JPH0460640B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は核酸上で起つた突然変異等の塩基配列
の変異を検出する方法に関する。

（従来技術とその問題点） 近年遺伝子工学の進歩に伴ない、動物、植物、
細菌、ウイルス等の生物の遺伝情報が明らかにな
りつつある。特に人間の遺伝子に対する解析は急
速に進んでおり、遺伝病、癌等においては、核酸
の塩基配列のレベルで明らかになつてきている。
その結果ある種の遺伝病では、核酸の塩基配列の
僅か一部分の変異、即点変異によることも知られ
ている。以上の様に、遺伝病等の診断は、核酸の
塩基配列を調査し、正常な塩基配列と比較するこ
とにより可能である。

従来の方法によれば、例えば、まず核酸試料
を、細胞から抽出し、制限酵素により切断し、電
気泳動法等の方法でフラグメントの大きなに分離
する。分離した該フラグメントをサザンブロツテ
イング法に従つてフイルターに固定化、ラジオア
イソトープで標識された核酸プローブとハイブリ
ダイズさせ、そのパターンにより変異の有無を判
定する方法があげられる。また他の方法として、
例えば、核酸試料を直接フイルターに固定化し、
これに、ラジオアイソトープで標識された核酸プ
ローブをハイブリダイズさせ、ハイブリツドの安
定性を測定して変異の有無を判定する方法、ある
いは、核酸試料と核酸プローブをハイブリダイズ
させ、これをフオルムアミド勾配をつけたアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、ハイブリツドの変
性点をオートラジオグラフにより測定して変異の
有無を判定する方法等があげられる。しかしなが
ら、例えば、制限酵素を用いる方法では操作が複
雑で、時間がかかり、また核酸塩基配列の変異が
必ずしも制限酵素による切断パターンとして現わ
れない等の問題点がある。また核酸試料と核酸プ
ローブのハイブリツドの安定性の変化を測定し
て、変異の有無を測定する方法においては、核酸
試料中の変異の有無の検出に先立つて、対照を定
めて、該対照の安定性について検討する必要があ
る。この理由は核酸試料と核酸プローブがハイブ
リツドを形成するための塩基間の水素結合すなわ
ちアデニン−チミンまたはウラシル（Ａ−Ｔまた
はＵ）、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）において、
Ｇ−Ｃ結合はＡ−Ｔ（またはＡ−Ｕ）結合に比べ
強力であり、従つてＧ−Ｃの割合により該ハイブ
リツドの安定性が変化することによる。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは従来技術に見られる問題点を解決
すべく鋭意研究を行つた結果、簡易な操作により
迅速に実施可能で、しかも核酸試料塩基配列中の
変異の有無を判定するための対照を必要としない
方法を完成させた。すなわち本発明は核酸プロー
ブを用いて核酸塩基配列における変異を検出する
方法において、 担体に固定化した核酸試料とそれに対応する
核酸プローブをテトラアルキルアンモニウム塩
溶液中でハイブリダイズさせ、 ハイブリツドを形成しなかつた核酸プローブ
を除去した後 ハイブリツド形成時の温度から０℃〜100℃
の範囲に温度を上昇させて核酸プローブを解離
させ、 解離した核酸プローブを測定する ことを特徴とする核酸塩基配列における突然変異
の検出法に関するものである。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明では、10塩基以上を有する核酸プローブ
を用いることが、核酸試料への該プローブの特異
性を得るために望ましい。また、例えば核酸試料
と対応する核酸プローブのハイブリツドが100塩
基対以上となる場合において、核酸試料中の変異
による該ハイブリツド中のミスマツチが少数であ
ると該ミスマツチに起因するハイブリツドの安定
性の変化は微妙となり測定しにくくなる。このよ
うな場合には、用いる核酸プローブは10〜100塩
基、さらに好ましくは15〜80塩基程度のものが良
い。ただし、このような場合においても、ハイブ
リツド中のミスマツチが複数存在する場合、さら
には核酸試料の変異が複数個の塩基の欠損あるい
は挿入などによるときはこの限りではない。核酸
試料としては、動物細胞、例えば白血球、腎細
胞、肝細胞等、また細菌、ウイルス等の微生物、
さらには植物細胞等から抽出した核酸を用い、こ
れらは、担体に核酸プローブがハイブリダイズ可
能な状態に固定化されていれば良く、担体として
は、ニトロセルロース、ナイロンメンブレン等の
天然、あるいは合成ポリマー等、不溶性で通常の
生化学反応に適用される温度範囲で安定なもので
あれば何ら制限はない。固定化の方法としては例
えば、ニトロセルロースを担体としたときには熱
変性固定、ナイロンメンブレンを担体としたとき
には紫外線照射による共有結合固定等の公知の方
法に従えば良い。

