JPH0499718A - 表面修飾可能なリポソームおよび表面修飾されたリポソームの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、薬物運搬体、免疫分析試薬などに有用な表面
修飾可能なリポソームと表面修飾されたリポソームの製
造方法に関する。

（従来の技術） 近年、医学・薬学分野において正常な細胞や組織には影
響を与えず、患部となっている細胞や組織に選択的に薬
物を運搬し、薬効を発現させる手法（ドラッグデリバリ
−システム、ＤＤＳ）が検討されている。

これを達成する方法として、リポソームに親水性あるい
は脂溶性の薬効を担持させ、表面にタンパク質、抗原、
抗体、Ｗ（多糖を含む）等を固定化した表面修飾リポソ
ームが検討されている。

〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ−Ｒｅｓ、）第
４３巻、５３２８頁、１９８３年、同誌、±７，４４７
１　　（１９８７）、リポソーム・リサーチ（Ｌｉｐｏ
ｓｏｍｅ　Ｒｅｓ、）　、第１巻、１５真（１９８８−
８９年）〕 一方、リポソームは不安定であり、特に生体内投与にお
ける綱内皮系に存在する貧食細胞による貧食あるいは、
血中からの消失が非常に速いことが問題である。これら
の解決法として、特開昭６３−３１３７２４号には多Ｉ
！誘導体によってリポソーム表面を修飾する方法が開示
されている。

さらに臨床検査や免疫学の分野において、生理活性物質
、免疫活性物質（抗体、抗原を含む）等をリポソーム表
面に固定化した表面修飾リポソームを用いる種々の分析
法が開示されている［特開昭６１−２５０５５８号、特
開昭６１−６６９６３号、特開昭６０−１３８４６６号
］。

リポソームの表面を修飾する方法としては、代表的な方
法として、Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニ
ルホスファチジルエターノルアミン（ＤＴＰ−ＰＥ）に
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（ＳＰＤＰ）で活性化したたんばく質等を
結合する方法〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、第２
８８巻、６０２頁、１９８０年〕や、架橋剤を用いる方
法（架橋剤としてはＮ−スクシンイミジル−４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−ス
クシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセ
テート（ＳＭＰＡ）　、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ
−マレイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ）等
が知られている）（ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）、第２５７巻、２８６頁、１９８２年等〕
が挙げられる。

リポソーム表面への基質の固定化の他の方法としては、
リポソーム調製時に予め糖脂質糟を混合しておき、その
糖を酸化することによりアルデヒド基を生成させこれと
たんばく質等のアミノ基とを反応させシッフ塩基を形成
させる方法〔ハイオヒミカ・バイオフイジカ・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｉｍ。

８ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ、）、第６４０巻、６５頁、
１９８１年等〕やたんばく賞等に疎水性基を導入して、
別途調製したリポソームに組み込む方法〔バイオヒミカ
・アト・バイオフイジカ・アクタ　（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　、第８１２巻、１１
６頁、１９８５年等〕がある。

しかしながら、これらの方法は階段数が多く、複雑であ
り、容易にリポソーム表面に基質を固定化し修飾する方
法の確立が本分野において必要性の高い課題となってい
る。

一方、有機合成化学の分野において３−アシルチアゾリ
ジン−２−チオンを用いた、カルボン酸誘導体を還元し
て収率よくアルデヒドを製造する方法〔特開昭５４−７
９２７５、ケミストリー・レターズ（Ｃｈｅｗ、　Ｌｅ
ｔｔ、）、１４４３頁、１９７７年〕や、選択的にアミ
ドを製造する方法〔テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、）、第２１巻、８４１頁
、１９８０年、ペテロサイクルズ（Ｈｅｔｅｒｏ　ｃｙ
ｃｌｅｓ）　、第７７巻、５３７頁、１９８２年）およ
びチオエステルを製造する方法（ジャーナル・オブ・ケ
ミカル・リサーチ（Ｊ、ＣｈｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ（
Ｓ）　、１９８３年、２０頁〕が開示されている。しか
し３−アシルチアプリジン−２−千オンがリポソームの
表面修飾試薬として用いられた例はない。

