JPH0488983A - 耐熱性タンパク質の製造方法 - Google Patents
耐熱性タンパク質の製造方法Info
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- JPH0488983A JPH0488983A JP2204073A JP20407390A JPH0488983A JP H0488983 A JPH0488983 A JP H0488983A JP 2204073 A JP2204073 A JP 2204073A JP 20407390 A JP20407390 A JP 20407390A JP H0488983 A JPH0488983 A JP H0488983A
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子工学的手法を利用した耐熱性タンパク
質の製造方法に関する。
質の製造方法に関する。
［従来の技術］
耐熱性中性プロテアーゼ（Ｎ ｐ ｒＭ）は、バチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏ ｈｉＬｕｓｌ等の好熱姓細菌が産生
ずる蛋白質分解酵素である（ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＦ
ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 Ｋ
ｕｂｏ等、６６、 １３−１７（１９８８１＋。また、
該ＮｐｒＭは蛋白質の分解及びペプチド合成等の工業的
に重要なバイオリアクターとして用いる場合、耐熱性及
び比活性が共に高いという利点を有している。従来の工
業用サーモライシンに比べて耐熱性で約１０％、比活性
で約４０％高いものである（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅｒａｌｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｋｕ
ｂｏら、ｖｏｌ、１３４．１８８３１８９２、 （１
９８８）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ、 Ｋｕｂ。
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏ ｈｉＬｕｓｌ等の好熱姓細菌が産生
ずる蛋白質分解酵素である（ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＦ
ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 Ｋ
ｕｂｏ等、６６、 １３−１７（１９８８１＋。また、
該ＮｐｒＭは蛋白質の分解及びペプチド合成等の工業的
に重要なバイオリアクターとして用いる場合、耐熱性及
び比活性が共に高いという利点を有している。従来の工
業用サーモライシンに比べて耐熱性で約１０％、比活性
で約４０％高いものである（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅｒａｌｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｋｕ
ｂｏら、ｖｏｌ、１３４．１８８３１８９２、 （１
９８８）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ、 Ｋｕｂ。
ら、ｖｏｌ、１７１．４０８０−４０８２ ｆ１９８９
））。
））。
耐熱性中性プロテアーゼを大量に安（産生ずるためには
、耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子を好熱性
細菌から取り出して枯草菌等の遺伝子操作の確立してい
る開成の微生物に組み込んで生産させる方法が考えられ
る。この方法によれば、培養し易い微生物に産生させる
ことで酵素産生が容易になるだけでなく酵素の分離・精
製も容易になるという利点がある。
、耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子を好熱性
細菌から取り出して枯草菌等の遺伝子操作の確立してい
る開成の微生物に組み込んで生産させる方法が考えられ
る。この方法によれば、培養し易い微生物に産生させる
ことで酵素産生が容易になるだけでなく酵素の分離・精
製も容易になるという利点がある。
近年、バチルス属細菌にも遺伝子工学技術を応用して、
