JPH0479887A - シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含有するｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シュークロース・ホスホリラーゼ（以下、Ｓ
ＰＬと略する場合もある）遺伝子を含有するＤＮＡ断片
に関する。

〔従来の技術〕

シュークロース・ホスホリラーゼ（５ｕｃｒｏｓｅｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　（ＥＣ２，４，１，７））は
、下記の反応式で示される反応を触媒する酵素である。

シュークトス・ホスホリラーゼ シュークロース＋Ｐｉ α−Ｄ−グルコースー１−リン酸＋フラクトースそして
シュークロース・ホスホリラーゼは、無機リンの定量に
用いられる等極めて有用なものである。

従来、シュークロース・ホスホリラーゼは、例えば、ロ
イコノストック属又はシュードモナス属の細菌を培養し
、菌体よりシュークロース・ホスホリラーゼを分離、精
製することにより製造されており〔アドバ・アプル・マ
イクロパイオル（Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、）第３２巻、第１６３〜２ｏ１頁（１９８７年
）〕、また、近年虫歯菌の一種であるストレプトコツカ
ス属の細菌がシュークロース・ホスホリラーゼを産生ず
ることも確認されている〔インフエクション・アンド・
イミユニティ（■口ｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ）　、第５６巻、第２７６３〜２７６５頁（１
９８８年）〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらの細菌を用いて、シュークロース
・ホスホリラーゼを製造する場合には、該酵素の収率が
著しく低い等の問題点があった。

そこで本発明者等は、上記問題点を解決すべくシューク
ロース・ホスホリラーゼを遺伝子工学的手法により高収
率で製造すべく鋭意研究を行った。

その結果、シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含
有するＤＮＡを調製し、これをベクターＤＮＡに挿入し
、該組み換え体ＤＮＡにより形質転換された微生物を用
いることによりシュークロース・ホスホリラーゼを高収
率で生産できることを見い出し、先の出願（特願平２−
１４５３６７号）行った。

その後、本発明者等は、ロイコノストック・メセンテロ
イデス由来のシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子に
ついて更に検討した結果、ロイコノストック・メセンテ
ロイデス由来のシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子
を初めて単離及び構造決定することに成功し、本発明を
完成した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち本発明は、下記の制限酵素地図を有し、かつ分
子量１８００ｋｄを有するシュークロース・ホスホリラ
ーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片である。

（本頁以下余白） 示す。） 更に本発明は、下記に示されるアミノ酸配列をコードす
るシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子である。

Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ １１ｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒ。

Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ １１ｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　ＡｓｐＴｒｐ　Ａｌａ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ １１ｅ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　　ｌ１ｅ Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ Ａｓｎ　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　Ａｓｐ Ｈｌｓ　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ａｒｇ Ａｒｇ　Ｖａｌ Ａｓｐ　Ｖａｌ Ｌｅｕ　Ｍｅｔ Ｓｅｒ　Ａｒｇ Ａｓｎ　ｌ−１１ｓ　　ＡＳｐ　　ＡＳｆｌｅｒ Ｌ５’Ｓ ｉ’ｙｒ　ｔ、ｙｓ ＡＳｐ Ｐｈｅ ＡＳｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＡＳｐ １１ｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡＳ９　ＡＳｐ　Ｇｌｕ更に
、 本発明は下記の塩基配列で示される シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子である。

ＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴ
ＴＧＡＴＣＡＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＴＧＧＧ
　ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡ　ＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣ
ＡＡＧＴＣＴＴＴＣＡＣＣＴＡＴＧＡ　ＣＴＴＴＧＣＡ
ＴＴＡ　ＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡ　ＣＧＣＴＴＴＡＣＡＣ
以下、 本発明の詳細な説明する。

先ず、シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含有す
るＤＮＡの調製について述べる。

シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含有するＤＮ
Ａのドナーとしては、それを含むものあればいかなるも
のでもよく、例えば、乳酸菌ロイコトスドック・メセン
テロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１２２９１等が挙げられ、この微
生物をメソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　Ｖｏｌ、１第２２
７〜第２２８頁（１９５５）記載の方法と同様にして培
養し、培養菌体を得る。

