JPH05184356A - 無脊椎動物神経組織の培地および培養方法 - Google Patents
無脊椎動物神経組織の培地および培養方法Info
- Publication number
- JPH05184356A JPH05184356A JP4006346A JP634692A JPH05184356A JP H05184356 A JPH05184356 A JP H05184356A JP 4006346 A JP4006346 A JP 4006346A JP 634692 A JP634692 A JP 634692A JP H05184356 A JPH05184356 A JP H05184356A
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- collagen
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 無脊椎動物神経組織を３次元培養することの
できる培地および方法を提供し、併せて異種細胞もしく
は組織を隣接して培養するための方法を提供することを
目的とする。 【構成】 Ｌ−１５培地、非働化血清、グルコースおよ
び抗生物質を含むコラーゲンゲルからなる培地を用い
る。また、それぞれ異種の生体細胞もしくは組織を含む
この培地の２種以上を同一容器中に併置し、培養する。
できる培地および方法を提供し、併せて異種細胞もしく
は組織を隣接して培養するための方法を提供することを
目的とする。 【構成】 Ｌ−１５培地、非働化血清、グルコースおよ
び抗生物質を含むコラーゲンゲルからなる培地を用い
る。また、それぞれ異種の生体細胞もしくは組織を含む
この培地の２種以上を同一容器中に併置し、培養する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、無脊椎動物神経組織の
培地および培養方法に関する。無脊椎動物の神経回路に
ついて研究することは、将来のニューロコンピュータ開
発のための基礎研究として重要である。
培地および培養方法に関する。無脊椎動物の神経回路に
ついて研究することは、将来のニューロコンピュータ開
発のための基礎研究として重要である。
【０００２】
【従来の技術】神経回路について定量的な研究をするた
めには、神経細胞を生体中から取り出し、ガラス容器中
で培養する必要がある。しかしながら、無脊椎動物の神
経細胞を培養する方法については、一部の昆虫とヒル、
ナメクジ、アメフラシなどについて知られている程度で
ある。また、培養条件が判っている生物でも、その培養
液に複雑な生体抽出物、例えば脳抽出物、を添加する必
要がある。この様な抽出物は入手するのが困難であり、
各々の研究者が個別に抽出し、実験に用いているのが現
状である。さらに、無脊椎動物神経組織を３次元培養す
る方法に関しては、全く知られていない。
めには、神経細胞を生体中から取り出し、ガラス容器中
で培養する必要がある。しかしながら、無脊椎動物の神
経細胞を培養する方法については、一部の昆虫とヒル、
ナメクジ、アメフラシなどについて知られている程度で
ある。また、培養条件が判っている生物でも、その培養
液に複雑な生体抽出物、例えば脳抽出物、を添加する必
要がある。この様な抽出物は入手するのが困難であり、
各々の研究者が個別に抽出し、実験に用いているのが現
状である。さらに、無脊椎動物神経組織を３次元培養す
る方法に関しては、全く知られていない。
【０００３】また、神経回路研究の観点からは、異種神
経細胞間や神経および標的組織間で神経回路を形成する
ことが必須要件となる。そのような場合には、隣接させ
て異種細胞もしくは組織の培養を行うことが必要であ
る。異種細胞もしくは組織を隣接して培養するために
は、従来は培養皿の上で手作業で行うのが通常であり、
極めて煩雑であった。
経細胞間や神経および標的組織間で神経回路を形成する
ことが必須要件となる。そのような場合には、隣接させ
て異種細胞もしくは組織の培養を行うことが必要であ
る。異種細胞もしくは組織を隣接して培養するために
は、従来は培養皿の上で手作業で行うのが通常であり、
極めて煩雑であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の如き
従来技術の問題点に鑑み、無脊椎動物神経組織を３次元
培養することのできる培地および方法を提供し、併せて
異種細胞もしくは組織を隣接して培養するための方法を
提供することを目的とする。
従来技術の問題点に鑑み、無脊椎動物神経組織を３次元
培養することのできる培地および方法を提供し、併せて
異種細胞もしくは組織を隣接して培養するための方法を
