊ；ＣＥ／Ｊ；ＳＭ／Ｊ；Ｐ
Ｌ／Ｊ；ＳＷＭ／Ｍｓ；ＩＱＩ；ＲIII Ｓ／Ｊ；ＲＦＭ
／ＭｓＮｒｓと、以下のＣ３Ｈコンジェニック系統：Ｃ
３Ｈ ＮＢ／ｓｎ；Ｃ３Ｈ ＳＷ／ｓｎＪ；Ｃ３ＨＪＫ
／ｓｎ；Ｃ３Ｈ／Ｈｅ；Ｃ３Ｈ ＯＬ／Ｎ；Ｃ３Ｈ Ｈ
ｅ−Ｈａ Pgk-1a ；Ｃ３Ｈ Ｈｅ ｓｎ−Ｔｔｆ／＋ｔ
ｆ；Ｃ３Ｈ−Ｔｔｆ／ｔｏ＋；Ｃ３Ｈ−Ｔｔｆ／ｔｗ１
８ｔｆ；Ｃ３Ｈ−ｅＢ／ＦｅＪ−ｎｒ；Ｃ３Ｈ ＯＨ／
Ｊは全て抗原を発現していた。一方、発現の無い系統と
してはＡ／ｗｙＳｎＪ；Ｂ１０／ＳｎＪ；ＣＢＡ／Ｊ；
ＡＫＲ／Ｊ；ＣＢＡ／ＣａＨＮ；Ｐ／Ｊ；Ｃ５７ＢＲ／
ｃｄＪ；ＰＴ；Ｃ５８／Ｊ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ５７
Ｌ／Ｊ；ＳＷＲ／Ｊ；１２９／Ｊ；ＳＪＬ／Ｊ；ＧＲＳ
／Ａ；ＢＡＬＢ／ｃＵｃｓｄ；ＣＢＡ／ＳｔＭｓ；ＨＲ
Ｓ／Ｊ；１／ＬｎＪ；Ａ２Ｇ／ＯＬＡ／／ＨＳＤ；ＢＡ
ＬＢ／ｃＢｙＪ；ＢＡＬＢ／ｃＪ；Ｃ５７ＢＬ／６Ｂｙ
Ｊ；ＭＡ／ＭｙＪ；ＷＢ／ＲｅＪ−Ｗ；ＢＡＬＢ／ｃＡ
ｎＮ；ＤＢＡ／２Ｊ；ＮＺＢ／Ｂ１ＮＪ；ＤＭ／Ｓｈｉ
などがあった。

【００１５】モノクローナル抗体Ｂの系統特異性につい
ても、同様の方法で検討したところ、同様の結果が得ら
れた。 ３ モノクローナル抗体の認識する抗原 上記の陽性マウス系統における抗原をそれぞれウエスタ
ンブロット法にて解析したところ、モノクローナル抗体
Ａ及びモノクローナル抗体Ｂが認識する抗原は分子量約
68,000及び66,000であることが判明した。更に、遠心分
離法によって細胞内成分を分画し、各分画をウエスタン
ブロット法によって検索した結果、上記抗体が認識する
抗原はミトコンドリアに局在することがわかった。 ４ モノクローナル抗体の認識する抗原の局在 ミトコンドリアに局在するコンプレックスIIに対するウ
サギ抗血清とモノクローナル抗体Ａとを用いた免疫２重
染色を施した細胞を鏡検したところ、両抗体の認識部位
が完全に一致した。従って、モノクローナル抗体Ａは、
細胞質内のミトコンドリアに局在する抗原を認識してい
ることが判明した。

【００１６】モノクローナル抗体Ａをモノクローナル抗
体Ｂに代えて上記の操作を繰り返したところ、同様の結
果が得られた。 ５ 抗体の認識するマウス抗原の遺伝的解析 モノクローナル抗体Ａが認識するマウス抗原の検定の為
にＣ３ＨとＢＡＬＢ／ｃ近交系マウス間で戻し交配実験
を行い、双方共に表１に示すような結果を得た。

