JPH01108999A - 核酸塩基配列における突然変異の検出法 - Google Patents
核酸塩基配列における突然変異の検出法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
検出する方法に関する。
ある。特に人間の遺伝子に対する解析は急速に進んでお
り、遺伝病、癌等においては、核酸の塩基配列のレベル
で明らかになってきている。
部分の変異、即点変異によることも知られている0以上
の様に、遺伝病等の診断は、核酸の塩基配列を調査し、
正常な塩基配列と比較することにより可能である。
法等の方法でフラグメントの大8なに分離する。
従ってフィルターに固定化、ラジオアイソトープで標識
された核酸プローブとハイブリダイズさせ、そのパター
ンにより変異の有無を判定する方法があげられる。また
他の方法として1例えば。
ハイブリダイズさせ、ハイブリッドの安定性を測定して
変異の有!!を判定する方法、あるいは、核酸試料と核
酸プローブをハイブリダイズさせ、これをフォルムアミ
ド勾配をつけたアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ハ
イブリッドの変性点をオートラジオグラフにより測定し
て変異の有無を判定する方法等があげられる。しかしな
がら1例えば、制限酵素を用いる方法では操作が複雑で
・0時間がかかり、また核酸塩基配列の変異が必ずしも
制限酵素による切断パターンとして現われない等の問題
点がある。また核酸試料と核酸プローブのハイブリッド
の安定性の変化を測定して、変異の有無を測定する方法
においては、核酸試料中の変異の有無の検出に先立って
、対照を定めて、該対照の安定性について検討する必要
がある。この理由は核酸試料と核酸プローブがハイブリ
ッドを形成するための塩基間の水素結合すなわちアデニ
ン−チミンまたはウラシル(A’−TまたはU)、グア
ニン−シトシン(G−C)において、G−C結合はA−
T (またはA−U)結合に比べ強力であり、従ってG
−Cの割合により該ハイブリッドの安定性が変化するこ
とによる。
意研究を行った結果、簡便な操作により迅速に実施可能
で、しかも核MtIc料塩基配列中の変異の有無を判定
するための対照を必要としない方法を完成させた。すな
わち本発明は核酸プローブを用いて核酸塩基配列におけ
る変異を検出する方法において。
ローブをテトラアルキルアンモニウム塩溶液中でハイブ
リダイズさせ。
した後 ■ ハイブリッド形成時の温度から0℃〜100℃の範
囲に温度を上昇させて核酸10−ブを解離させ。
法に関するものである。
ることが、核酸試料への該プローブの特異性を得るため
に望ましい、また9例えば核酸試料と対応する核酸プロ
ーブのハイブリッドが100塩基対以上となる場合にお
いて、核酸試料中の変異による該ハイブリッド中のミス
マツチが少数であると該ミスマツチに起因するハイブリ
ッドの安定性の変化は微妙となり測定しにくくなる。こ
のような場合には、用いる核酸10−ブは10〜100
塩基、さらに好ましくは15〜80塩基程度のものが良
い、ただし、このような場合においても、ハイブリッド
中のミスマツチが複数存在する壜台、さらには核酸試料
の変異が複数個の塩基の欠損あるいは挿入などによると
きはこの限りではない、核酸試料としては、動物細胞1
例えば白血球、腎細胞、肝細胞等、また細菌、ウィルス
等の微生物、さらには−植物細胞等から抽出した核酸を
用い、これらは、担体に核酸10−ブがハイブリダイズ
可能な状態に固定化されていれば良く。
等の天然、あるいは合成ポリマー等、不溶性で通常の生
化学反応に適用される温度範囲で安定なものであれば何
ら制限はない、固定化の方法知の方法に従えば良い。
の塩基対組成に由来する安定性の違いを排除するため、
全工程をテトラアルキルアンモニウム塩の存在下で行な
う、テトラアルキルアンモニウム塩はA−T (A−U
)結合及びG−C結合の結合強度を均一にする。従って
、ハイブリッドの安定性は該ハイブリッドの塩基対数に
のみ依存する。このことは、ハイブリッドの解離を引き
起こす条件8すなわち、ハイブリッドの安定性を。
であり1強いては核a試料配列中の変異の有無を判定す
るための対照を必要としないことを2味する。テトラア
ルキルアンモニウム塩は、2〜3.5モル/l、好まし
くは2.4〜3モル/lの濃度が好ましい、この濃度範
囲以外では先に述べた様な効果が低下する。また、テト
ラアルキルアンモニウム塩のアルキル鎖は、炭素数1〜
2の、テトラメチル、テトラエチルアンモニウム塩が好
ましい、炭素数が3以上のテトラアルキルアンモニウム
塩では、先に述べた様な効果が低下する。
通常知られた方法1例えば40〜70℃の温度下で接触
させ、後に温度を低下させるなどして行えば良い、ハイ
ブリッドを形成しながった核酸プローブは洗浄によって
除去すれば良い。
続き、該温度を上昇させることにより。
::A−T (A−U) 、 G−C結合以外のミスマ
ツチした部分が存在するハイブリッドでは完全に相補的
に結合したハイブリッドに比べ安定性が低いため比較的
低い温度で核酸プローブの解離が測定される。完全相補
的にハイブリダイズした核酸は、約100℃で解離して
いることが知られているので温度は核酸試料と対応する
核酸プローブをハイブリダイズさせて、該温度を基準と
して0〜100℃の範囲に上昇させれば良い。
操作に先立って該10−ブにラジオアイソトープあるい
は蛍光物質等の標識を施した場合には、それらの標識を
測定することにより行なえば良い。
得る本発明の実施の一態様として、試料核酸を固定化し
た担体をカラムに充てんし、テトラアルキルアンモニウ
ム塩溶液を移相として用いるカラム形式を上げることが
できる0本湿式により、解離し、溶出した核酸プローブ
量を連続的に測定することが可能である。この場合には
担体としてカラム充てんの容易なビーズ状、あるいは粒
状物質を用いることが好ましい、さらにこの場合におい