本発明では、核酸試料と核酸プローブのハイブ
リツド中の塩基対組成に由来する安定性の違いを
排除するため、全工程をテトラアルキルアンモニ
ウム塩の存在下で行なう。テトラアルキルアンモ
ニウム塩はＡ−Ｔ（Ａ−Ｕ）結合及びＧ−Ｃ結合
の結合強度を均一にする。従つて、ハイブリツド
の安定性は該ハイブリツドの塩基対数にのみ依存
する。このことは、ハイブリツドの解離を引き起
こす条件、すなわち、ハイブリツドの安定性を、
その塩基対数から容易に推測することを可能とす
るものであり、強いては核酸試料配列中の変異の
有無を判定するための対照を必要としないことを
意味する。テトラアルキルアンモニウム塩は、２
〜3.5モル／１、好ましくは2.4〜３モル／１の濃
度が好ましい。この濃度範囲以外では先に述べた
様な効果が低下する。また、テトラアルキルアン
モニウム塩のアルキル鎖は、炭素数１〜２の，テ
トラメチル、テトラエチルアンモニウム塩が好ま
しい。炭素数が３以上のテトラアルキルアンモニ
ウム塩では、先に述べた様な効果が低下する。

核酸試料と核酸プローブをハイブリダイズさせ
るには、通常知られた方法、例えば40〜70℃の温
度下で接触させ、後に温度を低下させるなどして
行えば良い。ハイブリツドを形成しなかつた核酸
プローブは洗浄によつて除去すれば良い。

ハイブリツドを形成した核酸試料、核酸プロー
ブは引き続き、該温度を上昇させることにより、
再び解離する。この時、核酸試料と核酸プローブ
間にＡ−Ｔ（Ａ−Ｕ），Ｇ−Ｃ結合以外のミスマツ
チした部分が存在するハイブリツドでは完全に相
補的に結合したハイブリツドに比べ安定性が低い
ため比較的低い温度で核酸プローブの解離が測定
される。完全相補的にハイブリダイズした核酸
は、約100℃で解離していることが知られている
ので温度は核酸試料と対応する核酸プローブをハ
イブリダイズさせて、該温度を基準として０〜
100℃の範囲に上昇させれば良い。

溶出した核酸プローブは、例えば紫外域の吸光
度、また操作に先立つて該プローブにラジオアイ
ソトープあるいは蛍光物質等の標識を施した場合
には、それらの標識を測定することにより行なえ
ば良い。

以上説明した様な操作を迅速、簡便に、かつ正
確に行い得る本発明の実施の一態様として、試料
核酸を固定化した担体をカラムに充てんし、テト
ラアルキルアンモニウム塩溶液を移相として用い
るカラム形式を上げることができる。本形式によ
り、解離し、溶出した核酸プローブ量を連続的に
測定することが可能である。この場合には担体と
してカラム充てんの容易なビーズ状、あるいは粒
状物質を用いることが好ましい。さらにこの場合
においては、テトラアルキルアンモニウム塩溶液
の温度を随時上昇させる事でハイブリツドの安定
性に起因する核酸プローブの溶出を連続的に測定
することができる。

