JPH048296A - 新規モノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ヒトＢＣＤＦとヒトＢＣＤＦ　−Ｒとの結合
を阻害し、ＢＣ叶の生物活性を中和するモノクローナル
抗体及び該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マに関する。

〈従来技術〉 ヒ）　８ＣＤＦは、免疫系細胞が産生し、免疫調ｍ機構
と密接に関一連する生体成分であり、下記に示すように
本物質の全アミノ酸配列は既に決定されている。（Ｎａ
ｔｕｒｅ、３２４巻、７３．１９８６）即ちアミノ酸配
列： （Ｎ末端） Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＶａｌＡｌａ　Ａｌａ
　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓ
ｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ
　ＬｅｕＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ＾ｓｎ
　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＡｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ
　Ｐｒｏ　ＬｙｓＭｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｆｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｙＰｈｅ　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙ
ｓ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　ｌ１
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Ｇｌｕ　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＴｙｒ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　
Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　ＧｌｕＧｌ
ｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　Ｍｅ
ｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　　ＶａｌＬｅｕ　　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ　
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ｓｐ　　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　
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　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　
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ｎ　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　
Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕｌｌｅ　Ｌｅｕ　
Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｎ　５ｅｒＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ
　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ（Ｃ末端） さて、ヒ）　ＢＣＯＦは活性化Ｂ細胞からの抗体産生を
誘導をしたり（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ　　１６７巻、３３２頁、
　１９８８年）、キラーＴ細胞の増殖を誘導したり（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４０巻、
５０８頁、　１９８８年）、肝細胞に働いて、炎症時初
期に出現する急性照査白質合成の誘導をしたり（ＦＥＢ
Ｓ　１ｅｔｔｅｒｓ　２２１巻、１８頁、　１９８７年
）、血液幹細胞に働いて多能性造血幹細胞のコロニーを
誘導をする（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　
ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ　ｏｆ　　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　
ｏｆＡｍｅｒｉｃａ　８４巻、　９０３５頁、　１９８
７年）などの様々な生理的作用を示すことが知られてい
る。一方、心房内粘液腫やリウマチ性関節炎など自己成
分に対する抗体を産生じている患者ではヒトＢＣ叶の異
常産生が見出されている（代謝　２４巻、臨時増刊号免
疫８７．１３頁、　１９８７年）。この場合、過剰に産
生されたヒ）　ＢＣＤＦが、Ｂ細胞などの細胞膜上に存
在するヒ！−ＢＣ［）Ｆに特異的な受容体（ヒ）　ＢＣ
ＤＦ　−１？）へと結合することにより細胞内へと刺激
が伝達され、Ｂ細胞が抗体産生細胞へと分化し、自己成
分に対する抗体が異常に産生され、疾患を増悪している
と推察される。従って、過剰に産生されたヒトＢＣＤＦ
のヒトＢＣＤＦ　−Ｒへの結合を阻害することができれ
ば、細胞内へ刺激が伝達されず、抗体の異常産生が抑制
され、自己免疫疾患や免疫不全症、炎症などのヒ）　Ｂ
ＣＯＦの過剰産生が疾患を増悪させていると考えられる
疾病の治療薬として用いることができると推定される。

尚、本発明者等はヒトＢＣ叶とヒ）　ＢＣＤＦ　−Ｒと
の結合を不完全に阻害する抗体については既に報告して
いる（特願昭１−１０２３４９．１８回（昭和６３年度
）日本免疫学会総会講演予稿集３２８頁）。また特願昭
１−１０２３４９号で開示した抗体はヒ）　ＢＣＤＦの
生物活性を完全に阻害しない。

従って、本発明以前には、ヒトＢＣ叶とヒトＢＣＤＦ　
−Ｒとの結合を完全に阻害し、かつヒトＢＣ叶の生物活
性を完全に阻害するモノクローナル抗体を得ることに関
しては全く知られていない。

尚、ヒ）　ＢＣＤＦはＢ細胞の分化以外にも生体内にお
いて種々の生理作用を有するのでヒＩ−Ｂ細胞刺激因子
２（ヒトＢＳＦ−２）又はヒトインターロイキン６（ヒ
トＩＬ−６）とも呼ばれ、いずれの名称を用いても良い
のであるが、本出願においては従来から用いられている
ヒトＢＣＤＰという名称を用いることにする。