また、高分子化学の分野において、２　（３Ｈ）−ベン
ゾオキサシロン、２　（３Ｈ）−ベンゾチアゾロンを脱
離基にもち、化学選択的にアミドを形成する活性化削〔
有機合成化学協会誌、第４８巻、１４４頁、１９８９年
、ブレティン・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアティ・ジ
十ノマン　Ｂｕｌｌ、　Ｃｈｅｗ。

Ｓｏｃ、　Ｊｐｎ、、　　第５８巻、３２９１頁、１９
８５年、マクロモレキュルズ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ
ｌｅｓ、第１８巻、２３５３頁、１９８５年〕が開示さ
れている。

しかし、これらの離脱基を有したアミド化合物がリポソ
ームの表面修飾試薬として用いられた例はない。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の目的は従来法の問題点、特に離脱基へ
の親水性付与の問題を解決し、リポソーム表面にペプチ
ド（アミド酸を含む）、たんぽ（質（抗原、抗体を含む
）、糖（多糖を含む）等の種々の基質を固定化した表面
修飾リポソームを容易に製造する方法を提供すること、
および種々の基質を固定化した表面修飾リポソームを提
供することである。

（課題を解決するための手段） 本発明の目的は、 （１）下記、一般式ＣＩ）で示される化合物とリポソー
ム形成可能な脂質から構成されることを特徴とする表面
修飾可能なリポソーム。

（式Ｉにおいて、Ｒ１は疎水性基を表わす。

Ｒｔ、Ｒｚは水素を含む有機基を示す、Ｒ，、Ｒ。

は互いに連結して環又は二重結合を形成してもよい、Ｙ
は酸素原子またはイオウ原子を示す、Ｚは親水性基を表
わす、Ｗは連結基を表わす、ｎはθ〜１の整数である。

） （２）上記の表面修飾可能なリポソームとアミノ基及び
／又はチオール基を有する基質を混合することを特徴と
する表面修飾されたリポソームの製造方法； （３）上記の一般式Ｉで表わされる化合物の少くとも１
種とアミノ基及び／又はチオール基を有する基質を結合
させて得られた化合物とリポソーム形成可能な脂質を混
合することを特徴とする表面修飾されたリポソームの製
造方法； によって達成された。

本発明は言いかえれば、リポソーム二分子膜中に一般式
（１）で示される親水性離脱基を有する長鎖活性アミド
を埋め込んだリポソームを用いて、アミノ基あるいはチ
オール基を有した基質をリポソーム表面に固定化するこ
と、および一般式（１）に示される親水性離脱基を有す
る長鎖活性アミドとアミノ基あるいはチオール基を有し
た基質を反応さセ長鎖基を存した基質誘導体とし、これ
をリポソーム形成脂質と混合してリポソームを形成する
ことを骨子とするものである。

本発明の表面修飾リポソームの形成法について説明する
。

第一の方法はリポソーム構成素材に一般式（１）で示さ
れる親水性離脱基を有する長鎖活性アミドを混合してリ
ポソームを調製する０本発明第一の方法に係るリポソー
ムの構成素材としてはホスファチジルエタノールアミン
、ホスファチジセリンを除く既存のリポソームの製造法
において用いられる脂質が挙げられる。（例えば、卵黄
レシチンや大豆レシチン等の天然レシチン、ジパルミト
イルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、シミリストイ
ルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）　、ジステアロイ
ルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホス
ファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスフ
ァチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、シミリストイルホ
スファチジン酸（ＤＭＰＡ）等が挙げられる。） 尚、用いられる脂質は一種類でも二種類以上でもよい、
また、コレステロール類等との混合系でもよい、また、
脂質、コレステロール類以外のものを混合してもよい。

本発明第一の方法において、一般式（Ｎで示される親水
性離脱基を有する長鎖活性アミドの全リポソール構成素
材に対するモル比は、リポソームが構成可能な範囲なら
ば自由に選択できるが好ましくは５０％以下、さらに好
ましくは３５％以下がよい。