提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記課
題を解決するため、Ｌ−１５培地、非働化血清、グルコ
ースおよび抗生物質を含むコラーゲンゲルからなる、無
脊椎動物神経節を培養するための培地が提供される。
題を解決するため、Ｌ−１５培地、非働化血清、グルコ
ースおよび抗生物質を含むコラーゲンゲルからなる、無
脊椎動物神経節を培養するための培地が提供される。
【０００６】本発明によれば、また、そのような培地を
用いることを特徴とする、無脊椎動物神経節の培養方法
が提供される。
用いることを特徴とする、無脊椎動物神経節の培養方法
が提供される。
【０００７】本発明によれば、さらに、Ｌ−１５培地、
非働化血清、グルコースおよび抗生物質を含むコラーゲ
ンゲルからなり、それぞれ異種の生体細胞もしくは組織
を含む培地の２種以上を同一容器中に併置し、培養する
ことを特徴とする培養方法が提供される。
非働化血清、グルコースおよび抗生物質を含むコラーゲ
ンゲルからなり、それぞれ異種の生体細胞もしくは組織
を含む培地の２種以上を同一容器中に併置し、培養する
ことを特徴とする培養方法が提供される。
【０００８】上記培地に含まれる非働化血清の量は、培
地重量に対して１０〜２０重量％であるのが好ましい。
また、この培地は、グルコースを１０〜２０mg/ml の量
で含むのが好ましく、コラーゲンの含有量は 0.1〜 0.3
重量％であるのがよい。
地重量に対して１０〜２０重量％であるのが好ましい。
また、この培地は、グルコースを１０〜２０mg/ml の量
で含むのが好ましく、コラーゲンの含有量は 0.1〜 0.3
重量％であるのがよい。
【０００９】
【作用】本発明の培地および方法によれば、簡単な培養
液を浸透させたコラーゲンゲルを充填した培養容器中で
無脊椎動物の神経組織を３次元培養することができ、従
来培養が困難であると考えられていたミミズ腹髄神経節
を約１カ月間培養することが可能である。また、この方
法を利用すると、効率よく異種細胞もしくは組織を隣接
させて培養することも可能であり、神経回路研究に資す
るところが大である。
液を浸透させたコラーゲンゲルを充填した培養容器中で
無脊椎動物の神経組織を３次元培養することができ、従
来培養が困難であると考えられていたミミズ腹髄神経節
を約１カ月間培養することが可能である。また、この方
法を利用すると、効率よく異種細胞もしくは組織を隣接
させて培養することも可能であり、神経回路研究に資す
るところが大である。
【００１０】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに説明
する。
する。
【００１１】実施例１（培地の調製） (1) 用いる試薬 以下に示す溶液を事前に準備する。 Ａ． 0.5％酸性コラーゲン溶液 Ｂ．２倍濃縮のＬ−１５培養液（シグマ社） Ｃ．再構成緩衝液（0.05N NaOH 100mlに重炭酸ナトリウ
ム 2.2ｇおよびHEPES4.77ｇを添加したもの） Ｄ．非働化血清（馬、子牛、牛胎児、ユナイテッドバイ
オテクノロジ社） Ｅ．ミミズ腹髄神経節培養液 Ｌ−１５培地（シグマ社製） ８５％v/v 非働化血清（ユナイテッドバイオテクノロジ社） １５％v/v ゲンタマイシン（シグマ社） ２０mg/ml ファギゾーン（シグマ社） ５μｍ/ml グルコース（和光純薬、特級） １５mg/ml （1N NaOH によりpH 7.4に調整)
ム 2.2ｇおよびHEPES4.77ｇを添加したもの） Ｄ．非働化血清（馬、子牛、牛胎児、ユナイテッドバイ
オテクノロジ社） Ｅ．ミミズ腹髄神経節培養液 Ｌ−１５培地（シグマ社製） ８５％v/v 非働化血清（ユナイテッドバイオテクノロジ社） １５％v/v ゲンタマイシン（シグマ社） ２０mg/ml ファギゾーン（シグマ社） ５μｍ/ml グルコース（和光純薬、特級） １５mg/ml （1N NaOH によりpH 7.4に調整)
【００１２】(2) 調製手順 １．４℃に氷冷したＡ（８ml) 、Ｂ（７ml) 、Ｃ（２m
l) およびＤ（３ml) を手早く混合する。 ２．混合液を滅菌処理したシャーレ（例えば、ファルコ
ン社3802) に５mlづつ分注する。 ３．培養したい神経組織を加える。 ４．３７℃で４０分間加温する（コラーゲンがゲル化す
る）。 ５．Ｅ液を５mlづつ分注する。 (3) 上記を室温にて培養する。
l) およびＤ（３ml) を手早く混合する。 ２．混合液を滅菌処理したシャーレ（例えば、ファルコ
ン社3802) に５mlづつ分注する。 ３．培養したい神経組織を加える。 ４．３７℃で４０分間加温する（コラーゲンがゲル化す
る）。 ５．Ｅ液を５mlづつ分注する。 (3) 上記を室温にて培養する。