アミノ酸、タンパク質を生産することが可能となってき
ている。これらの技術により、飛躍的に生産性が向上し
安価に製造が可能となってきた。しかしながら遺伝子工
学的手法を用いた場合、同種の宿主と外来遺伝子の場合
は比較的容易に発現することが可能となるが、セルフク
ローニングが不可能な場合がしばしば現われる。例えば
、ヒト由来の遺伝子を大腸菌、枯草菌又は酵母等で発現
させること等である。この場合、宿主菌中で機能するプ
ロモーター下流に外来遺伝子を連結しなければ発現は達
成できない。また、バチルス・ステアロサーモフィルス
は遺伝子交換系が十分に確立しておらず、開成遺伝子交
換系が確立されているバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の系を利用し、クローニング
及び発現を行なうことが可能であるが、いずれの場合も
宿主菌と外来遺伝子との組み合わせにより、高発現が達
成されるか否かの分かれ目となる。
アミノ酸、タンパク質を生産することが可能となってき
ている。これらの技術により、飛躍的に生産性が向上し
安価に製造が可能となってきた。しかしながら遺伝子工
学的手法を用いた場合、同種の宿主と外来遺伝子の場合
は比較的容易に発現することが可能となるが、セルフク
ローニングが不可能な場合がしばしば現われる。例えば
、ヒト由来の遺伝子を大腸菌、枯草菌又は酵母等で発現
させること等である。この場合、宿主菌中で機能するプ
ロモーター下流に外来遺伝子を連結しなければ発現は達
成できない。また、バチルス・ステアロサーモフィルス
は遺伝子交換系が十分に確立しておらず、開成遺伝子交
換系が確立されているバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の系を利用し、クローニング
及び発現を行なうことが可能であるが、いずれの場合も
宿主菌と外来遺伝子との組み合わせにより、高発現が達
成されるか否かの分かれ目となる。
このように、遺伝子工学の進歩により多種の微生物を宿
主とした有用物質（タンパク質、アミノ酸等）の大量発
現及び製造が可能となっているが、そこには解決される
べき課題が残されている。すなわち、従来の技術では、
宿主菌と外来遺伝子との組み合わせにより、偶然的に高
発現が達成されていたが、宿主菌と外来遺伝子の特性を
より厳密に理解することにより、さらに高い確率で高発
現が達成されることになる。
主とした有用物質（タンパク質、アミノ酸等）の大量発
現及び製造が可能となっているが、そこには解決される
べき課題が残されている。すなわち、従来の技術では、
宿主菌と外来遺伝子との組み合わせにより、偶然的に高
発現が達成されていたが、宿主菌と外来遺伝子の特性を
より厳密に理解することにより、さらに高い確率で高発
現が達成されることになる。
［発明が解決しようとする問題点］
本発明の目的は、耐熱性タンパク質をコードする外来遺
伝子を枯草菌中で高効率に発現させ、該耐熱性タンパク
質を効率良（生産する方法を提供することである。
伝子を枯草菌中で高効率に発現させ、該耐熱性タンパク
質を効率良（生産する方法を提供することである。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、鋭意研究の結果、耐熱性タンパク質をコ
ードする外来遺伝子を枯草菌を宿主として発現させる場
合に、枯草菌の至適温度である３７℃よりもかなり高い
温度範囲で枯草菌を培養することにより、耐熱性タンパ
ク質の生産性が向上することを見出し本発明を完成した
。
ードする外来遺伝子を枯草菌を宿主として発現させる場
合に、枯草菌の至適温度である３７℃よりもかなり高い
温度範囲で枯草菌を培養することにより、耐熱性タンパ
ク質の生産性が向上することを見出し本発明を完成した
。
すなわち、本発明は、耐熱性タンパク質をコードする遺
伝子を含むプラスミドで形質転換した枯草菌を４０〜５
５℃の温度範囲で培養することを特徴とする耐熱性タン
パク質の製造方法を提供する。
伝子を含むプラスミドで形質転換した枯草菌を４０〜５
５℃の温度範囲で培養することを特徴とする耐熱性タン
パク質の製造方法を提供する。
［発明の効果］
本発明により、耐熱性中性プロテアーゼのような耐熱性
タンパク質を効率的に生産することが可能になった。ま
た、後述の実施例において明らかなように、好熱性細菌
由来の耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドで形質転換した枯草菌を本発明で規定した
温度範囲で培養すると、酵素活性が約２倍になり、また