本発明第一の方法に係るリポソール調製法としてはポル
チックスイング法、超音波法、界面活性荊餘去法、逆相
革発法（ＲＥＶ法）、エタノール注入法、エーテル注入
法、プレーベシクル法（Ｐｒｅ−Ｖｅｓｉｃｌｅ法）、
フレンチプレス抽出法、エクストルーフ５ン（Ｅｘｔｒ
ｕｓｉｏｎ法）、アニーリング法（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
法）、凍結融解法、Ｗ１０／Ｗエマルジ町ン法、さらに
５ｔａｂｌｅ　ＰｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒＲｅ５ｉｃ
ｌｅ法（ＳＰＬＶ法〔バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍ　ｉｓ　ｔｒｙ）、第２５巻、２８３３頁、１９
８５年〕、等の通常の方法がすべて挙げられる。

これらのリポソーム調製法に関しては、Ｐａｐａｈａｄ
ｊｏｐｏｕｌｓらによる総説（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。

Ｂｉｏｅｎｇ、　＋　　第９巻、４６７頁、１９８０年
〕、野鳥、抄本、弁上らによる底置〔リポソーム、ｐｐ
。

２１−４０、南江堂（１９８８））に記載されている。

本発明第一の方法に係るリポソームに内包可能な化合物
としては各種薬剤、抗生物質、色素、蛍光性物質等が挙
げられる。

以上のように調製した表面修飾可能なリポソーム分散液
にアミノ基あるいはチオール基を有する基質、または基
質溶液を加え静置あるいは振とうすることにより基質を
リポソームに固定化した表面修飾リポソームを製造でき
る。

本発明第一の方法に係る固定化する基質としてはアミノ
基あるいはチオール基を有していればよい。好ましくは
、アミノ基を有した基質がよい。

これらの基質としては例えばオキシトシン、パップレシ
ン、甲状腺刺激ホルモン分泌ホルモン（ＴＲＨ）等の生
理活性ペプチド、ホルモン等のペプチド（アミド酸を含
む）、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等の免疫グロブ
リン等の抗原、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、膵ガン胎児
性抗原（ＰＯＡ）、α−フェトプロティンモノクローナ
ル抗体、免疫グロブリンモノクローナル抗体、生血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）等のたんばく質、例えばグルコサミ
ン、ガラクトサミン等の１１（多糖を含む）等が挙げら
れる。

本発明第一の方法における表面修飾可能なあるいは表面
修飾されたリポソームの精製は通常の方法により行なう
ことができる。例えばセファデックス、セファローズカ
ラムによるゲルろか法、遠心分離法、透析法が挙げられ
る。

第二の方法は、本発明第一の方法で述べたアミノ基ある
いはチオール基を有した基質と一般式（１）で示される
長鎖、活性アミドを有機溶媒中あるいは水、緩衝液中に
て、混合して長ｕｉ基を有した基質誘導体とする。これ
を精製した後にリポソーム構成素材に混合してリポソー
ムを調製する。

本発明第二の方法において、リポソーム構成素材として
は、本発明第一の方法で示した他に、ホスファチジルエ
タノールアミンやホスファチジルセリン等を用いてもよ
い０本発明第二〇方去において長鎖基を有する基！誘導
体に対するリポソーム構成素材の比はリポソーム構成可
能な範囲で自由に選択できるが、好ましくは５０％以下
、さらに好ましくは３５％以下がよい。

本発明第二の方法に係るリポソーム調製法、リポソーム
に内包可能な化合物、リポソームに固定化する基質、リ
ポソームの精製は本発明第一の方法と同様である。

さらに本発明第二の方法において、リポソーム調製法に
よっては長鎖基を有した基質誘導体を精製することなし
に用いてもよい、また、基質誘導体を含んだ水、緩衝液
をリポソーム分散液としてもよい。

本発明で用いる一般式（１）で示される親水性離脱基を
有する長鎖活性アミドのＲ，は疎水性基を示す　Ｒ３は
一本鎖でも二本鎖でもよい。−本鎖を有するＲ１は直鎖
でも分岐でもよく、また飽和でも不飽和でもよい。