（発明の効果） テトラアルキルアンモニウム塩の存在により、
ハイブリツド中のＡ−Ｔ（Ａ−Ｕ），Ｇ−Ｃ結合を
均一にすることが可能となる。従つて、本発明で
は、核酸試料と対応する核酸プローブ とのハイブリツド中のＧ−Ｃ組成を考慮せず、該
ハイブリツドの長さ、つまり塩基対数のみを安定
性の測定時に考慮すれば良い。即ち、ある塩基対
数の完全相補的なハイブリツドが、核酸プローブ
と核酸試料に解離する温度と同一のテトラアルキ
ルアンモニウム塩溶液中で、該核酸プローブと同
一の塩基数を有する塩基組成の異なる核酸プロー
ブのハイブリツドからの解離は、その結合が完全
相補的である限り、塩基組成に左右されることな
く、同一温度で生じる。核酸試料に変異が存在す
る場合、あるいは、変異した核酸試料に対応する
核酸プローブを用いた時には、それぞれ該核酸に
変異のある場合、もしくは変異のない場合に対応
する核酸プローブとの間に形成されるハイブリツ
ドは完全相補的なハイブリツドに比べ、安定性が
低くなるため、完全相補的なハイブリツドから、
核酸プローブが解離する温度に比べ低温で解離す
る。この安定性の変化、即ち、ハイブリツドから
の核酸プローブの解離温度の変化を測定すること
で、核酸試料中の変異を検出することができる。
本発明では、上記の様に核酸試料中の変異の有無
を測定するもあるため、従来の制限酵素を用いた
方法に比べより正確に塩基配列の変異を把握する
ことが出来る。またさらには、核酸試料と核酸プ
ローブのハイブリツド中の塩基組成を排除できる
ため、検出のたびことにハイブリツドが完全相補
的である場合の安定性を知るための対照を必要と
しない。

（実施例） 以下の実施例により本発明のさらに詳細な説明
を行なうが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

（実施例 １） 核酸料核酸の調製及び固定化は以下に示した方
法で行なつた。アクチンの遺伝子をクローニング
したプラスミド及びそのone point mutationの
起こつた同プラスミドを持つ大腸菌を培地に接種
し、37℃で一昼夜培養した。遠心により集菌後、
緩衝液（PH8.0）に懸濁し、アルカリ溶液で溶菌
後、さらに緩衝液（PH4.0）を加えて中和し、こ
れを遠心した。得られた遠心上清に、2.5容量の
エタノールを加え、−80℃にて核酸を沈澱させた
後、遠心により、プラスミドDNAを回収した。
得られた粗プラスミドDNAはアルカリ溶液で変
性させ、これに2Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）を
添加し中和し、ナイロンパウダーに吸着させた
後、紫外線を室温にて２分間照射しDNAをゲル
に固定化した。

蛍光性核酸プローブの調製を以下に示した操作
で行なつた。まず、5^-末端にアミノ基を有するオ
リゴヌクレオチドはDNA合成装置にて調製した。
このオリゴヌクレオチド300μｇを0.5mlの緩衝液
（PH9.0）に溶解し、これに40μのFluorescein
isothiocyanate DNF溶液（40mg／ml）を添加
し、室温にて17hrs反応させた後、末端蛍光色素
ラベルされたオリゴヌクレオチドを
TSKgelODS120Tで分離精製した。塩基配列は
以下の通り。

5′F−GGT GAT CAC CTG GCC GTC
AGG 3′ 続いて先に示した方法にて試料核酸を固定化し
たナイロンゲルをカラムに詰め、これを温度グラ
ジエント装置にセツトした。3Mテトラメチルア
ンモニウム、15mM NaCl，1.5mMNa−citrate
緩衝液（PH7.3）で平衡化し、温度を40℃に保つ。
カラム内に上記の蛍光性核酸プローブを注入し30
分間ハイブリダイズさせた後、Flowを開始し
（100μ／min.）、ハイブリダイズしなかつた蛍
光性核酸プローブを洗い流す。50分後より温度上
昇を開始し90分後に80℃とし、その後10分間80℃
を保つた。この間、温度に応じて溶出してきた蛍
光性核酸プローブをアルゴンイオンレーザー蛍光
検出器により検出した。その溶出パターンを図１
に示した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の実施例１における溶出パターン
を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 核酸プローブを用いて核酸塩基配列における
   変異を検出する方法において、 担体に固定化した核酸試料とそれに対応する
   核酸プローブをテトラアルキルアンモニウム塩
   溶液中でハイブリダイズさせ ハイブリツドを形成しなかつた核酸プローブ
   を除去した後 ハイブリツド形成時の温度から０℃〜100℃
   の範囲に温度を上昇させて核酸プローブを解離
   させ、 解離した核酸プローブを測定することを特徴
   とする核酸塩基配列における突然変異の検出
   法。 ２ 試料を固定化した担体をカラムに充てんし、
   テトラアルキルアンモニウム塩溶液を移相として
   用いることを特徴とする、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。