この菌体より、例えばカレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）　ｕｎｉｔ　２．４．３、（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌ
ｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、　１９８７）記載の方
法により、培養物を集菌し、ＳＤＳ存在下でプロティナ
ーゼに処理を行い、その後ヘキサデシルメチルアンモニ
ウムブロマイド、クロロホルム処理後エタノール沈澱を
行って染色体ＤＮＡを得ることができる。

次いで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばＥｃｏＲ［（ベーリンガー・マンハイム
・山之内社製）を、温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７
°Ｃで１〜２時間作用させて消化し、染色体ＤＮＡ断片
混合物を得る。この染色体ＤＮＡ断片混合物の中から、
精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配列により推測されるＤＮ
Ａ混合配列を基にしたＤＮＡプローブを用いて、コロニ
ー・ハイブリダイゼーション法〔モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第３
１２頁〜３２８頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＸ１９８２年）〕により、目的の
シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を得ることがで
きる。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａはいかなるものでもよく、例えば、プラスミドベクタ
ーＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ等が挙げられるが
、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ
　（宝酒造社製）等か好ましい。

上記ベクターＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、
例えばＥｃｏＲＩ　（ベーリンガー・マンハイム・山之
内社製）を温度３０°Ｃ以上好ましくは３７°Ｃで１時
間以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断
されたベクターＤＮＡを得る。

次いで、上記のようにして得た、乳酸菌Ｌｅｕｃ。

ｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ＡＴＣＣ
１２２９１由来で、シュークロース・ホスホリラーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物及び切断
されたベクターＤＮＡを混合したものに、例えば、大腸
菌ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イングランド・バイオ・ラ
プス社製）又はＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム山之内社製）等、好ましくはＴ４ＤＮＡリガー
ゼを温度４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃで１時
間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体
ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて適当な宿主微生物、例え
ば大腸菌に−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０１（ＡＴ
ＣＣ３３８７６）　、大腸菌ＨＢ　１０１（ＡＴＣＣ３
３６９４）、大腸菌Ｄ　Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９）等
を形質転換して夫々の菌株を得る。この形質転換は、常
法により行えば良く例えばデイ−・エム・モーリソン（
Ｄ、　Ｍ、　Ｍａｒ−ｒｉｓｏｎ）の方法〔メソズ・イ
ン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）　、第６８巻、第３２１〜３２６頁（
１９７９年）〕等により行うことができる。

次いで、上記形質転換に供した微生物よりシュークロー
ス・ホスホリラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニン
グすることにより、シュークロース・ホスホリラーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、シュークロース・ホ
スホリラーゼ生産能を有する微生物を得ることができる
。

このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、エイッチ・シー・
バーンボイム（ＨｏＣ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）等の方法〔
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ）　、第７巻、第１５１３〜
１５２３頁（１９７９年）〕等により培養菌体を集菌し
、リゾチーム溶菌後、アルカリ処理し、中和してエタノ
ール沈澱処理して得ることができる。

次いで、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素ＨｉｎｄＩ［を温度３０″Ｃ以上、好
ましくは３７℃で１〜４時間、好ましくは約３時間作用
させ、ＤＮＡ断片混合物を得る。

上記ＤＮＡ断片混合物よりシュークロース・ホスホリラ
ーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを単離するには、モレキュ
ラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、第１５６〜１６１頁、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）記載の方法により
得ることができる。

上記シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡを用いて、実施例の項目（６）に示すようにスプ
リング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メソッズ・イン・エ
ンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）第１０１巻、第２０〜７８頁（１９８３年）
〕によってシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子のみ
の全塩基配列の解析を行い（第２図参照）、次いで前記
塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペブタ
イドのアミノ酸配列を確定する（第２図参照）。

上記のようにして得られたシュークロース・ホスホリラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含みシュークロース
・ホスホリラーゼ生産能を有する微生物、特にエッシエ
リヒア属に属する菌株を用いてシュークロース・ホスホ
リラーゼを生産するには、下記のように培養し、培養物
を得る。

