JPH0476001A - 機能化高分子の合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業−にの利用分野） 本発明は、品分ｊ″−化合物よりなる担体に各種の官能
基または機能性分子を導入し７た機能化高分子およびそ
の合成方法に関する。本発明にかかる機能化高分子・は
、イオン交換体、固定化酵素、固定化抗体、アフィニテ
ィ担体、選択的・ｒオン親和性高分子等とし７て、ｈ種
化学物質の製造、染色、精製・分離、生化学、環境保全
、生命科学関連、その他多くの技術分野においで幅広く
利用可能である。

（従来の技術） セルロースその他の高分子−担体に各種の官能基または
機能性分子を導入した機能化高分子は生命科学関連研究
室や産業界で正装な地位を占めている。ジエチルアミノ
エチル（ＤＥＡＥ）、　　カルボキンメチル（ＣＭ）等
を共有結合させたセルロース、セファデックス（架橋デ
キストラシ）、セファ０−ス（スウェーデン・国、ファ
ーマシア・■、ＫＢ社製、架橋アガロースの商品名）等
はイオン交換体として蛋白質や核酸の精製に、或はクロ
マ［・クラーノ、イー用担体どし、て化学分析用（−垂
耳１されている。高分子担体に６種リカシト分子・訊−
共ソＪ゛結合さぜたアフィニティ担体、高分子−担体に
各種の酵素蛋白を共有結合させた固定化酵素、各種抗体
を共存結合させた固定化抗体の開発等その用途は広かろ
一方である。

機能化高分子をｔ）成ずろには共イ］結ｉ）させるリガ
レト゛分子よたはｉｈ白によりそれぞ木（独特の反応条
件か必要である。ＤＥＡＥやＣＭなとは強アルカリ条件
下で共有結合できるか、アノ１．カリ耐性のないリガン
ドや蛋白では分解ない１．変成を防ぐため温和な条件か
必要どさ第１る。よく用いら１１ろ現行方法はシアノケ
シＴｆｒＵミド法て、高分子担体のヒドロキシルブトを
シアノ）７’シブＬｌ　’ｆ、　Ｉｓとの反応でイミド
カルボン酸に変換したのちアミ、７基をもつｊｈント分
イよＬこは蛋白と冷時反１１Ｌ、さ仕るｈ′法である（
Ｎａｔｕｒｅ、　２１４巻、　　１３０２−１３旧頁、
　　＋９６７）。

し２かしこの方法では揮発性でｆ１毒なシアノチンプロ
ミドを使用するうえ、導入した１１カントまたは蛋白は
不安定なイソウレイド結合によ１つ高分子担体と結合し
ているためリーキー（１，ｅａｋ＼・）で、長期反復使
用中に少しずつ溶離する（Ｒｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｔｎｍｕｎ、７０巻、８１４頁、１９７
６）　。特に、求核試薬の存在下での溶離か著（バ、ア
ミノ基をもつ緩衝液の使用には不適である。−′ア、ノ
ゲン＝ノロミド法以外にもいろいろな担体結合法か提案
されているか、多種多様なりガント、蛋白すへてに応用
できる一般的方法は確立されていない。

（発明か解決しようとする課題） 本発明者等は−に述の問題点を解決す一＼く鋭意研究を
爪ねた結果、高分子担体のノ１０ケン誘導体かアミノ基
を有する分子にｔｔ　Ｌ強い反応性をもら、温和な条件
下で脱ノ＼ロケノ化水素反応をおこして高分子担体とリ
ガンドまたは蛋白分子との共有結合体か合成されること
を知見し、本発明を完成した。

即ち、本発明の［Ｊ的は、高分子化合７物担体に機能性
を有するりガント分子または蛋白等を同一条件下で共有
結合させるとともに、−旦導入したリカンド士たは蛋白
か反復使用中に溶離する、二とのない安定な機能化高分
子化合物を提供するにある３、（課題を解決する〕＝め
の手段） 上述の目的は、ヒドロキシル基を有する高分子化合物を
ハロゲン誘導体に変換したのち、アミノ基含有リガンド
分子、メルカプ１−基含有リガンド分子および亜リン酸
エステルよりなる７７子から選ばれた少なぐとも１種の
機能性化合物と力・ツブリングさせる二とによって達成
される。

上記機能性化合物かアミノ基含有リガンド分子−である
場合にはカップリングを常温で行う５−とができるので
好適である。

ヒ１〜ロキノＪｋを有する高分子化合物か多糖類、その
誘導体または架橋体或はポリヒニルアルコールまたはそ
の架橋体或はそれらの混合物の２，３ジブロモプロピル
誘導体または３−ブロモ−２ヒドロキシプロピル誘導体
は、上記アミノ基またはメルカプト基を仔するリガンド
分子或は亜リン酸エステルと強い反応性を示すので特に
好ましい。