さらに置換基を有していてもよい、Ｒ１は疎水性基とし
てステロール類であってもよい。二本鎖を有するＲ１と
しては、例えば Ｃ）Ｉ！−０−Ｃ−（ＣＨり、１ Ｒ，−０−ＣＩ（Ｏ Ｒ，−０−ＣＨｌ ０　　ＣＩＩＺ　　ＯＣ（ＣＨｚ）、１１１１＋Ｉ Ｒ，−０−ＣＨＯ Ｉｌｌ、−ｏ−ｃＬ Ｒｓ　　Ｎ　　ＣＣＪＩｚ １１１１Ｈ Ｒ，−Ｎ−Ｃ−Ｃｌ−Ｎ−Ｃ−（ＣＨり、−ＣＨｚ　　
　　Ｏ （Ｒ４、Ｒｓは炭素数１〜２２までのアルキル基を示す
。Ｒ４、Ｒ５は直鎖でも分岐でもよく、また飽和でも不
飽和でもよい。さらに置換基を有していてもよい。ｎは
１〜３を示す、キラル炭素に関しては光学活性体でもう
セミ体でもよい、）が挙げられる。

一本鎖を有するＲ１は、炭素数８以上の直鎖アルキル基
が好ましく、炭素数１２以上の直鎖アルキル基がさらに
好ましい。

二本鎖を存するＲ１としては、Ｒ４、Ｒ，が共に炭素数
８以上の直鎖アルキル基が好ましく、更には炭素数１２
以上の直鎖アルキル基が好ましい。

Ｒｚ、Ｒｓは任意の有機基を表わすが、好ましくは、水
素、アルキル基（このアルキル基は１個またはそれ以上
の酸素、またはイオウ原子あるいは１個またはそれ以上
のＮＲ，（Ｒ４は水素、アルキル、シクロアルキル、ア
リール、アルケニル、アルキル基を表わす）によって遮
断されていてもよい）、シクロアルキル基、アルケニル
基、アルキニル基、１〜３個のハロゲン原子で１換され
た０１〜Ｃ３のアルキル基、シアノ基、ハロゲン基、ニ
トロ基、アルコキシ基、アルケノキシ基、アルキノキシ
基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、アリ
ールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニルチオ基
、アルコキシカルボチルアミノ基、ジアルキルアミノ基
、アルキルカルボニルアミノ基、アルキルカルボニル基
、カルバモイル基、アルキルアミノカルボニルアミノ基
、アルキルアミノカルボニルオキシ基、アルキルアミノ
カルボニルチオ基、アルキルスルフィニル基、アリール
スルホニル基、アルキルチオ基を表わす。

一般弐［１）においてＺは親水基であればなんでもよい
が、好ましくはジアルキルアミノ基、トリアルキルアン
モニウム基、スルホ基及びその解離体を表わす。ここで
アルキル基は好ましくはメチル基、エチル基、プロピル
基である。アンモニウム基の対アニオンとしては■θ、
ＢＦ４ｅｐ−Ｔ　Ｓ　Ｏｅ、　ＣＨ２Ｓｏ）　ｅ、　Ｃ
Ｈａ　ＳＯ４ｅが好ましい、スルホ基解離体の対カチオ
ンとしてはＮａ゛、Ｃ４゛、Ｋ”が好ましい。Ｙは。ま
たはＳを示す。好ましくはＹ＝Ｓである。

Ｗは連結基を表わすが、好ましくは−（ＣＨ２）−−（
Ｃ）１２）、−Ｃ−−（ＣＨｇ）ａ−Ｓｏｗ　　−（Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、第２１巻、１９頁、１
９８８年等に記載されている方法を用いて合成できる。

以下に本発明の一般式（１）で表わされる長鎖活性アミ
ドの好ましい具体例を示す、しがし、本発明はこれらに
限定されるものではない。

整数を表わす。

一般式ＩにおていｎはＯ〜１の整数である。

長鎖活性アミドの合成に関しては、特開昭５４７９２７
５号；テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　、第２１巻、８４１頁、１９
８０年；シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　、１９８
２年、９３３Ｗ、マクロモレキュルズ ゛シＨ３ １１８３？ ＣＩ５８３１　　Ｃ Ｈ２ ■ 以下に本発明の合成例及び実施例を示すが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