すなわち、上記微生物を培養するには、通常の固体培養
法で培養してもよいが、好ましくは液体培養法を採用し
て培養する。

また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィーブリカーあ
るいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素
源に、例えばリン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の
無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料
、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、通気攪
拌深部培養、振どう培養、静置培養により実施するのが
好ましい。

培養終了後、該培養物よりシュークロース・ホスホリラ
ーゼを採取し、分離精製するにはメンズ・イン・エンサ
イモロジー（（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−
１ｏｇｙ）第１巻、第２２５〜２２９頁（１９５５年）
〕記載の方法即ち、培養物を集菌及び溶菌処理し、プロ
タミン処理して除核酸を行い、硫安分画後ゲルろ過及び
イオン交換クロマトグラム処理を行うことにより精製可
能である。

上記精製手段により得られる精製シュークロース・ホス
ホリラーゼの理化学的性質は、〔アドバ・アブルー？イ
クロバイオル（Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ）、第３２巻、第１６３〜２０１頁（１９８７年）
〕記載のシュークロース・ホスホリラーゼの理化学的性
質と全く同様である。

〔発明の効果〕 本発明のシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含有
するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した新規な組み換え
体ＤＮＡにより形質転換又は形質導入された微生物のシ
ュークロース・ホスホリラーゼの生産能は極めて高く、
該微生物を培地に培養することにより、該酵素を高収率
で得ることが可能となり、本発明は産業上極めて存用な
ものである。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

〔実施例〕

（１）染色体ＤＮＡの調製 乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ１
２２９１を培地〔１％トリプトン（デイフコ社製）。

１％イースト・エキストラクト（デイフコ社製）、０．
５％に、ＨＰＯ４，１％シュークロース、　　０．００
１％チアミン・塩酸、０．０４％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
，０，００１％Ｆｅ５Ｏ４”　７ＨｚＯ，０，０２％Ｍ
ｎＳＯ４”　４Ｈ２０，０，００５％アスコルビン酸〕
　１１に接種し、温度３０°Ｃで２日間静置培養して、
培養物を得た、この培養物を５．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ
、で１５分間遠心分離処理した後、該菌体からカレント
・プロトコールズ・イン・モレキュラー〇バイオロジー
（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｇｙ）　ｕｎｉｔ２．４．３　（
Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ。

１９８７）記載の方法により、染色体ＤＮＡ　１００μ
ｇを抽出して得た。

次いで、この染色体ＤＮＡｌ０μｇおよび制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ　（ベーリンガー・マンハイム山之内社製）２０
ユニツトを、５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（１００ｍ
ＭＮａＣｔ、　　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　　１ｍＭジ
チオスレイトール含有、ｐＨ７，４）に夫々混合し、温
度３７°Ｃて１時間反応させた。反応終了液を常法によ
り、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理して、
ＥｃｏＲＩで消化された乳酸菌ロイコノストック・メセ
ンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株の染色体ＤＮＡ断片
８μｇを得た。

（２）プラスミドベクターｐＢＲ３２２を利用した乳酸
菌染色体ＤＮＡライブラリーの作製 プラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造社製）　１０
μｇ及び制限酵素ＥｃｏＲＩ　（ベーリンガー・マンハ
イム山之内社製）２０ユニツトを５０ｍＭ　）リス−塩
酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ
＜、　　１　ｍＭジチオスレイトール含有、ｐＨ７，４
）に混合し、温度３７°Ｃて２時間反応させて消化液を
得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
澱処理した後、このＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡ断片
が再結合することを防止するするために、モレキュラー
・クローニング（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、第１３３〜１３４頁（１９８２年）コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−〕記載の方法で、バ
クチリアル・アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）
処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によ
りフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理して
、ＥｃｏＲＩで消化されたプラスミドベクターｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　８μｇを得た。