また、同様にヒトＢＣＤＦ　−ＲもヒトＢ細胞刺激因子
２受容体（ヒトＢＳＦ　−２Ｒ）とも、ヒトインターロ
イキン６受容体（ヒトＩＬ−６Ｒ）とも言われ、いずれ
の名称を用いてもよいが、従来より用いられているヒト
ＢＣＤＦ　−Ｒという名称を用いることにする。

〈本発明が解決しようとする課題〉 そこで、本発明の目的は、ヒトＢＣＤＦとヒｌ−ＢＣＤ
Ｆ−Ｒとの結合を完全に阻害し、ＢＣＤＦの生物活性を
中和するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体
を産生ずるハイプリドーマの提供である。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは、上記課題を解決するために、ヒ）　ＢＣ
ＤＦ　−Ｒを高発現しているヒト細胞を免疫原として用
いる事により、ヒトＢＣ叶とヒトＢＣＤＦ　−Ｒとの結
合を完全に阻害し、ＢＣ叶の生物活性を中和するモノク
ローナル抗体を取得することができ、本発明を完成する
に至らしめた。

即ち、本発明はヒトＢＣ叶とヒトＢＣＯＦ　−Ｒとの結
合を完全に阻害し、ヒ）　ＢＣＤＦの生物活性を中和す
るモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマである。

本発明に従えば、ヒトＢＣＤＦとヒトＢＣＤＦ　−Ｒと
の結合を完全に阻害し、ヒ１−ＢＣ叶の生物活性を中和
する活性を示すモノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ド−マクローン、及び該クローンが産生ずる性状の均一
なモノクローナル抗体が提供される。

本発明のハイブリドーマクローンは、（ａ）骨髄腫細胞
すなわち、骨髄の初期腫瘍からの悪性化細胞と、（ｂ）
ヒトＢＣＤＦ　−Ｒを高発現しているヒト細胞で免疫さ
れた動物の肺臓または、リンパ節の細胞中に存在する抗
体産生細胞とのハイブリドーマを作成し、このハイブリ
ドーマを培養及びクローン化して、ヒトＢＣＤＦがヒト
ＢＣＤＦ　−Ｒを発現している細胞への結合を完全に阻
害し、かつヒ）　ＢＣＤＦの生物活性を中和する抗体を
産生ずるクローンとして選択されるものである。

目的とするモノクローナル抗体は、このようなりローン
を培養した培養上清から、塩析、イオン交換クロマトグ
ラフィー等の精製操作により回収できるが、必要に応じ
て全培養上清を用いることもできる。また大量に取得す
る場合には、該ハイブリドーマを組織適合性動物もしく
は胸腺欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植し増殖させ、
該動物の腹水中に産生された該モノクローナル抗体を精
製、回収すれば良い。

以下にこのヒトＢＣＤＦとヒトＢＣＤＦ　−Ｒの結合を
完全に阻害し、ヒトＢＣＤＦの生物活性を中和する活性
を示すモノクローナル抗体の調製法を記す。

ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合させ
ることによって製造される。抗体産生細胞としては、ヒ
トＢＣＤＦ　−Ｒ高発現細胞であるヒトミエローマロ２
６６細胞で免疫されたマウス、ラットなどの動物からの
肺臓またはリンパ節細胞を用いるとよい。尚、ヒトミエ
ローマＵ２６６に限らず、ヒトＢＣＯＦ　−Ｒを高発現
している細胞であれば、何を免疫原にしてもかまわない
。

骨髄腫細胞と抗体産生細胞の由来する動物の種は、両細
胞が融合可能な限りにおいて異ってもよいが、通常同一
種の細胞を用いた方がよい結果が得られる。

本発明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、
ヒトミエローマロ２６６細胞で免疫したマウスの肺臓細
胞又はリンパ節細胞と、マウス骨髄腫細胞との間のハイ
ブリドーマである。

例えば、生理食塩水に懸濁した０２６６細胞で免疫した
Ｂａ１ｂ／ｃマウスの抗体産生肺臓細胞と、Ｂａ１ｂ／
Ｃマウスの骨髄腫細胞χ６３−　Ａｇ８−６゜５．３の
間のハイブリドーマで後記の実施例でも示す様に優れた
結果が得られた。