、培養時間を大幅に短縮することが可能となる。
タンパク質を効率的に生産することが可能になった。ま
た、後述の実施例において明らかなように、好熱性細菌
由来の耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドで形質転換した枯草菌を本発明で規定した
温度範囲で培養すると、酵素活性が約２倍になり、また
、培養時間を大幅に短縮することが可能となる。
［発明の詳細な説明］
本発明は、上述のように、耐熱性タンパク質をコードす
る遺伝子を含むプラスミドで宿主である枯草菌を形質転
換した場合に、枯草菌の至適生育温度である３７℃より
もかなり高い温度範囲である４０℃〜５５℃で枯草菌を
培養した時に耐熱性タンパク質の生産が、枯草菌の至適
温度で培養した場合よりも有意に大きくなるという驚く
べき知見に基づく。
る遺伝子を含むプラスミドで宿主である枯草菌を形質転
換した場合に、枯草菌の至適生育温度である３７℃より
もかなり高い温度範囲である４０℃〜５５℃で枯草菌を
培養した時に耐熱性タンパク質の生産が、枯草菌の至適
温度で培養した場合よりも有意に大きくなるという驚く
べき知見に基づく。
本発明の方法において、枯草菌の培養温度は好ましくは
４５℃〜５５℃であり、さらに好ましくは約５０℃であ
る。
４５℃〜５５℃であり、さらに好ましくは約５０℃であ
る。
本発明の方法により生産される耐熱性タンパク質は、例
えばバチルス・ステアロサーモフィルスのような好熱性
細菌により生産される耐熱性タンパク質であればいずれ
のものであってもよ（、好ましい例として耐熱性中性プ
ロテアーゼ、特にバチルス・ステアロサーモフィルスに
より生産される耐熱性中性プロテアーゼを挙げることが
できる。
えばバチルス・ステアロサーモフィルスのような好熱性
細菌により生産される耐熱性タンパク質であればいずれ
のものであってもよ（、好ましい例として耐熱性中性プ
ロテアーゼ、特にバチルス・ステアロサーモフィルスに
より生産される耐熱性中性プロテアーゼを挙げることが
できる。
耐熱性中性プロテアーゼは、例えばバチルス・ステアロ
サーモフィルスＭＫ−２３２株（微工研菌寄第９６４５
号）により生産される耐熱性タンパク質であり、その遺
伝子は既にクローニングされており （Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｋｕｂｏら、１３４巻、１８３３−１８９２．１９８
８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、 Ｋｕｂｏ ら、１７１巻、４０８０−４０８２．
１９８９１、従って、これを含むプラスミド（例えばｐ
ＭＫ−１）もこの文献に記載されており、さらに枯草菌
の形質転換及び発現方法もこの文献に記載されていると
おり公知のものである。
サーモフィルスＭＫ−２３２株（微工研菌寄第９６４５
号）により生産される耐熱性タンパク質であり、その遺
伝子は既にクローニングされており （Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｋｕｂｏら、１３４巻、１８３３−１８９２．１９８
８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、 Ｋｕｂｏ ら、１７１巻、４０８０−４０８２．
１９８９１、従って、これを含むプラスミド（例えばｐ
ＭＫ−１）もこの文献に記載されており、さらに枯草菌
の形質転換及び発現方法もこの文献に記載されていると
おり公知のものである。
枯草菌を培養することにより生産された耐熱性タンパク
質は、常法により回収し、必要に応じて精製することが
できる。
質は、常法により回収し、必要に応じて精製することが
できる。
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが
、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
ｆｌｌｐＭＫｌを含む枯草菌による耐熱性中性プロテア
ーゼの生産 バチルス・ステアロサーモフィルス由来の耐熱性中性プ
ロテアーゼをコードするプラスミドｐＭＫＩ（Ｋｕｂｏ
ら、土掘）を用いてバチルス・サチルスＭ Ｔ −２（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
Ｆｕｊｉｉら、１５４巻、８３１−８３７頁、１９８３
年）を５ｐｉｚｉｚｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ８１巻、７４１−７４６．