十記多糖類お。トびその誘導体かセルロースおよびその
誘導体である場ａには、し・ルロース担体は粉末状、繊
維状、布状、フィルム状、シー１〜状等各種の形態に形
成する二とができ、広汎な応用か可能となるので好まし
い。

上記ヒドロギシ基を有する高分子−化合物が多糖類であ
る場合に、該多糖類かセファデックス、セファロース等
の架橋多糖類であると、利用価値の高い４に酸物か得ら
れる。

また、アミノ隻Ｎ有りガント分子かアンモニア、脂肪族
おＦび芳香族の環状または線状第１アミン、第２アミン
、ジアミン、ポリアミンおよびアミノ酸よりなる群から
選はねた少なぐとも１種の機能性化合物であれは、特に
奸才しい。

γミノ基含有リガンド分子か補酵素、ポリペプチド、蛋
白質よりなる群から選ばれた少なくとも１種の機能性化
合物であると有用な機能化高分子を４手える。

このようにして得られた本発明機能化高分子は、高分子
担体上の酸素原子と機能性リガンド分子上のチ・ソソま
たは硫黄原子とが２−ヒドロキシ１．１メチＩ／ン基ま
たは２−ハロトリメチレン基を介して結合してなること
を特徴とする。

（作　用） 以下、本発明の構成をその作用と共に詳述する。

本発明機能化高分子を製造するには、まず、高分子担体
のヒト１１キシル基に二重結合を導入する。

例えはセルロースの場合、マーセル化したアルカリセル
ロースを２−プロパツール溶媒中で塩化アリルと還流す
ることにより簡単にアリル誘導体を作る二とができるが
、他の７−ロケン化アリルまたは他の二重結合試薬を用
いてもよいし、ジメチルスルホキッド等の溶媒中で反応
させてもよい。

二重結合を導入したアリルセルロースは室温で臭素の水
酸化すトリウム溶液又は臭素のアルコール溶液に数分浸
すことにより簡単に２，３−ジブロモプロピル誘導体に
変えることができる。臭素と水酸化すｈ　ＩＪウムの割
合を次亜臭素酸すトリウムが生成する組成に混合した溶
液を反応させれば３ブロモ−２−ヒドロキシプロピル（
ブロモヒトＪン）誘導体に変えることもできる。塩素、
ヨウ素、次亜塩素酸、次炬ヨウ素酸等との反応では相当
するジクロロプロピル、ンヨードブロピル、クロロヒド
リン、ヨードヒドリン誘導体等に変える二とができる。

この中でジブロモプロピル誘導体とブロモヒドリン誘導
体は比較的安定で、長期の保存か可能であるか、直ぢに
次のカップリング反応に進むこともてきる。ジブロモプ
ロピル誘導体またはブロモヒドリン誘導体をアミノ基を
もつりガント分子、ペプチドまたは蛋白の微アルカリ性
水溶液またはりガント分子か液体の場合はその液体分子
に浸して数時間放置すれはアミノ基と臭素誘導体からの
脱臭化水素反応か進行し、リガンド分子、ペプチドまた
は蛋白は高分子担体にカップリングして機能化高分子か
合成される。このカップリング゛反応の条件はアミノ基
をもつ分子に対し共通で、高温圭たは強アルカリを要し
ない。このようなマイルドな条件下てあらゆる種類のア
ミノ化合物を高分子担体に共有結合させることが本発明
の特長である。この方法のうち、ハロゲン誘導体か、２
，３−ジブロモプロピル誘導体である場合の反応経路は
次に示す化学式て表される。