次いで、このＥｃｏＲＩで消化されたプラスミドベクタ
ーｐＢＲ３２２２μｇ１上記項目（１）で得られたＥｃ
ｏＲＩで消化された乳酸菌ロイコノストック・メセンテ
ロイデスＡＴＣＣ１２２９１株の染色体ＤＮＡ断片４μ
ｇ及び２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム山之内社製）を、６６ｍＭ　ＭｇＣＬ、１
０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ　ＡＴＰを含有
する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加
して、温度１６°Ｃで１６時間反応させてＤＮＡの連結
反応を行った。

この反応液を用い、ジャーナル・オプ・バクテリオロジ
−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）、第１１９巻、第１０７２〜１０７４頁（１９７４年
）記載の形質転換法により、大腸菌Ｄ　ＨＩ　（ＡＴＣ
Ｃ３３８４９）を形質転換し、ＬＢ−ａｎｐ培地〔バク
トドリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ
／ｖ）、　ＮａＣ１ｆｆ、５％（ｗ／ｖ）、　　アガー
１．２％（ｗ／ｖ）、及びアンピシリン５０（μｇ／ｍ
１））プレート上で生育するコロニーを約６．０００個
を得、これをライブラリーとして使用した。

（３）シュークロース・ホスホリラーゼ）遺伝子Ｎ末側
を含む組み換え体プラスミドｐｓＰＬＯ２Ｄ　ＮＡの作
製 乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ１
２２９１株のシュークロース・ホスホリラーゼの精製方
法はメンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔ−ｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、第２２５
〜２２８頁（１９５５年）に記載されている。この方法
により、電気泳動的に均一に精製された蛋白を気相プロ
ティン・シークエンサー（アプライド・バイオ・システ
ムズ社製、４７３Ａ型）により、Ｎ末端アミノ酸配列３
０残基を決定した。この中にＭｅｔ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
Ｇｉｎ−Ａｓｎプローブとして、ＳＰＬ遺伝子のスクリ
ーニングを行った。

この１７塩基の２４通りのミックスオリゴヌクレオチド
をＤＮＡ合成機〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社製〕
を用いて合成し、この２０ｎｇのオリゴヌクレオチドの
５′末端を（”Ｐ）　ＡＴＰ（アマジャム社製）を用い
て、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１２２〜１２６頁、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ（１
９８７年）記載の方法に従って標識した。

上記の方法で調製したｔＰで標識したＳＰＬ蛋白Ｎ末端
アミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列に相当するオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用い、項目（２）で作製し
たプラスミドベクターｐＢＲ３２２をベクターとする乳
酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ１２
２９１株染色体ＤＮＡライブラリーをコロニー・ハイブ
リダイゼーション法〔モレキュラー・クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３１２〜３
２８頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ
−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）〕で検索し、ＳＰＬ遺伝
子Ｎ末端を有するコロニーを得た。該コロニーからモレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）　、第８６〜９４頁、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２年）
）記載の方法に従って、組み換え体プラスミドを１１よ
り３５０μｇ得、この組み換え体プラスミドＤＮＡをｐ
ｓＰＬＯ２と命名した。

このｐｓＰＬＯ２の５ａｕ３Ａ　Ｉ消化物の１％アガロ
ースゲル電気泳動後、ニトロセルロースフィルターへ転
写し、前記Ｎ末端アミノ酸配列に対応する２４通りミッ
クス合成オリゴヌクレオチドＤＮＡをプローブとして用
い、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー（ＣＰ　ｉｎ　Ｍ　Ｂ）（Ｊｏｈｎ　Ｗｉ
ｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）記載の方法に従い、サザン・
プロット・ハイブリダイゼーションを行った。

その結果、Ｈｉｎｄ　ｌｌ−３ａｕ３Ａ［２５０ｂｐ中
にＳＰＬ構造遺伝子のＮ末端か存在することが判明した
。そこでこの２５０ｂｐ　Ｈｉｎｄ　ＩＩ［−３ａｕ３
ＡＩ断片の塩基配列をシーケネースキット（東洋結社よ
り入手）により行い、Ｎ末端ｌＯアミノ酸配列に対応す
るＤＮＡ塩基配列−が存在することを確認した。