骨髄腫細胞としては、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３のほ
かにＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−０１．　Ｐ３−Ｘ６３−＾
ｇ８．　Ｐ３−ＮＳＩ　／１−Ａｇ４−１．　ＭＰＣＩ
Ｉ−４５，６，７Ｇ、１．７　、　ＳＰ２／Ｖ−Ａｇ１
４゜（以上マウス＞　２１０．ＲＣＹ、八ｇ１．２．３
（ラット）、　５ＫＯ００７ＧＨ１５００６ＴＧ−＾１
２（以上ヒト）等の８アザアニン耐性の細胞株を用いて
もよい。

ハイブリドーマの作成と、それからのヒトＢＣＤＦとヒ
トＢＣＤＦ　−Ｒとの結合を完全に阻害し、ヒトＢＣＤ
Ｆの生物活性を完全に中和する活性を示すモノクローナ
ル抗体産生クローンの選択は、例えば、次の様にして行
える。ポリエチレングリコールまたは、センダイウィル
スを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。

生じたハイブリドーマは、ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジンを含む培地（以下ＨＡＴ培地と略する）
中で生育する。

融合しなかった骨髄腫細胞は、該培地中では死滅し、ハ
イブリドーマだけが増殖してくる。生育したハイブリド
ーマから目的とする抗体を産生ずるクローンが選択され
る。全てのハイブリドーマクローンが抗体を産生ずるわ
けではない。また、個々のクローンによって産生される
抗体は特異性が異なり、全てのクローンが目的とする抗
体を産生ずるのではない。従って、目的とするヒ）ＢＣ
叶とヒトＢＣ叶−Ｒとの結合を完全に阻害し、ヒトＢＣ
ＤＦの生物活性を中和する活性を示す抗体を産生ずるク
ローンを選択しなければならない。

その選択は例えば以下の様にして行える。まず、ヒトＢ
ＣＤＦとヒトＢＣＤＦ　−Ｒとの結合を阻害する活性を
示すクローンの選択は、ポルトン・ハンター法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１３３巻、５２９
頁、　１９７３年）又は、ラクトパーオキシダーゼ法（
Ｎａｔｕｒｅ　２６９巻３０９頁、　１９７７年）によ
り、１′■標識ヒトＢＣＤＦ（以下ｌ２Ｊ−ＢＣＤＦと
略する）を作成し、ハイブリドーマクローン培養上清中
の抗体による＋２５Ｔ−ＢＣＤＦとＵ２６６細胞との結
合阻害活性を測定すればよい。

また、ヒトＢＣＤＦの生物活性を中和する活性を示すク
ローンの選択は、例えばヒトＢＣ叶に対して、依存的に
増殖するヒト細胞株、ＫＴ〜３細胞（Ｂｌｏｏｄ７１巻
　１９６頁　１９８８年）あるいはヒトＢＣ叶に対して
依存的に抗体産生細胞へと分化するヒト細胞株ＳＫＷ　
６　、　ＣＬ　−４細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ　１６７巻　３
３２頁　１９８８年）を用い、ハイブリドーマクローン
培養上滑中の抗体による細胞株の増殖もしくは分化阻害
活性を測定すればよい。

結合阻害活性が高く、しかも増殖もしくは分化阻害活性
が高いハイブリドーマが目的とするモノクローナル抗体
産生クローンとなる。

こうして得られたハイブリドーマクローンとして、例え
ば（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４０６）と呼ばれる細胞がある
。

次にモノクローナル抗体の大量調製法であるが、（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１１４０６）を培地にて長期連続継代培養ま
たは組織適合性動物もしくは、胸腺欠損ヌードマウス中
において生育させたのち、その腹水中より、イオン交換
体などを用いて、分離精製することにより回収される。