【００１７】 表１：戻し交配による系統特異抗体の遺伝解析 ─────────────────────────────────── 雄 雌 妊娠 仔数 結果 期待数 カイ２乗値 母体数 ＋ − 受／否 ─────────────────────────────────── BALB/c BAC3 5 53 22 31 (1：1) 1.53 受 BALB/c C3BA 6 63 37 26 (1：1) 1.92 受 BAC3 BALB/c 7 53 22 31 (1：1) 1.53 受 C3BA BALB/c 7 43 17 26 (1：1) 1.88 受 ─────────────────────────────────── （Ｆ１ × Ｆ１） ─────────────────────────────────── BAC3 BAC3 7 58 42 16 (3：1) 0.21 受 C3BA C3BA 4 27 20 7 (3：1) 0.0124 受 ─────────────────────────────────── Note：カイ２乗値（受／否）、自由度＝１、有意水準＝
０．０５、カイ２乗値が３．８４以上であれば拒否され
る。 BAC3：( BALB/c♀ X C3H/HeN♂)F1, C3BA：(C3H/HeN♀
X BALB/ c♂)F1 これより、モノクローナル抗体Ａが認識する抗原をコー
ドしている遺伝子は核のＤＮＡに存在し、メンデルの法
則に従ってコントロールされており、また単一遺伝子に
よるものであることが判明した。 〔実施例３〕 キメラマウス組織のキメリズムの免疫組織学的解析法 ２種の近交系マウス間で８細胞期胚を集合させて発生さ
せたキメラマウスとは２種類以上の遺伝的に独立した細
胞集団より構成される動物である。このキメラ組織の構
成細胞要素がどちらの系統に由来しているかを組織レベ
ルで解析することは組織再生系や細胞系譜の研究に有用
な手段となる。該抗体の認識する抗原は通常の培養細胞
では９５％エタノールと１％酢酸から成る固定液によっ
て抗原性を維持することができる。しかし、組織ではこ
の様な緩慢な固定液では固定が不安定で組織の構造も安
定していない、その為、上記の固定液を氷温にし心臓か
ら灌流固定するか、あるいは細切組織をマイクロウエー
ブプロセッシングオープン（バイオラッド社）によっ
て、0.１Ｍナトリウム燐酸緩衝液中で６０％パワー、４
０℃、２０分間の条件下でマイクロウエーブ照射の後、
９５％エタノールと１％酢酸からなる固定液にて後固定
（氷温で約５時間）し、無水アルコール脱水後、ポリエ
ステルワックスに包埋し、４μｍの切片として固定し
た。これらの固定法によって組織構造の保持および抗原
性維持の双方を良好に達成することができた。切片は無
水エタノールにて脱ワックス後、ＰＢＳで洗浄し、内因
性パーオキシダーゼ活性を不活性化する為に、0.６％過
酸化水素水と0.２％NaN₃からなる溶液によって１時間処
理し、２０mMトリス−塩酸生理食塩水（pH7.６，ＴＢ
Ｓ）で十分洗浄後、アビジン−ビオチンブロッキングキ
ット（ベクター社）溶液を0.５％フィシュゼラチン／Ｔ
ＢＳで２倍に希釈したもので２０分間反応させ内因性ビ
オチンおよび非特異吸着をブロッキングした。一次抗体
としてビオチン化したモノクローナル抗体Ａを0.５％フ
ィシュゼラチン／ＴＢＳ溶液で希釈（１０μｇ／ml）し
たもので一昼夜、室温で反応させた。尚、モノクローナ
ル抗体のビオチン化は、以下のようにして行った。

【００１８】抗体溶液を０．１ＭNaHCO₃溶液を外液とし
て透析し、終了後同液にて１mg／mlとなる様濃度を調整
した。ＮＳＨ−ビチオン（ピアス社）を１mg／mlになる
様ＤＭＳＯ（シグマ社）に溶解した後、抗体液１mlに対
してビオチン液６０μｌの割合で混合し、室温で振盪し
ながら４時間反応させた。その後、０．１％ソデイウム
アザイドを含むＰＢＳを外液とに透析した。