１９６１年）に記載された方法により形質転換した。な
お、プラスミドｐＭＫ１の構造を図４に示す。得られた
形質転換株を１００ｍ１のし培地（１％トリプトン、０
．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１）に植菌し、３７
℃及び４５℃で２００回転、２４時間培養した。菌体の
増殖及びこの培養液中の酵素活性を調べた。酵素活性の
測定は、カゼイン消化法（Ｋｕｂｏら、前述）を用いて
行なった。結果を図１に示す。図１中、黒丸は６００ｎ
■における吸光度を示し、白丸はプロテアーゼ活性（Ｕ
／■ｌ）を示す。
ーゼの生産 バチルス・ステアロサーモフィルス由来の耐熱性中性プ
ロテアーゼをコードするプラスミドｐＭＫＩ（Ｋｕｂｏ
ら、土掘）を用いてバチルス・サチルスＭ Ｔ −２（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
Ｆｕｊｉｉら、１５４巻、８３１−８３７頁、１９８３
年）を５ｐｉｚｉｚｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ８１巻、７４１−７４６．
１９６１年）に記載された方法により形質転換した。な
お、プラスミドｐＭＫ１の構造を図４に示す。得られた
形質転換株を１００ｍ１のし培地（１％トリプトン、０
．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１）に植菌し、３７
℃及び４５℃で２００回転、２４時間培養した。菌体の
増殖及びこの培養液中の酵素活性を調べた。酵素活性の
測定は、カゼイン消化法（Ｋｕｂｏら、前述）を用いて
行なった。結果を図１に示す。図１中、黒丸は６００ｎ
■における吸光度を示し、白丸はプロテアーゼ活性（Ｕ
／■ｌ）を示す。
図１に示されるように、宿主の通常の生育温度３７℃で
培養した組み換え菌に比べて高温の４５℃で培養したも
のの方が約１．６倍の高い酵素活性を示した。また、３
７℃での培養は増殖非連動型で酵素が発現したが、４５
℃では好熱菌の場合と同じ増殖連動型で発現した。培養
温度を高くすることにより発現時間は大幅に短縮され、
生産量も向上した。
培養した組み換え菌に比べて高温の４５℃で培養したも
のの方が約１．６倍の高い酵素活性を示した。また、３
７℃での培養は増殖非連動型で酵素が発現したが、４５
℃では好熱菌の場合と同じ増殖連動型で発現した。培養
温度を高くすることにより発現時間は大幅に短縮され、
生産量も向上した。
１１見ユ
実施例１で作製した形質転換したバチルス・サチルスＭ
Ｔ−２／ｐＭＫ１を培養温度を３７℃、３８℃、３９℃
、４０’Ｃ１４５℃及び５０”Ｃにする以外は実施例１
と同様にして培養し、菌体の増殖及び酵素活性を測定し
た。また、各温度における菌体当たりの酵素量を求めた
。その結果を表１及び図２に示す。なお、図２中、各２
号は以下の培養温度における結果を示す。
Ｔ−２／ｐＭＫ１を培養温度を３７℃、３８℃、３９℃
、４０’Ｃ１４５℃及び５０”Ｃにする以外は実施例１
と同様にして培養し、菌体の増殖及び酵素活性を測定し
た。また、各温度における菌体当たりの酵素量を求めた
。その結果を表１及び図２に示す。なお、図２中、各２
号は以下の培養温度における結果を示す。
・： ５０℃、 △： ４５℃、 ■： ４０’Ｃ○
： ３９℃、 ム： ３８℃、 口： ３７℃マツマ：
０℃ この結果より３９℃と４０℃とでは酵素の発現様式が異
なっていることが分かった。４０℃を境として増殖連動
型で発現するように変化した。
： ３９℃、 ム： ３８℃、 口： ３７℃マツマ：
０℃ この結果より３９℃と４０℃とでは酵素の発現様式が異
なっていることが分かった。４０℃を境として増殖連動
型で発現するように変化した。
これは親株であるバチルス・ステアロサーモフィルスＭ
Ｋ２３２と同様な発現様式にシフトしたもので、温度に
よる効果であると思われる。また、細胞当たりの酵素量
は培養温度が上昇するに伴い発現率が上昇することが分
かった。酵素活性は５０℃が最も高＜ ８１００ Ｕ／
ａｔで、細胞当たりの酵素量は３５００ Ｕ／ｍｌであ
った。しかし、培養温度の上昇に伴い宿主菌の増殖が阻
害されることも判明した。
Ｋ２３２と同様な発現様式にシフトしたもので、温度に
よる効果であると思われる。また、細胞当たりの酵素量
は培養温度が上昇するに伴い発現率が上昇することが分
かった。酵素活性は５０℃が最も高＜ ８１００ Ｕ／
ａｔで、細胞当たりの酵素量は３５００ Ｕ／ｍｌであ
った。しかし、培養温度の上昇に伴い宿主菌の増殖が阻