〔合成例１〕長鎖活性アミドｌ−１の合成ステアリン酸
５．７ｇをＴＨＦ５００〆に溶解し、ジンクロヘキノル
カルボジイミド（ＤＣＣ）を４．０ｇ加え攪拌した。３
０分後に３−（ジメチルアミノメチル）−２−メルカプ
ト−２−チアゾリジン２．８ｇ、ジメチルアミノピリジ
ン（ＤＭＡＰ）０．２ｇを加えた。−昼夜放置して、濾
過したのち濾液を濃縮した。クロロホルムを１００ｄ加
えメチルヨーダイト（１０ｄ）を加えて放置する。生成
した結晶を濾取し、エーテル／エタノール系で再結晶す
ると目的の化合物１−１が４９ｇ得られた。

［合成例２］長鎖活性アミド１−２の合成パルミチン酸
４．８ｇ、ジメチルホルムアミド３００Ｊ１１！、３−
（スルホメチル）−２−メルカプト−２−チアゾリジン
２．Ｏｇ、ＤＣＣ４，５ｇ、ＤＭＡＰｏ、２ｇを用いて
合成例１と同様にして長鎖活性アミド１−２を３．７ｇ
得た。

〔合成例３〕長鎖活性アミド１−９の合成カルボベンゾ
キシ−！−グルタミン酸２．５ｇをテトラヒドロフラン
３００ｄに溶解しＤＣＣ４゜２ｇを加えた６次にセチル
アミン４．８ｇ、　　トリエチルアミン（ＴＥＡ）２．
Ｉｇを加え一昼夜放置した。溶媒留去後残留物をクロロ
ホルムに溶解し有機層を、水で洗った後ぼう硝乾燥をし
てクロロホルムを減圧留去した。シリカゲルクロマト（
溶離液　ヘキサン／酢酸エチル＝８／２）により精製し
て、ジアルキルアミド体４．３ｇを得た。

これを酢酸エチルに溶解し５％パラジウムカーボン１．
０ｇを用いて加水素分解を行った。（５時間）反応液は
、セライトを用いて、ろ過し、ろ液の酢酸エチルを減圧
留去してアミン体（Ｉ［］　３゜４ｇを得た。

ＩＩ　　）Ｉ ＨＪ　　ＣＨＣＮ　　Ｃ＋ｓＨ＋＋ ＣＨｔ（ＩＩ　） ＣＨｔ　　ＣＮ　　Ｃｌ５Ｈ３＋ Ｉ　　Ｈ 次に、グルタル酸無水物１．０ｇをＴＨＦに溶解した。

これに、アミン体（Ｉｆ）３．４ｇ、ＴＥＡｏ、６ｇ、
クロロホルム液１００ｍを滴下した。

２時間後溶液を減圧留去し、クロロホルムを加え、有機
層を希塩酸で洗い（水層ＰＨ＝３〜４）有機層をぼう硝
乾燥して、クロロホルムを減圧留去した。残留物をＴＨ
Ｆ２００ｄに熔解し、ＤＣＣ１゜３ｇを加えて３０分攪
拌した。その中に３−（ジメチルアミノメチル）−２−
メルカプト−２−チアゾリジン１．０ｇ、ＤＭＡＰＯ，
Ｉｇを加えて一晩放置した１反応液をろ過し、濃縮後エ
ーテルとクロロホルムの混合溶媒に溶解し、その中にメ
チルヨーダイト３Ｉ１１を加えた。得られた結晶をエタ
ノールヘキサン系で再結晶して目的の長鎖活性アミド１
−９を２．４ｇ得た。

実施例１．＜表面修飾可能なリポソームの製造法〉ＤＰ
ＰＣ１５ｇ、長鎖活性アミド１−２　２゜３ｍｇを５ｍ
のクロロホルムに溶解した後ロータリーエバポレーター
により溶媒留去し薄膜を形成させた。これを減圧で乾燥
した後に、ＨｚＯ１５Ｉｉを加え６０°Ｃの水浴に１分
間静置、ポルテックスミキシングで１分間振とうを交互
に３回行った後プローブ型ソニケーターを用いて超音波
照射を行った。（２５Ｗ、３分間）次にセファローズ４
Ｂカラムを用いてゲルろかを行い表面修飾可能なリポソ
ームを得た。（Ｔｃ４１°Ｃ１平均粒径５６０ｎｍ） 実施例２．〈表面修飾可能なリポソームの内包試験〉実
施例１と同様に分散液を２００ｍＭ　　５．（６）カル
ボキシフルオロセイン（５，（６）−ＣＦ）ｐｉ−Ｉｓ
、５ホウ酸緩衝液を用いて、リポソームを調製して、５
．（６）−ＣＦ内包リポソームを得た。