さて、得られたモノクローナル抗体は以下の様な性質を
有するものである。

（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４０６）が産生ずるモノクローナ
ル抗体（以後モノクローナル抗体を１−３９とする）（
ａ）　　免疫グロブリンの種類：　ＩｇＧ２ａ（５）分
子量：　１５０，０００ダルトン（Ｃ）　　分子吸光係
数：　Ｅ２８０ｎｍ　＝　１４．０（ｄ）　　細胞に結
合しヒトＢＣ叶とヒトＢＣＤＦ　−Ｒとの結合を完全に
阻害する （ｅ）　　細胞に結合しヒトＢＣＤＦの生物活性を完全
に中和する 〈効果〉 本発明によるモノクローナル抗体を用いれば、ヒトＢＣ
ＤＦが過剰に産生されることにより発症していると考え
られる疾患、すなわち、慢性関節リウマチや、全身性紅
斑性狼癒などの自己免疫疾患や免疫不全症への治療薬及
び抗炎症薬となる。

以下、実施例に従い、更に詳細に説明する。

〈実施例１．ハイブリドーマの調製法〉６〜８週令の＃
Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、Ｕ２６６細胞を生理食塩水に懸
濁しそれぞれ１匹当り２Ｘ１０’個腹腔内注射し免疫し
た。その１０日後、同様の操作にて追加免疫した。更に
その３日後、免疫したマウスの眼窩静脈より採血し、そ
の血清について後述の参考例に示す測定法に従って”’
Ｉ−ＢＣＤＦとｕ２６６細胞との結合阻害活性を測定し
た。阻害活性を有していたマウスを更に同様の方法で免
疫し、その３日後該マウスより肺臓を摘出した。

肺臓細胞とＸ６３−Ａｇ８−６．５．３骨髄腫細胞とを
５０％ポリエチレングリコール＃４０００　（牛丼化学
製）存在下にて細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞
融合させた。融合細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰ
［１６４０培地（ギブコ社製）１＋ｆ当りに５Ｘ１０”
個となるように懸濁し、１ウェル当り５Ｘ１０’個の胸
腺細胞を含有する９６穴マイクロタイタープレート（コ
ーニング社製）に５Ｘ１０’個ずつ分注した。１日、２
日、３日、６日後に培地の半量（１００μＩｌ）を）Ｉ
ＡＴ培地と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返
した。融合より、およそ２週間後、ハイブリドーマの生
育してきたウェルの培養上清について、後述する参考例
に示す様な方法にて１２Ｊ　　Ｂに叶とＵ２６６細胞と
の結合阻害活性及びヒトＢｃ叶によるＫＴ−３細胞の増
殖抑制活性を測定した。

表１及び表２に示す様にハイブリドーマＩｌ−３９（Ｆ
ＥＲＰ−１１４０６）の培養上清中に”’ｒ−ＢＣＤＦ
きｕ２６６細胞との結合阻害活性及び、ヒ）ＢＣ叶によ
るＫＴ−３細胞の増殖抑制活性があることを見い出した
。

表−一λ 〈実施例２．マウス腹水より精製した抗体でのヒトＢＣ
叶とヒ）　ＢＣＤＦ　−Ｒとの結合阻害活性及びヒ）Ｂ
Ｃ叶の生物活性の中和 活性の測定〉 生理食塩水に懸濁したハイブリドーマ１１−３９（ＦＥ
ＲＰ−１１４０６）をあらかしめ１週間前に１匹当り０
．５ｍｆのブリスタン（正式には２，６，１０．１４−
テトラメチルペンタデカン）を腹腔内注射しておいたＢ
ａ１ｂ／ｃマウス（♀、８〜１０週令）に、それぞれ１
匹当りｌＸｌ０’個ずつ腹腔内注射した。

およそ１０日後、マウス腹腔内より増殖した細胞を含む
腹水を採取し、遠心操作にて、細胞を除去した。細胞を
除去した腹水を、０．４飽和硫安にて塩析を行い、０．
１５　Ｍ　ＮａＣｌ１を含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（
ｐＨ７，５）　（以下ＰＢＳと略す）に対して透析した
。次に、ＰＢＳにて平衡化しておいたプロティンＡセフ
ァロースカラム（ファルマシア社製）に添加し、素通り
画分を得たのち、０．５Ｍ酢酸（ｐＨ２，６）を用いて
溶出した。溶出後、ただちにＰＢＳに対して透析し、抗
体画分を得た。得られた抗体でのヒ）　ＢＣＤＦとヒト
ＢＣＤＦ　−Ｒとの結合阻害活性及びヒ）ＢＧ叶の生物
活性の中和活性の測定を参考例１および２の様な方法に
て行った。第１図に示す様に精製抗体においても”’Ｉ
−ＢＣＤＦとＵ２６６細胞との結合阻害活性が、また、
第２、第３図に示す様にヒトＢＣＤＦの生物活性の中和
活性が有ることが判明した。