害されることも判明した。
叉」１九旦
実施例１で得られた形質転換した菌株を１６βジャーフ
ァーメンタ−を用いてＬ培地（１％トリプトン、０．５
％酵母エキス、０，５％ＮａＣ１） １０ Ｉ２に２％
植薗して４５℃で３０時間培養した。菌体の増殖及び酵
素活性を実施例１と同様にして測定した。その結果を図
３に示す。なお、図３中、黒丸は６００ ｎ＋ｓにおけ
る吸光度を示し、白丸はプロテアーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
を示す。
ァーメンタ−を用いてＬ培地（１％トリプトン、０．５
％酵母エキス、０，５％ＮａＣ１） １０ Ｉ２に２％
植薗して４５℃で３０時間培養した。菌体の増殖及び酵
素活性を実施例１と同様にして測定した。その結果を図
３に示す。なお、図３中、黒丸は６００ ｎ＋ｓにおけ
る吸光度を示し、白丸はプロテアーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）
を示す。
図３に示されるように、フラスコで培養した時と同様に
酵素活性で約１．６倍、発現時間で約６時間短縮され工
業的にも高温で培養を行なうことは多大な利点があるこ
とがわかった。
酵素活性で約１．６倍、発現時間で約６時間短縮され工
業的にも高温で培養を行なうことは多大な利点があるこ
とがわかった。
図１は、本発明の培養法における３７℃及び４５℃での
菌体増殖と酵素活性を示す図である。 図２は、各培養温度における菌体当たりの酵素活性を示
す図である。 図３は、ジャーファーメンタ−における菌体増殖及び酵
素活性を示す図である。 図４は、形質転換に用いたプラスミドｐＭＫ１の構造を
示す図である。
菌体増殖と酵素活性を示す図である。 図２は、各培養温度における菌体当たりの酵素活性を示
す図である。 図３は、ジャーファーメンタ−における菌体増殖及び酵
素活性を示す図である。 図４は、形質転換に用いたプラスミドｐＭＫ１の構造を
示す図である。
Claims (5)
- （１）耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を含むプラ
スミドで形質転換した枯草菌を４０〜５５℃の温度範囲
で培養することを特徴とする耐熱性タンパク質の製造方
法。 - （２）耐熱性タンパク質が耐熱性中性プロテアーゼであ
る請求項１記載の方法。 - （３）耐熱性タンパク質をコードする遺伝子がバチルス
・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３２（￥Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ￥￥ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ￥）
由来の耐熱性中性プロテアー遺伝子である請求項２記載
の方法。 - （４）枯草菌の培養を４５〜５５℃で行なう請求項１な
いし３のいずれかに記載の方法。 - （５）枯草菌の培養を約５０℃で行なう請求項４記載の
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2204073A JPH0488983A (ja) | 1990-08-01 | 1990-08-01 | 耐熱性タンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2204073A JPH0488983A (ja) | 1990-08-01 | 1990-08-01 | 耐熱性タンパク質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0488983A true JPH0488983A (ja) | 1992-03-23 |
Family
ID=16484323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2204073A Pending JPH0488983A (ja) | 1990-08-01 | 1990-08-01 | 耐熱性タンパク質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0488983A (ja) |
-
1990
- 1990-08-01 JP JP2204073A patent/JPH0488983A/ja active Pending
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