（４）シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子Ｃ末端側
を含む組み換え体プラスミドｐｓＰＬＯ９の作製 前項目（３）で得られた組み換え体プラスミドｐＳＰＬ
０２ＤＮＡは、サザン・プロット・ハイブリダイゼーシ
ョン及び塩基配列の解析からＳＰＬ遺伝子Ｎ末端側約１
．１ｋｂを含むＤＮＡ挿入断片を有している。

ＳＰＬ遺伝子は分子量５５０００より換算して約１．６
ｋｂであり残り約０．５ｋｂが必要である。

ｐｓＰＬＯ２Ｄ　Ｎ　ＡのＳＰＬ構造遺伝子の一番Ｃ末
側５ａｕ３ＡＩ−ＥｃｏＲＩ　３５０ｂｐ断片をプロー
ブとして用い、再度コロニー・ハイブリダイゼーション
を〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）第３１２〜３２８頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）〕記
載の方法により行い、５株ポジティブ・クローンを得た
。

先ずバンクの作製方法を以下に述べる。

プラスミドベクターＤＮＡ　ｐＵｃ１１９（全酒造社製
）５μｇ及び制限酵素…旧（全酒造社製）　１０ユニツ
トを２Ｏｎ＋Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｌｏｏｍＭ　Ｋ
ＣＩ、　１０ｍＭＭｇＣ１ｚ、　１　ｍＭジチオスレイ
トール、ｐＨ８，５）に混合し、温度３７°Ｃで２時間
反応させて消化液を得、酸液を常法によりフェノール抽
出及びエタノール沈澱処理した後、このＢａｍＨＩで消
化されたＤＮＡ断片が再結合することを防止するために
、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、１１３３〜１３４頁コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）記載の
方法でバクチリアル・アルカリ・フォスファターゼ（Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔ
ａｓｅ）処理によりＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常
法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処
理して、…ＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵｃ
１１９ＤＮＡを３μｇ得た。

次に（１）で得られた乳酸菌ロイコノストック・メセン
テロイデスＡＴＣＣ１２２９１染色体ＤＮＡｌ０μｇ及
び制限酵素５ａｕ３Ａ　Ｉ　（全酒造社製）２０ユニツ
ツを５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ
１，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ。

１ｍＭジチオスレイトール、　ｐＨ７，５）に混合し、
温度３７°Ｃ２時間反応させたのち、常法により、フェ
ノール抽出及びエタノール沈澱処理して５ａｕ３ＡＩで
消化された乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデス
ＡＴＣＣ１２２９１株の染色体ＤＮＡ７μｇを得た。

次いで、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミド・ベクター
ｐＵｃ１１９Ｄ　Ｎ　Ａ　３μｇ、鋤３ＡＩで消化され
た乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ
１２２９１採集色体ＤＮＡ５μｇ、及び２ユニツツのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム・山之内社
製）を６６ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　１０ｍＭジチオスレイ
トール及び１０ｍＭ　ＡＴＰを含有する６６ｍＭ　トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し、温度１６°Ｃ
で２時間反応し、ＤＮＡの連結反応を行った。

この反応液を用い、項目（２）と同じようにして大腸菌
ＪＭＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、コロ
ニを約１０．０００個を、このライブラリーの中よりｐ
ｓｐｔ。

０２ＤＮＡのＳＰＬ構造遺伝子の一番Ｃ末側５ａｕ３Ａ
■−ＥｃｏＲＩ　　３５０ｂｐ断片をプローブとして用
い、再度コロニー・ハイブリダイゼーションを〔モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）第３１２〜３２８頁、コールド・スプリング・
ノ＼−バー・ラボラトリ−（１９８２年）〕記載の方法
により行い、５株ポジティブ・クローンを得た。

該コロニーから、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第８６〜９４頁、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９
８２年）記載の方法に従って、組み換え体プラスミドを
ｌｉ？培養より、７００μｇを得、この組み換え体プラ
スミドＤＮＡをｐｓＰＬＯ９と命名した。