高分子担体−ＯＨ ↓　Ｎａ、Ｏｌ（ 高分子担体−０Ｎａ ↓　　Ｃｆｆ　ＣＨ２−Ｃ［（＝　ＣＩ（２（還流）高
分子担体−ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝　ＣＨ２↓　　Ｂｒ２ 高分子担体−０−ＣＨ，、−ＣＨＢｒ−ＣＨ２Ｂｒ↓　
Ｉｔ、Ｎ−Ｒ 高分子担体−ＯＣＨ２ＣＨＢｒ　　ＣＨ２ＮＩ（Ｒ即ぢ
、本発明による機能化高分子の合成方法は、−旦高分子
担体のジブロモプロピル誘導体またはブロモヒドリン誘
導体を調製すれは、これがアミノ基をもつあらゆる分子
に対し、室温、微アルカリというマイルドな条件下、脱
ハロゲン化水素反応を起こしてカップリングするという
特性を巧みに利用したものである。有機化合物の）１０
ケン誘導体とアミンの脱ハロゲン化水素によろ縮合反応
は、ハロゲンかカルボニル基に隣接するクロロアセチル
、ブロモアセチル等の場合を除けば一般に高温または有
機溶媒を必要とし、マイルドな条件では進行しないもの
と思われていた。しかし、後述の多数の実施例で示され
るように、ジブロモプロピルセルロースまたはブロモヒ
ドリンセルロースとアミンからの脱臭化水素によって代
表される脱ハロゲン化水素による縮合は、高温、強アル
カリを必要とせず、速やかに進行する。これは従来の一
般的知識からは推測できなかった驚くべき現象である。

そこで、単純な脂肪族アミン、芳香族アミンのほか、補
酵素、ペプチド、蛋白等各種のアミンをリガンドとして
ジハロプロピル誘導体、特にジブロモプロピル誘導体、
またはハロヒドリン誘導体、特にブロモヒドリン誘導体
、とのカップリングをすべてマイルドな条件で行うこと
ができるとともに、低温では反応の進行しないメルカプ
ト基をもつ分子に対する反応条件も検討した結果、広範
囲のリガンド分子を高分子担体に共有結合させる一般的
方法として本発明は優れた作用を発揮する。

（実施例） 以下、実施例によって本発明の詳細な説明する。

製造例 粉末セルロース（濾紙粉末）をマーセル化したのち塩化
アリル２０重量％と２−プロパツール８０重量％の混合
溶液に懸濁させ還流冷却器のもとて還流させた。クルコ
ース１００単位に導入されるアリル基の数は９時間で１
７個、２０時間で３６個であった。

粉末状でない脱脂綿、綿布、セロファン等のセルロース
も同様にマーセル化したのちアリル誘導体に変換するこ
とができた。濾紙粉末に比べ綿布では置換度かやや低い
傾向かあった。

得られたアリルセルロースは繰り返し冷水で洗浄して過
剰アルカリや反応試薬を除去した。この段階で真空乾燥
して低温保存してもよいか、直ちにつきのジブロモ化ま
たはブロモヒドリン化のステップに進めてもよい。

ジブロモ化は次のように行った。まず臭素を等モルの水
酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム水溶液に溶かして
臭素溶液を調整するか、臭素のアルコール溶液を調製し
た。これに上記のアリルセルロースを室温で数分間浸す
たけでアリル基は定量的にジブロモプロピル基に変換さ
れ、０−　（２゜３−ジブロモプロピル）セルロースが
得られた。

その元素分析値は次のとおりであった。

分析値：　　Ｃ３５，１７，Ｈ５，１８Ｂｒ　　２４．
１６置換率３６％、試料含水率３重量％とじての計算値
：　　Ｃ３５，２４，Ｈ５，１１Ｂｒ　　２３．８４得
られたジブロモプロピル誘導体はそのまま真空乾燥して
保存してもよいが、直ちに実施例１以降のカップリング
反応に進めてもよい。

ブロモヒドリン化を行う場合は、臭素を２倍モル量の水
酸化アルカリ水溶液に溶かして次亜臭素酸溶液を調製し
、それに前記のアリルセルロースを室温で数分間浸すだ
けでよい。アリル基のブロモヒドリン化により０−（３
−ブロモ−２−ヒドロキシプロピル）セルロースか得ら
れた。

実施例１ アミノ化セルロースの合成 前記製造例で合成したジブロモプロピルセルロースまた
はブロモヒドリンセルロースを、室温ないし高温でアン
モニア水、エタノールアミン、ｌ。

６−ヘキサンジアミン、エチレンジアミン等の脂肪族第
１アミン、ジエチルアミン、ピペリジン、モルフォリン
等の第２アミン、スペルミン、ポリエチレンイミン等の
ポリアミンに浸した。アミンが液体の場合はそのまま用
いてもよいし適度に希釈した溶液でもよい。アミンか固
体の場合は水溶液、アルコール溶液、ピリジン溶液、そ
の他の溶液を用いる。２０重量９６程度の溶液を用い室
温で浸す場合は数時間でよいが、希薄溶液を用いた場合
には浸す時間を長くする。その後セルロース試料を繰り
返し水洗して過剰の試薬を除去した。導入されるアミノ
基の数は主に用いたジブロモプロピル誘導体またはブロ
モヒドリン誘導体の置換度に依存する。得られたセルロ
ース誘導体ミ゛例えば、１、　６−ヘキサンジアミンセ
ルロースの元素分析値を示せは次のとおりである。