【００１３】実施例２（無脊椎動物神経組織の培養） 陸生無脊椎動物の神経組織培養を実施例１の手順に従っ
て行った一具体例を以下に示す。
て行った一具体例を以下に示す。
【００１４】試料には、アカミミズ（延岡旭繊維
（株））の腹髄神経節を用いた。アカミミズを抗生物質
を添加したミミズ用生理食塩水中で解剖し、腹髄を摘出
した。摘出した神経節周辺部の結合組織をピンセットで
丁寧に除き、一体節毎に小型ハサミにより切断する。こ
の切断した神経節を前記培地にコラーゲンゲル化過程で
加え、ゲル化後室温で培養した。
（株））の腹髄神経節を用いた。アカミミズを抗生物質
を添加したミミズ用生理食塩水中で解剖し、腹髄を摘出
した。摘出した神経節周辺部の結合組織をピンセットで
丁寧に除き、一体節毎に小型ハサミにより切断する。こ
の切断した神経節を前記培地にコラーゲンゲル化過程で
加え、ゲル化後室温で培養した。
【００１５】図１に培養開始後１３日目のミミズ腹髄神
経節の３次元培養の様子を示す。図１は、培養されたア
カミミズの腹髄神経節の顕微鏡写真をトレースした図で
あり、斜線部分が培養開始時の神経節であり、その周囲
に細胞が展開している様子を輪郭線で示している。コラ
ーゲンゲル中に包理した９個の神経節中８個で神経節か
らの活発な細胞遊離が観察できた。また、神経節から長
い線維が遊走してくる状態も観察できた。この状態で培
地を交換することなく、１カ月間培養することができ
た。ミミズ神経節を３次元培養した例はかつてなく、こ
の例が最初であると認められる。また、コラーゲンゲル
に添加する非働化血清は、馬、子牛、牛胎児が適当であ
り、その添加濃度は１０〜２０％である。コラーゲンゲ
ルに添加するグルコース濃度に関しても鋭意検討した結
果、１０〜２０mg/ml が適当であることが判った。コラ
ーゲン濃度は 0.2％であったが、 0.1〜 0.2％の濃度範
囲で良好な３次元培養を行うことができることが認めら
れた。
経節の３次元培養の様子を示す。図１は、培養されたア
カミミズの腹髄神経節の顕微鏡写真をトレースした図で
あり、斜線部分が培養開始時の神経節であり、その周囲
に細胞が展開している様子を輪郭線で示している。コラ
ーゲンゲル中に包理した９個の神経節中８個で神経節か
らの活発な細胞遊離が観察できた。また、神経節から長
い線維が遊走してくる状態も観察できた。この状態で培
地を交換することなく、１カ月間培養することができ
た。ミミズ神経節を３次元培養した例はかつてなく、こ
の例が最初であると認められる。また、コラーゲンゲル
に添加する非働化血清は、馬、子牛、牛胎児が適当であ
り、その添加濃度は１０〜２０％である。コラーゲンゲ
ルに添加するグルコース濃度に関しても鋭意検討した結
果、１０〜２０mg/ml が適当であることが判った。コラ
ーゲン濃度は 0.2％であったが、 0.1〜 0.2％の濃度範
囲で良好な３次元培養を行うことができることが認めら
れた。
【００１６】実施例３（異種組織の３次元培養） この例は、異種組織を併置して３次元培養する方法を説
明するためのものである。
明するためのものである。
【００１７】図２に異種組織を併置培養する装置の外観
を示す。図２イは装置の平面図であり、図２ロはその立
面図である。この装置は４０×４０mmのカバーグラス４
（マツナミガラス製、特注品）２枚とテフロンスペーサ
５よりなる。まず、コラーゲン溶液（例えば、実施例１
の溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの混合液にミミズ腹髄神経節
を加えたもの）を静かにパスツールピペット等の分注器
により任意の量分注し、立てた状態で３７℃で３０分間
処理して、コラーゲンゲル１を形成する。次に、コラー
ゲン溶液（例えば、実施例１の溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ
の混合液にミミズ筋肉組織を加えたもの）を静かに重層
し、そのままの状態で再び３７℃で３０分間加温処理し
て、コラーゲンゲル２を形成する。これにより、異種組
織を含むコラーゲンゲルを併置できる。ゲル化が終了し
た段階で、培養液３（例えば、実施例１のＥ液）を注入
し、スペーサに蓋６をする。この蓋としては通気性の良
いもの（例えば、青梅綿や連続気泡シリコンゴムの栓な
どの滅菌ができるもの）を選択した。この併置培養装置
は、横置きすることにより、直ちに光学顕微鏡により検
鏡することができ、またオートクレーブにて滅菌するこ
とができる。
を示す。図２イは装置の平面図であり、図２ロはその立
面図である。この装置は４０×４０mmのカバーグラス４
（マツナミガラス製、特注品）２枚とテフロンスペーサ
５よりなる。まず、コラーゲン溶液（例えば、実施例１
の溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの混合液にミミズ腹髄神経節
を加えたもの）を静かにパスツールピペット等の分注器
により任意の量分注し、立てた状態で３７℃で３０分間
処理して、コラーゲンゲル１を形成する。次に、コラー
ゲン溶液（例えば、実施例１の溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ
の混合液にミミズ筋肉組織を加えたもの）を静かに重層
し、そのままの状態で再び３７℃で３０分間加温処理し
て、コラーゲンゲル２を形成する。これにより、異種組
織を含むコラーゲンゲルを併置できる。ゲル化が終了し
た段階で、培養液３（例えば、実施例１のＥ液）を注入
し、スペーサに蓋６をする。この蓋としては通気性の良
いもの（例えば、青梅綿や連続気泡シリコンゴムの栓な
どの滅菌ができるもの）を選択した。この併置培養装置
は、横置きすることにより、直ちに光学顕微鏡により検
鏡することができ、またオートクレーブにて滅菌するこ
とができる。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、従来困難であった無脊椎
動物神経組織の３次元培養が、入手困難な生体抽出物を
添加することなく行うことができる。併せて、異種細胞
もしくは組織を併置して３次元培養することができる。
動物神経組織の３次元培養が、入手困難な生体抽出物を
添加することなく行うことができる。併せて、異種細胞
もしくは組織を併置して３次元培養することができる。
【図１】本発明の実施例で培養したアカミミズの腹髄神
経節の顕微鏡写真をトレースした図である。
経節の顕微鏡写真をトレースした図である。
【図２】本発明の実施例で用いた、異種生体組織の３次
元併置培養を行うための装置を示す図である。
元併置培養を行うための装置を示す図である。
１…コラーゲンゲル ２…コラーゲンゲル ３…培養液 ４…カバーグラス ５…スペーサ ６…蓋
Claims (3)
- 【請求項１】 Ｌ−１５培地、非働化血清、グルコース
および抗生物質を含むコラーゲンゲルからなる、無脊椎
動物神経節を培養するための培地。 - 【請求項２】 請求項１に記載の培地を用いることを特
徴とする、無脊椎動物神経節の培養方法。 - 【請求項３】 Ｌ−１５培地、非働化血清、グルコース
および抗生物質を含むコラーゲンゲルからなり、それぞ
れ異種の生体細胞もしくは組織を含む培地の２種以上を
同一容器中に併置し、培養することを特徴とする培養方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4006346A JPH05184356A (ja) | 1992-01-17 | 1992-01-17 | 無脊椎動物神経組織の培地および培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4006346A JPH05184356A (ja) | 1992-01-17 | 1992-01-17 | 無脊椎動物神経組織の培地および培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184356A true JPH05184356A (ja) | 1993-07-27 |
Family
ID=11635819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4006346A Withdrawn JPH05184356A (ja) | 1992-01-17 | 1992-01-17 | 無脊椎動物神経組織の培地および培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05184356A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100651170B1 (ko) * | 2000-07-28 | 2006-11-30 | 아이진 주식회사 | 메틸사이오아데노신을 이용한 순수한 신경세포배양방법 |
-
1992
- 1992-01-17 JP JP4006346A patent/JPH05184356A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100651170B1 (ko) * | 2000-07-28 | 2006-11-30 | 아이진 주식회사 | 메틸사이오아데노신을 이용한 순수한 신경세포배양방법 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990408 |