この組み換え体プラスミドｐｓＰＬＯ９は、ｐｓＰ、Ｌ
Ｏ２ｃ末側約３５０ｂｐの５ａｕ３Ａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ
断片を重複し、ＳＰＬ遺伝子Ｃ末側約８５０ｂｐを含有
する、挿入断片約２．Ｏｋｂの組み換え体プラスミドで
ある。

（５）シュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子全領域を
含む組み換え体プラスミドＩ）ＳＰＬＩＯＤ　Ｎ　Ａの
作製 項目（３）で得られた組み換え体プラスミドＤＮＡｐｓ
ＰＬＯ２Ｄ　Ｎ　Ａ　２０μｇ、制限酵素均透Ｒ１及び
均佳１（共に宝酒造社製）夫々３０ユニツツを５０ｍＭ
　）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１，ｌｏｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７，
５）に混合し、温度３７°Ｃ３時間反応させたのち、〔
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）　、第１５６〜１６１頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年））記
載の方法により０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気
泳動処理を行い、約４．９ｋｂ　ＤＮＡ断片を含むゲル
部分をゲルより切り出して透析チューブに入れ、２ｍｌ
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　トリス・塩酸、　１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ。

ｐＨ７，５）を加えた後、透析チューブをシールし、電
気泳動により、ゲル中から緩衝液中にＤＮＡを溶出した
。この溶液をフェノール抽出及びエタノール沈澱を行い
、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　１４．９ｋｂ断片約８μｇを
得た。

次いで、項目（４）で得られた組み換え体ＤＮＡｐＳＰ
Ｏ９ＤＮＡ２０μｇ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌ
（共に宝酒造社製）夫々３０ユニツツを５０ｍＭ　トリ
ス−塩酸酸（１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７，５）に混合
し、温度３７°Ｃ３時間反応させたのち、上記の如く、
アガロースゲル電気泳動、透析チューブ中でのＤＮＡ断
片抽出及び精製を行い、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ　１．７
ｋｂ断片約５μｇを得た。

上述のように得られたＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ　４．９ｋ
ｂ断片５μｇ、　１．７ｋｂ断片５μｇ及び２ユニツツ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山
之内社製）を６６ｍＭ　ＭｇＣＬ、　１０ｍＭジチオス
レイトール及び１０ｍＭ　ＡＴＰを含有する６６ｍＭ　
トリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ７，５）に添加し、温度１
６°Ｃで１７時間反応し、ＤＮＡの連結反応を行った。

この反応液を用い、項目（２）と同じようにして大腸菌
ＤＨＩ（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換し、該コロニ
を得、この菌株の含有する組み換え体プラスミドＤＮＡ
をｐｓＰＬｌｏと命名した。このようにして得られた大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨＩ（ｐｓＰＬｌｏ）は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１４２１号
（ＦＥＲＭＰ−１１４２１）として寄託されてし）る。

また、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ（ｐｓＰＬｌｏ）を
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）　、第８６〜９４頁、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２
年）記載の方法に従って、１１培養より組み換え体プラ
スミドｐｓＰＬ１０を４３０μｇ得た。この組み換え体
プラスミドｐｓＰＬ１０は、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ
　−Ｐｓｔ　Ｉ　２２２０ｋｄとｔ、ｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｎｏｉｄｅｓ染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　
１８００ｋｄが連結されたものである。組み換え体プラ
スミドｐｓＰＬｌＯの制限酵素地図は第１図の通りであ
る。

この大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＨＩ（ｐｓＯＬｌｏ）
を１ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＴ−Ｙ培地〔トリプトン１％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及びＮａＣ
１（ｗ／ｖ））　１０ｍ１中で温度３７°Ｃで８時間振
どう培養したのち、遠心分離により集菌し、超音波処理
して得な粗酵素液のシュークロース・ホスホリラーゼ酵
素活性は、０．６４Ｕ／ｍｌであった。

なお、比較のため、プラスミドＩ）８Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　
Ａ（宝酒造社製）を有する大腸菌ＤＨＩ（ＡＴＣＣ３３
８４９）を用いた場合は、上記と同様にしてシュークロ
ース・ホスホリラーゼ活性を測定した結果、酵素活性は
検出されなかった。