分析値　Ｃ４３，９９，Ｈ７，０８゜ Ｎ　　３．１０．　　　Ｂｒ　　８．２９ジブロモ体か
らの置換率７４０６、脱フロモ率２６９６゜試料含水率
３０６としての計算値・ Ｃ！Ｉ３．６３　　　Ｈ６，９２゜ Ｎ　　３．０６．　　　Ｂｒ　　８．７４また、一般に
ジブロモプロピル誘導体の力かブロモヒドリン誘導体よ
り多くの置換基をつ（プることがてきる。合成した誘導
体のうち、ジアミンやボッアミンを結合したセルロース
には銅イオンやデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等に対する
選択的吸着性か認められた。その他の誘導体にもアミノ
基か存在するためイオン交換能や酸性色素に対する顕著
な親和性か認められた。最高のイオン交換能は３．８ミ
リ当量／クラムで、市販のＤＥＡＥセルロースの約１ミ
リ当量／クラムを越えた。

実施例２ セルロースのアミノ酸誘導体 ｍｆ記製造例で合成したジブロモプロピルセルロース１
．０グラムを室温ないし高温でアラニン、アスパラキン
酸等のアミノ酸の微アルカリ性水溶ｉ＆（ｐｒ−ｒ＝Ｉ
Ｉ）に浸した。高温で不安定なアミノ酸を結合させる場
合は、室温付近で反応させた。反応ののち繰り返し水洗
して過剰の試薬を除去することによりアミノ酸の結合し
たセルロース誘導体０．８グラムか得られた。

実施例３ 芳香族アミノセルロースの合成 ０′１１記製造例で合成したジブロモプロピルセルロー
ス１．０クラムをスルファニル酸すトリウム１６９６水
溶液（ｐＨＩｔ）又はアニリンに浸したのぢ繰り返し水
洗して過剰のアミンを除去することにより芳香族アミノ
基の結合したセルロース誘導体０．８５クラムを得た。

芳香族基の導入は赤外分光光度計および元素分析で確認
した。アニｒ）ンセルロースの元素分析の結果は次のと
おりてあった。

分析値　Ｃ３６，５２，Ｈ５，３４ Ｎ　　Ｏ，３９，Ｂｒ　２０．７５ シソロ十体からの置換率２００６、試料含水率３０６ど
しての計ｐ値 Ｃ３７，１９，トｆ　　　　　５．２７Ｎ　　０４０　
　　Ｂｒ　　２１．＝１４以上の実施例１−ｊ３て合成
した各種セルロース誘導体の多くは、セルラーゼに対し
強い抵抗性を示した。

実施例４ ＦＡＤセルロースの合成 前記製造例で合成したジブロモプロピルセルロス１．Ｏ
クラムを室温ないし約４５°Ｃてフラヒンアデニンノヌ
クレオヂト（ＦＡＤ）０．５クラｊ、を含むリン酸三す
トリウム０．０５Ｍ水溶液１０ｍ１に浸したのち繰り返
し水洗して非結合型のＰＡＤを除去することによりＦ　
Ａ　Ｄセルロース０．８グラ１、を得た。

この誘導体は結合フラピンにより黄色に呈色し、フ→ポ
蛋白のアフィニティクロマトクラフィー担体として使用
することがてきた３゜ 実施例５ 一ス綿布を室温ないし高温でニュー１ヘラルレツドまた
はＩ・ルイジンブルー０（両者とも芳香族アミノ基をも
つ色素）の０．２９６水溶液（浴比ｍｇ／ｍｊ）に浸し
たのち酸洗浄、水洗を繰り返して過剰の色素を除去する
ことにより赤または青色に染色されたセルロース綿布か
得られた。この綿布は洗剤の水溶液中で煮沸しても退色
しなかった。

実施例６ 蛋白質固定化セルロース 前記製造例で合成したンブロモブロピルセルロース１６
０グラムを室７品ないし３７°Ｃてすトリウムアジドを
含むシＩ・クロムｃａｂ、　０＋クラ１、のリン酸三す
トリウム０．０５Ｍ水溶液１０ｙｎｌに浸したのち繰り
返し水洗して非結合シ１〜クロムＣ８を除去しシトクロ
ムＣ，セルロース０．８グラムを得た。このシＩ・クロ
ムｃ３セルロースは酵素ヒドロゲナーゼとの反応で、電
子キャリアーとしての生化学活性を保持していた。