〈実施例３．精製モノクローナル抗体１−３９の０２６
６、　ＫＴ　−３及び５ＫＷ６．ＣＬ−４細胞への結合
〉 精製モノクローナル抗体１−３９の細胞への結合はビオ
チン標識したモノクローナル抗体と細胞とを反応させ、
洗浄した後、色素であるフィコエリスリン標識したアビ
ジンと反応させ再び洗浄し、自動細胞解析装置（ＦＡＣ
５ｃａｎ、ベクトンディ・ンキンソン社）にて測定した
。なお、特異的な結合であるか否かを、１ｏｏｏＰｊ過
剰の非標識抗体存在下にて併行して測定を行い確認した
。第４図（ａ）（ｂ）　（Ｃ）に示す様にモノクローナ
ル抗体１−３９は特異的に［２６６、にＴ−３及び５Ｋ
Ｗ６　ＣＬ−４細胞に結合した。

アビジンは特異的にビオチンと結合する。

〈実施例４．１−３９モノクロ一ナル抗体、４Ｂ７モノ
クロ一ナル抗体（ハイブリドーマＦＥＲＭ　Ｐ−１０１
４９由来のモノクローナル抗体）及び３Ｆ１２モノクロ
一ナル抗体 （ハイブリドーマＦＥＲＭ　Ｐ−１０１４８由来のモノ
クローナル抗体）の三者間におけるヒトＢＣＤＦとヒ）
　ＢＣＤＦ　−Ｒとの結合阻害活性及びヒトＢＣＤＦに
よるＳＫＷ　６　、ＣＬ　−４細胞の分化抑制活性の比
較〉 本発明の１−３９モノクロ一ナル抗体（ハイブリドーマ
ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４０６由来のモノクローナル抗体）
と特願昭１−１０２３４９中の４８７モノクロ一ナル抗
体（ハイブリドーマＦＥＲＭ　Ｐ−１０１４９由来のモ
ノクローナル抗体）及び３Ｆ１２モノクロ一ナル抗体（
ハイブリドーマＦＥＲＭ　Ｐ−１０１４８由来のモノク
ローナル抗体）との三者間における、ヒトＢＣＤＦとヒ
）　ＢＣＤＦ　−Ｒとの結合を阻害する活性、及び同じ
く三者間におけるヒトＢＣ叶によるＳＫＷ　６、ＣＬ−
４細胞のＩｇＭ産生細胞への分化を阻害する活性を参考
例１及び２の様な方法にて比較した。第５図に示すよう
に本発明１−３９モノクロ一ナル抗体は（ａ）結合活性
、（ｂ）分化活性とも完全に抑制し、他の２抗体とは明
らかに異なることが判明した。

〈参考例１：抗体によるヒトＢＣＤＦとヒトＢＣＤＦ　
−Ｒとの結合阻害活性の測定法〉 ０゜５％ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ　１６４０
培地１ｍｊ２当り、１×１０７個となるように懸濁した
Ｕ２６６細胞懸濁液５０μｌとサンプル溶液１００μｌ
を混合し、４℃にて、１時間放置する。次にポルトン−
ハンター法にて１２５１標識したヒトＢＣＤＦ溶液５０
μｌを添加し、４°Ｃにて、１時間放置する。

更に、オリーブ油とｎ−ブチルフタレートとを１：４の
割合で混合した液を入れたポリプロピレンチューブに反
応細胞懸濁液を重層し１，００ｈＸ　１０分間遠心して
細胞のみを集め、細胞に結合した’　”　’　Ｉ−ＢＣ
ＤＦ量をγ−カウンターにて測定する。