ては、テトラアルキルアンモニウム塩溶液の温度を随時
上昇させる事でハイブリッドの安定性に起因する核酸プ
ローブの溶出を連続的に蒲定することができる。
一にすることが可能となる。従って9本発明では、核酸
試料と対応する核酸プローブとのハイブリッド中のG−
C組成を考慮せず、該ハイブリッドの長さ、つまり塩基
対数のみを安定性の測定時に考慮すれば良い、即ち、あ
る塩基対数の完全相補的なハイブリッドが、核酸プロー
ブと核酸試料に解離する温度と同一のテトラアルキルア
ンモニウム塩溶液中で、該核酸プローブと同一の塩基数
を有する塩基組成の異なる核酸プローブのハイブリッド
からの解離は、その結合が完全相補的である限り、塩基
組成に左右されることなく、同一温度で生じる。核酸試
料に変異が存在する場合、あるいは、変異した核酸試料
に対応する核酸プローブを用いた時には、それぞれ該核
酸に変異のある場合、もしくは変異のない場合に対応す
る核酸プロー1との間に形成されるハイブリッドは完全
相補的なハイブリッドに比べ、安定性が低くなるため、
完全相補的なハイブリッドから。
の安定性の変化、即ち、ハイブリッドからの核酸プロー
ブの解離温度の変化ご測定することで、核酸試料中の変
異を検出することが出来る。
するもあるため、従来の制限酵素を用いた方法に比べよ
り正確に塩基配列の変異を把握することが出来る。また
さらには、核酸試料と核酸プローブのハイブリッド中の
塩基組成を排除できるため、検出のたびことにハイブリ
ッドが完全相補的である場合の安定性を知るための対照
を必要としない。
が、不発明はこれら実施例に限定されるものではない。
で行なった。アクチンの遺伝子そクローニングした1ラ
スミド及びそのone point mutation
の起こった同1ラスミドを持つ大腸菌を培地に接種し。
pH8,0)に懸濁し、アルカリfiF液で浴面後、さ
らに緩衝液(pH4,0)を加えて中和し、これご遠心
した。得られた遠心上清に、2.5容旦のエタノールそ
那え、−80℃にて核酸を沈澱させた後、遠心により、
プラスミドDNAを口取した。得られた粗1ラスミドD
NAはアルカリ(pH7,5)を添加し中和し、ナイロ
ンパウダ蛍光性核酸プローブの調製を以下に示した操作
で行tつな、まず、5°末端にアミノ基を有するオリゴ
ヌクレオチドはDNA合成装置にてll1l製しコま た。このオリ浄ヌクレオチド300μgを0.5mlの
緩衝液(pH9,0)に溶解し、これに40μmのFl
uorescein 1sothiocyanate
DN)溶液(40mg/ml)を添加し、室温にて17
hrs反応させた後、末端蛍光0素ラベルされたオリゴ
ヌクレオチドをTSKgelODS120rで分離精製
した。
AGG 3゜続いて先に示した方法にて試料核酸を固定
化したナイロンゲルをカラムに詰め、これを温度グラジ
ェント装置にセットした。3Mテトラメチルアンモニウ
ム、 15aHNaC1,1,5sHNa−citra
te @@液(pH7,3)で平衡化し、温度を40℃
に保つ。
分間ハイブリダイズさせた後、Flowを開始しくlo
OμI/mi n、)、 ハイブリダイズしなかった蛍
光性核酸プローブを洗い出す、50分後より温度上昇を
開始し90分後に80℃とし。
て溶出してきた蛍光性核酸プローブをアルゴンイオンレ
ーザ−蛍光検出器により検出した。その溶出パターンを
図1に示した。
のである。
Claims (1)
- (1)核酸プローブを用いて核酸塩基配列における変異
を検出する方法において、 [1]担体に固定化した核酸試料とそれに対応する核酸
プローブをテトラアルキルアンモニウム塩溶液中でハイ
ブリダイズさせ [2]ハイブリットを形成しなかった核酸プローブを除
去した後 [3]ハイブリット形成時の温度から0℃〜100℃の
範囲に温度を上昇させて核酸プローブを解離させ、 [4]解離した核酸プローブを測定することを特徴とす
る核酸塩基配列における突然変異の検出法(2)試料を
固定化した担体をカラムに充てんし、テトラアルキルア
ンモニウム塩溶液を移相として用いることを特徴とする
、特許請求範囲(1)項記載の方法
Priority Applications (1)
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH01108999A true JPH01108999A (ja) | 1989-04-26 |
JPH0460640B2 JPH0460640B2 (ja) | 1992-09-28 |
Family
ID=17444140
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP26738787A Granted JPH01108999A (ja) | 1987-10-23 | 1987-10-23 | 核酸塩基配列における突然変異の検出法 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH01108999A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01145000A (ja) * | 1987-12-02 | 1989-06-07 | Tosoh Corp | 核酸塩基配列における突然変異の測定法 |
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-
1987
- 1987-10-23 JP JP26738787A patent/JPH01108999A/ja active Granted
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0460640B2 (ja) | 1992-09-28 |
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