ジブロモプロピルセルロース１．０クラムを同様にすト
リウムアジドを含むゲルコアミラー＋′！０．０５’ダ
ラムのリン酸二ナトリウム０．０５Ｍ水溶液１０ｍ１に
浸したのち繰り返し水洗して非結合の酵素を除去するこ
とにより、グルコアミラーゼ固定化セルロース（０，７
５グラム）を合成した。

実施例７ アルキルチオ化セルロースの合成 前記製造例で合成したジブロモプロピルセルロース１．
０グラムをメルカプト酢酸ナトリウム１９％水溶液に懸
濁して４時間還流することにより３カルボキシメチルチ
オ−２−ブロモプロピルセルロース０．８５グラムを合
成した。

実施例８ セルロースのホスホン酸誘導体 前記製造例で合成したジブロモプロピルセルロース１．
０グラムをトリエチル亜すン酸エステルｌＯダラムと還
流することによりセルロースのホスホン酸誘導体０．８
グラムを合成した。

実施例９ セルロース以外の機能化高分子 アリルセファデックス、アリルセファロース、アリル化
ポリビニルアルコールを前記製造例に準じてジブロモ化
したのち、アミノ基をもつ各種リガンド分子（液体また
は溶液）に浸すことにより、セルロースの場合と同様に
リガンド分子を共有結合した機能化高分子を合成するこ
とができた。

（発明の効果） 以上説明したように、本発明方法によれば、導入すべき
機能性分子にアミノ基がある限りすべて同一の温和な条
件で高分子担体に容易に結合されるうえ、導入したリガ
ンドまたは蛋白分子は高分子担体と安定なＣ−Ｎ−Ｃ結
合を形成するため反復使用中に溶離せず、従来技術の問
題点を解消することができた。また、この方法は、上記
以外では、メルカプト基をもつりガント分子や亜リン酸
エステルとの結合にも、反応条件を変えることにより応
用でき、広い用途を開拓することができる。

更に、本発明機能化高分子は、例えば各種セルロース誘
導体について見れば次のような特性を有する。１．６−
ヘキサンジアミン、１．２−エタンジアミン、ポリエチ
レンイミン等を結合したセ−１９＝ ルロース誘導体には、高いイオン交換能、銅イオンに対
する選択的吸着性、酸性色素に対する親和性が認められ
、工業的用途、例えば廃水からの銅イオンの除去・回収
やバイオ産業での抗体や核酸の精製における利用が期待
される。また、合成したセルロース誘導体の殆どのもの
にはセルラーゼ耐性か認められ、セルロース繊維を侵食
する微生物に対する抵抗性が期待される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高分子担体上の酸素原子と機能性リガンド分子上の
   チッソまたは硫黄原子とが２−ヒドロキシトリメチレン
   基または２−ハロトリメチレン基を介して結合してなる
   ことを特徴とする機能化高分子。 ２、ヒドロキシル基を有する高分子化合物をハロゲン誘
   導体に変換したのち、アミノ基含有リガンド分子、メル
   カプト基含有リガンド分子および亜リン酸エステルより
   なる群から選ばれた少なくとも１種の機能性化合物とカ
   ップリングさせることを特徴とする機能化高分子の合成
   方法。 ３、機能性化合物がアミノ基含有リガンド分子であり、
   カップリングを常温で行う請求項２記載の合成方法。 ４、ヒドロキシ基を有する高分子化合物が多糖類、その
   誘導体および架橋体並びにポリビニルアルコールおよび
   その架橋体よりなる群から選ばれた少なくとも１種の高
   分子化合物であり、ハロゲン誘導体が２，３−ジブロモ
   プロピル誘導体または３−ブロモ−２−ヒドロキシプロ
   ピル誘導体である請求項２記載の合成方法。 ５、多糖類およびその誘導体がセルロースおよびその誘
   導体である請求項４記載の合成方法。 ６、ヒドロキシ基を有する高分子化合物が架橋多糖類で
   ある請求項４記載の合成方法。 ７、アミノ基含有リガンド分子がアンモニア、脂肪族お
   よび芳香族の環状または線状第１アミン、第２アミン、
   ジアミン、ポリアミンおよびアミノ酸よりなる群から選
   ばれた少なくとも１種の機能性化合物である請求項２−
   ６のいずれかに記載の合成方法。 ８、アミノ基含有リガンド分子が補酵素、ポリペプチド
   、蛋白質よりなる群から選ばれた少なくとも１種の機能
   性化合物である請求項２−６のいずれかに記載の合成方
   法。