〈参考例２：抗体によるヒ）　ＢＣＤＦ生物活性の中和
活性の測定法〉 （ａ）ＫＴ−３細胞を用いる方法 １０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地に４Ｘ１０
’コ／−２となるように懸濁したＫＴ−３細胞を含む溶
液１００μｌと培養上清あるいは既知濃度に調製した精
製モノクローナル抗体溶液５０μｌとを混合し、３７°
Ｃにて１時間反応させる。

次に８００　ｐｇ／ｍ　ｌの濃度に調製したヒトリコン
ビナントＢＣＤＦ５０μｌを加え、３７°Ｃ１５％ＣＯ
□存在下３日間培養する。最後の５時間は、１０μＣｉ
／ｍｊ２の３Ｈ−チミジン溶液を５０μ！加えて培養し
、細胞内に取り込まれた３Ｈ−チミジン量をシンチレー
ションカウンター（ＬＫＢ社製）にて測定する。

（ｂ）ＳＫ匈６．ＣＬ−４細胞を用いる方法１０％ＦＣ
Ｓを含むＲＰぢＩ　１６４０培地にｌＸｌ０’コ／ｍｌ
となるように懸濁した５ＫＷ６．ＣＬ４細胞を含む溶液
１００μｉと培養上清もしくは既知濃度に調製した精製
抗体溶液５０μ２とを混合し、３７°Ｃにて１時間反応
させる。

次に４ｎｇ／ｎ／！の濃度に調製したヒトリコンビナン
トＢＣＤＦ５０μ！を加え、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在
下３日間培養する。更にその培養上清を採取し、上清中
に含まれるｒｇＭ量を酵素抗体測定法にて測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、精製モノクローナル抗体１−３９が抗体濃度
依存的にヒトＢＣＤＰとヒトＢＣＤＦ−Ｒとの結合を阻
害する活性を有していることを示す。 第２図は、精製モノクローナル抗体１−３９が、抗体濃
度依存的にヒ）ＢＣ叶によるにＴ−３１！Ｉ胞の増殖を
抑制する活性を有していることを示す。 第３図は、精製モノクローナル抗体１−３９が抗体濃度
依存的にヒトＢＣＤＦによる５ＸＷ６．ＣＬ−４細胞の
分化を抑制する活性を有していることを示す。 第４図は、精製モノクローナル抗体１−３９が特異的に
０２６６、　ＫＴ−３、及び５ＫＷ６．ＣＬ−４細胞に
結合することを示す。尚、実線は抗体非添加及び１００
０倍過剰非標！ｋｌ−３９モノクローナル抗体存在下で
のビオチン標識１−３９モノクロ一ナル抗体添加を示す
。一方、破線はビオチン標識１−３９モノクロ一ナル抗
体単独添加を示す。 第５図は、モノクローナル抗体１−３９がモノクローナ
ル抗体３Ｆ１２　（ハイブリドーマＦＥＲＭ　Ｐ−１０
１４８由来）及びモノクローナル抗体４Ｂ７（ハイブリ
ドーマＦＥＲＭ　Ｐ−１０１４９由来）とは異なり、（
ａ）ヒトＢＣＤＦとヒトＢＣＤＦ　−Ｒとの結合を完全
に阻害すること、（ｂ）ヒトＢＣＤＦによる５ＫＷ６．
ＣＬ−４細胞の分化を完全に阻害することをそれぞれ示
す。 第１図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＢ細胞分化因子（以下ヒトＢＣＤＦと略する
   ）とヒトＢ細胞分化因子レセプター（以下ヒトＢＣＤＦ
   −Ｒと略する）との結合を阻害し、ヒトＢＣＤＦの生物
   活性を中和するモノクローナル抗体。
2. （２）モノクローナル抗体がヒトＢＣＤＦ−Ｒ高発現細
   胞を免疫原としてマウスに免疫して得られたものである
   請求項（１）記載のモノクローナル抗体。
3. （３）ヒトＢＣＤＦ−Ｒ高発現細胞がヒトミエローマＵ
   ２６６細胞である請求項（１）記載のモノクローナル抗
   体。
4. （４）モノクローナル抗体がモノクローナル抗体１−３
   ９である請求項（１）記載の抗体。
5. （５）請求項（４）記載のモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマが微工研寄託番号￥１１４０６￥号（
   ＦＥＲＭＰ−１１４０６）であるハイブリドーマ。