（６）乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴ
ＣＣ１２２９１由来のＳＰＬ遺伝子の塩基配列の解析 項目（５）で得られた組み換え体プラスミドｐｓｐｔ、
ｔ。

ＤＮＡ１０μｇ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ　（宝酒造
社製）２０ユニツツを２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（
１００ｍＭ　ＫＣＩ。

１０ｍＭ　ＭｇＣＬ、　　１　ｍＭジチオスレイトール
、　　ｐＨ８，５）に混合し、温度３７°Ｃ３時間反応
させたのち、文献〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌａｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１
頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
１９８２年）〕記載の方法により、０．７％（Ｗ／Ｖ）
アガロースゲル電気泳動処理を行う。この電気泳動処理
したゲルより約１．８ｋｂＤＮＡ断片を含む部分を切り
出して透析チューブに充填し、２ｍｊ’ＴＥ緩衝液（１
０ｍＭ）リス−塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５
）を加えた後、該透析チューブをシールし、電気泳動に
よりゲル中から緩衝液中にＤＮＡを溶出した。この溶液
をフェノール抽出及びエタノール沈澱を行い、Ｈｉｎｄ
Ｉ［１，８ｋｂ断片約２．５μｇを得た。

次いで、上記ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１１９ＤＮ
Ａ　（宝酒造社製）の旧ｎｄＩ［部位にクローニングし
、ＳＰＬ遺伝子の挿入方向の違いにより得られたプラス
ミドＤＮＡを夫々ｐｓＰＬ１１及びｐｓＰＬＩ　ＩＲと
命名した。

次いで、組み換え体プラスミドｐｓＰＬ１１及びｐｓｐ
ｔ。

１１ＲＤＮＡを用いてキロシーフェンス用欠失キット（
宝酒造社製）を用い、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｓｓ）の
方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　、第２８巻、第３５１〜３
５９頁（１９８４年）〕に従い、ＳＰＬ遺伝子に種々の
欠失か導入されたプラスミドＤＮＡを作製し、項目（２
）と同じようにして大腸菌ＪＭＩＱＩ（ＡＴＣＣ３３８
７６）に形質転換した。このようにして得られた大腸菌
にヘルパー・ファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造社製）を感
染させることにより、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の
方法〔メンズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　ＥｎＺｙ−ｍｏｌｏｇｙ）第１０１巻、第２
０〜７８頁（１９８３年）〕に従って１本鎖ＤＮＡを調
製した。得られた１本鎖ＤＮＡによるシーフェンシング
はＭＩ３シークエンシング・キット（宝酒造社製）を用
いて上記メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法に従い行
った。塩基配列のだめのゲル電気泳動は８％（Ｗ／Ｖ）
ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。

得られたロイコノストック・メセンテロイデス由来のＳ
ＰＬ遺伝子の全塩基配列を第２図に、また、該塩基配列
から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を第３図
に夫々示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐｓＰＬ１０Ｄ　Ｎ　
Ａの制限酵素開裂地図を示す図であり、第２図は実施例
のシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子の全塩基配列
を及びそれに対応するアミノ酸配列を示す図である。 手 続 補 正 書 平成　３年 ５月２０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の制限酵素地図を有し、かつ分子量１８００ｋ
   ｄを有するシュークロース・ホスホリラーゼ遺伝子を含
   有するＤＮＡ断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｅは￥Ｅｃｏ￥Ｒ I 、Ｈは￥Ｈｉｎ￥ｄIII、
   Ｒは￥Ｒｓａ￥ I 、Ｓは￥Ｓｃａ￥ I 、Ｑは￥Ｔａｑ
   ￥ I 、Ｔは￥Ｅｃｏ￥Ｔｌ４ I 、Ｖは￥Ｅｃｏ￥ＲＶ
   を示す。） ２、下記に示されるアミノ酸配列をコードするシューク
   ロース・ホスホリラーゼ遺伝子。【遺伝子配列がありま
   す】 【遺伝子配列があります】 ３、下記の塩基配列で示されるシュークロース・ホスホ
   リラーゼ遺伝子。 【遺伝子配列があります】