（平均粒径３００ｎｍ） 実施例３．〈表面修飾可能なリポソームの製造法とその
内包試験〉 ＤＰＰＣ３０■、長鎖活性アミドＩ−１２■を１５Ｍ１
のクロロホルムに熔解し、実施例１の方法と同様にして
表面修飾可能なリポソーム（Ｔｃ４１°Ｃ１平均粒径２
２０ｎｍ）を得た。さらに２００ｍＭ　　５．（６）−
ＣＦ　　ｐＨ７，４リン酸緩衝液を用いて、同様にリポ
ソームを調製して５ｉ６）ＣＦ内包リポソーム（平均粒
径２１０ｎｍ）を得た。

実施例４．〈表面修飾可能なリポソームの製造法とその
内包試験〉 Ｅｇｇ　　ＰＣ３０■、製鎖活性アミドｌ−８２■を１
５ａｅのクロロホルムに溶解して、実施例１の方法と同
様にして表面修飾可能なリポソーム（平均粒径１２Ｏｒ
＋＋＋）を得た。実施例３と同様にして、５．（６）−
ＣＦ内包リポソームを得た。

実施例５．〈表面修飾可能なリポソームとその内包試験
〉 ＤＰＰＣ３０ｇ、長鎖活性アミド川−９３■を２５ｄの
クロロホルムに溶解して、実施例１の方法と同様にして
表面修飾可能なリポソーム（平均粒径１５０ｎｍ）を得
た。実施例３と同様にして５、（６）−ＣＦ内包リポソ
ームを得た。

実施例６．〈ベンジルアミン固定表面修飾リポソームの
製造〉 実施例１と同様にリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を用いて
調製した表面修飾可能なリポソームリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）分散液０．４ｍ１Ｃ長額活性アミドＩ−１、濃
度４　ｘ　１０−’Ｍ）に４ＸＩＯ−”Ｍベンジルアミ
ンリン＃緩衝ｆｉ（ｐＨ７，５）０゜１＋ｄを加え１２
時間、２５℃で静置した。その結果、リポソーム膜中の
長鎖活性アミドの５０％に対してベンジルアミンが固定
化されたベンジルアミン固定表面修飾リポソームを得た
。

実施例７．＜ペプチド固定表面修飾リポソームの製造〉 実施例６．と同様に調製した表面修飾可能なリポソーム
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）分散液０１４ｄ、長鎖活性
アミドＩ−１、濃度４　ｘ　１０−’Ｍ）に４Ｘ１０−
”Ｍペプチド（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）リン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）Ｏ，ｌｄを加え１２時間、２５℃で静置
した。その結果、リポソーム膜中の長鎖活性アミドＩ−
１の３８％に対してペプチド（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
）が固定化されたペプチド固定表面修飾リポソームを得
た。

実施例８．〈たんばく質固定表面修飾リポソームの製造
〉 実施例１．と同様にして、ＤＰＰＣ１５■、長鎖活性ア
ミドｌ−２１，０１１ｇ、分散液にＰＢＳｆ４液を用い
て表面修飾可能なリポソームを得た。これを０．２μｍ
のミクロボアフィルターを用いてエタストルーダーで５
０“Ｃにおいてサイジングした。これを超遠心分離機を
用いてリポソームを沈鋒させた。（１万回転、１５分間
） このリポソーム沈査に３１１１ｆ！のリン酸緩衝液を加
えた。そのうち、１ｙｄにヒト−１ｇＧ　　１に／〆Ｐ
ＢＳ溶液１ｄを加え、１２時間、２５°Ｃで静置した。

これを超遠心分離機を用いて、ＰＢＳｆ４液で精製して
、たんばく質（ヒト−ＩｇＧ）が固定化されたたんばく
質固定表面修飾リポソームを得た。

実施例９．＜ペプチド固定表面修飾リポソームの製造〉 実施例４．と同様に調製した長鎖活性アミドＩ８を埋め
込んだ表面修飾可能なリポソーム分散液１ｊｌｉ！にペ
プチド（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）水溶液をｌｉｄ加え
１２時間、２５°Ｃで静置した。ゲル濾過によりリポソ
ーム分画をとりペプチド（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）が
固定化されたリポソームを得た。