【００１９】ビオチン化したモノクローナル抗体Ａを反
応させた切片をＰＢＳで洗浄後、二次抗体としアビジン
−パーオキシダーゼ（ＺＹＭＥＤ社）を0.５％フィシュ
ゼラチン／ＴＢＳ（pH8.０）で１００倍に希釈したもの
で約２０分間反応させた。再度ＴＢＳにて洗浄後、４０
mg ジアミノべンチヂン（ＤＡＢ）と４０μｌ過酸化水
素水を含有する水溶液１５０mlを添加し、５０mMトリス
−塩酸緩衝液を用いてpHを7.６に調整し、発色反応を約
１〜２分間行った。蒸留水にて洗浄後、切片を0.１％塩
化金水溶液に５分間反応させ、蒸留水にて水洗後、2.５
％硫化ナトリウム水溶液（pH7.４）に５分間浸し、再度
蒸留水で水洗した。銀染色液（１５０mlの組成：H₂O
中、Na₂CO₃：3.11g, NH₄NO₃ ：0.15g, AgNO₃：0.15g,シ
リコタングステン酸：0.75g 及び35％ホルマリン：0.27
4 ml）に１分間浸漬して、撹拌した。発色後すばやく１
％酢酸水溶液に移し、銀反応を停止した。１％チオ硫酸
ナトリウム水溶液 mlにて定着後、蒸留水で水洗、常
法に従って、ヘマトキシリン−エオシン染色を施し、カ
バーグラスで封入した。検鏡の結果、キメラ組織は該抗
体で陽性に染色された細胞と陰性の細胞によって構成さ
れていた。胎生初期胚のキメリズムについてもマイクロ
ウエーブ固定によって効果的にキメリズムを解析でき
た。成獣キメラマウス組織においてはそのキメリズムに
より組織再生系を以下の４群に分類できた。 １：解剖学的な組織単位がどちらか一方の系統由来細胞
で構成される組織（小腸陰窩）。 ２：解剖学的に組織単位が双方の系統由来の細胞によっ
て構成される組織（外分泌腺腺房）。 ３：解剖学的に組織単位が明瞭ではないがキメリズムに
よってその増殖単位が明瞭となった組織（皮膚）。 ４：解剖学的に組織単位をもたずキメリズムによっても
その組織単位を明瞭に観察できない組織（結合組織、筋
組織）。

【００２０】モノクローナル抗体Ａをモノクローナル抗
体Ｂに代えて以上の操作を繰り返したところ、同様の結
果が得られた。

【００２１】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、細胞起
源の同定に有用である。また、本発明のモノクローナル
抗体は、一個体内の全ての組織におけるキメリズムを効
果的に解析できる。さらに、本発明のモノクローナル抗
体を用いて細胞起源を同定することにより、発生・分化
の機構、癌発生機構や遺伝子発現の機構が解明できる。
これにより、本発明のモノクローナル抗体は不妊や癌の
予防、診断等に役立つことが期待できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 8310−2Ｊ Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＢＡ／１，ＣＥ／Ｊ，ＳＭ／Ｊ，ＩＱ
   Ｉ，ＰＬ／Ｊ，ＳＷＭ／Ｍｓ，ＲＩＩＩＳ／Ｊ，ＲＦＭ
   ／ＭｓＮｒｓ，およびＣ３Ｈ系統を基盤とする近交系や
   コンジェニックマウス系統のマウスに特異的に存在する
   抗原であって、Ｃ３Ｈ系統マウスのミトコンドリアに存
   在する分子量66,000及び68,000の該抗原を認識し、Ｉｇ
   Ｇ１／κサブクラスに属するモノクローナル抗体Ａ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体Ａを
   産生するハイブリドーマ。