実施例１０．　＜１固定修飾リポソームの製造〉長屋ら
の方法〔テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔ、）−＋第１１巻８４１頁、ｌ９８０年
〕を用いて、Ｎ−テトラデカノイルグルコサミン［１１
１）を得た。

Ｎ−テトラデカノイルグリコサミン１■、ＤＰＰＣ１５
■をメタノール／クロロホルム−１／１熔液５Ｍｉに溶
解した後ロータリーエバポレーターにより溶媒留去し薄
膜を形成させた。減圧乾燥後にＰＢＳｉ液を３−加えて
、６０°Ｃ水浴に１分間静置、ポルテックスミキシング
１分間振とうを交互に３回行った後、プローブ型ソニケ
ーターを用いて超音波照射を行った。（２５Ｗ、１０分
間）セファローズ４Ｂを用いたゲルろかによりこれをう
精製して、Ｉｉ（グルコサミン）が固定化された修飾リ
ポソームを得た。

実施例１１．〈表面修飾可能なリポソームの加水分解と
アミド′形成挙動の観察〉 実施例１．と同様に調製した長鎖活性アミド１１を埋め
込んだ表面修飾可能なリポソーム０．４ｄにホウ酸緩衝
液（ｐＨ１１、Ｉ＝１．０）０゜１ｄを加えて系中の長
鎖活性アミドＩ−１の減少をＨＰＬＣ（ｃ、カラム資生
堂製、ＣＨｓ　ＣＮ熔翻液）により追跡した。同様に５
．ＯＸＩＯ−２Ｍベンジルアミンリン酸緩衝液（ｐ）（
７，５、Ｉ＝１、Ｏ）０．１Ｍｉを加えてアミド形成を
調べた。

結果を第１図に示す。この結果より長鎖活性アミドＩ−
１はリポソーム系においてｐＨ１１でほとんど加水分解
は進行しないが、アミンとはｐＨ７゜５においてもアミ
ドを形成することを見い出した。

（発明の効果） 以上のように本発明を用いることにより穏和な条件、簡
単な操作によってリポソーム表面に種々の基質を固定化
して表面修飾リポソームを製造することができる。また
本発明で用いられる親水性基を有する長鎖活性アミドは
リポソームの膜構成成分として優れており、加えて水中
での安定性がよいことも明らかでありその効果は大きい
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図はリポソーム膜中に埋め込んだ長鎖活性アミド１
−１の１　ｎ　Ｃ／　Ｃｏ　＝　Ｉ！　ｎ濃度／初濃度
を時間に対してプロットしたグラフである。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社Ｔｉｍｅ（ｈ） 手続補正書 平成３年 ν月、１Ｃ−ｂ 発明の名称 表面修飾可能なリポソームおよび 表面修飾されたリポソームの製造 方法 補正をする者 事件との関係

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記、一般式〔 I 〕で示される化合物とリポソ
   ーム形成可能な脂質から構成されることを特徴とする表
   面修飾可能なリポソーム。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 式 I において、Ｒ＿１は疎水性基を表わす。Ｒ＿２、
   Ｒ＿３は水素を含む有機基を示す。Ｒ＿２、Ｒ＿３は互
   いに連結して環又は二重結合を形成してもよい。 Ｙは酸素原子またはイオウ原子を示す。Ｚは親水性基を
   表わす。Ｗは連結基を表わす。ｎは０〜１の整数である
   。
2. （２）請求項（１）記載の表面修飾可能なリポソームと
   アミノ基及び／又はチオール基を有する基質を混合する
   ことを特徴とする表面修飾されたリポソームの製造方法
   。
3. （３）請求項（１）記載の一般式 I で表わされる化合
   物の少くとも１種とアミノ基及び／又はチオール基を有
   する基質を結合させて得られた化合物とリポソーム形成
   可能な脂質を混合することを特徴とする表面修飾された
   リポソームの製造方法。