JPH01108999A - 核酸塩基配列における突然変異の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は核酸上で起った突然変異等の塩基配列の変異を
検出する方法に関する。

（従来技術とその−１題点） 近年遺伝子工学の進歩に伴ない、動物１Ｍ物。

細菌、ウィルス等の生物の遺伝情報が明らかになりつつ
ある。特に人間の遺伝子に対する解析は急速に進んでお
り、遺伝病、癌等においては、核酸の塩基配列のレベル
で明らかになってきている。

の その結果ある種の遺伝病では、核酸４塩基配列の僅か一
部分の変異、即点変異によることも知られている０以上
の様に、遺伝病等の診断は、核酸の塩基配列を調査し、
正常な塩基配列と比較することにより可能である。

従来の方法によれば０例えば、まず核ａ試料を。

細胞から抽出し、制御１１酵素により切断し、電気泳動
法等の方法でフラグメントの大８なに分離する。

分離した該フラグメントをサザンプ口ッティング法番こ
従ってフィルターに固定化、ラジオアイソトープで標識
された核酸プローブとハイブリダイズさせ、そのパター
ンにより変異の有無を判定する方法があげられる。また
他の方法として１例えば。

ａ酸試料を直接フィルターに固定化し、これに。

ラジオアイソトープでＩ！ｌｌ識された核酸プローブを
ハイブリダイズさせ、ハイブリッドの安定性を測定して
変異の有！！を判定する方法、あるいは、核酸試料と核
酸プローブをハイブリダイズさせ、これをフォルムアミ
ド勾配をつけたアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ハ
イブリッドの変性点をオートラジオグラフにより測定し
て変異の有無を判定する方法等があげられる。しかしな
がら１例えば、制限酵素を用いる方法では操作が複雑で
・０時間がかかり、また核酸塩基配列の変異が必ずしも
制限酵素による切断パターンとして現われない等の問題
点がある。また核酸試料と核酸プローブのハイブリッド
の安定性の変化を測定して、変異の有無を測定する方法
においては、核酸試料中の変異の有無の検出に先立って
、対照を定めて、該対照の安定性について検討する必要
がある。この理由は核酸試料と核酸プローブがハイブリ
ッドを形成するための塩基間の水素結合すなわちアデニ
ン−チミンまたはウラシル（Ａ’−ＴまたはＵ）、グア
ニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）において、Ｇ−Ｃ結合はＡ−
Ｔ　（またはＡ−Ｕ）結合に比べ強力であり、従ってＧ
−Ｃの割合により該ハイブリッドの安定性が変化するこ
とによる。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは従来技術に見られる問題点を解決すべく鋭
意研究を行った結果、簡便な操作により迅速に実施可能
で、しかも核ＭｔＩｃ料塩基配列中の変異の有無を判定
するための対照を必要としない方法を完成させた。すな
わち本発明は核酸プローブを用いて核酸塩基配列におけ
る変異を検出する方法において。

■　担体に固定化した核酸試料とそれに対応する核酸プ
ローブをテトラアルキルアンモニウム塩溶液中でハイブ
リダイズさせ。

■　ハイブリッドを形成しなかった核酸プロー１を除去
した後 ■　ハイブリッド形成時の温度から０℃〜１００℃の範
囲に温度を上昇させて核酸１０−ブを解離させ。

■　解離した核酸プローブを測定する ことを特徴とする核酸塩基配列における突然変異の検出
法に関するものである。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明では、１０塩基以上を有する核酸プローブを用い
ることが、核酸試料への該プローブの特異性を得るため
に望ましい、また９例えば核酸試料と対応する核酸プロ
ーブのハイブリッドが１００塩基対以上となる場合にお
いて、核酸試料中の変異による該ハイブリッド中のミス
マツチが少数であると該ミスマツチに起因するハイブリ
ッドの安定性の変化は微妙となり測定しにくくなる。こ
のような場合には、用いる核酸１０−ブは１０〜１００
塩基、さらに好ましくは１５〜８０塩基程度のものが良
い、ただし、このような場合においても、ハイブリッド
中のミスマツチが複数存在する壜台、さらには核酸試料
の変異が複数個の塩基の欠損あるいは挿入などによると
きはこの限りではない、核酸試料としては、動物細胞１
例えば白血球、腎細胞、肝細胞等、また細菌、ウィルス
等の微生物、さらには−植物細胞等から抽出した核酸を
用い、これらは、担体に核酸１０−ブがハイブリダイズ
可能な状態に固定化されていれば良く。

担体としては、ニトロセルロース、ナイロンメンブレン
等の天然、あるいは合成ポリマー等、不溶性で通常の生
化学反応に適用される温度範囲で安定なものであれば何
ら制限はない、固定化の方法知の方法に従えば良い。

本発明では６核酸試料と核酸プローブのハイブリッド中
の塩基対組成に由来する安定性の違いを排除するため、
全工程をテトラアルキルアンモニウム塩の存在下で行な
う、テトラアルキルアンモニウム塩はＡ−Ｔ　（Ａ−Ｕ
）結合及びＧ−Ｃ結合の結合強度を均一にする。従って
、ハイブリッドの安定性は該ハイブリッドの塩基対数に
のみ依存する。このことは、ハイブリッドの解離を引き
起こす条件８すなわち、ハイブリッドの安定性を。

その塩基対数から容易に推測することを可能とするもの
であり１強いては核ａ試料配列中の変異の有無を判定す
るための対照を必要としないことを２味する。テトラア
ルキルアンモニウム塩は、２〜３．５モル／ｌ、好まし
くは２．４〜３モル／ｌの濃度が好ましい、この濃度範
囲以外では先に述べた様な効果が低下する。また、テト
ラアルキルアンモニウム塩のアルキル鎖は、炭素数１〜
２の、テトラメチル、テトラエチルアンモニウム塩が好
ましい、炭素数が３以上のテトラアルキルアンモニウム
塩では、先に述べた様な効果が低下する。

核酸試料と核酸プローブをハイブリダイズさせるには１
通常知られた方法１例えば４０〜７０℃の温度下で接触
させ、後に温度を低下させるなどして行えば良い、ハイ
ブリッドを形成しながった核酸プローブは洗浄によって
除去すれば良い。

ハイブリッドを形成した核酸試料、核酸プローブは引き
続き、該温度を上昇させることにより。

再び解離する。この時、核酸試料と核酸プローブｆｍＧ
：：Ａ−Ｔ　（Ａ−Ｕ）　、　Ｇ−Ｃ結合以外のミスマ
ツチした部分が存在するハイブリッドでは完全に相補的
に結合したハイブリッドに比べ安定性が低いため比較的
低い温度で核酸プローブの解離が測定される。完全相補
的にハイブリダイズした核酸は、約１００℃で解離して
いることが知られているので温度は核酸試料と対応する
核酸プローブをハイブリダイズさせて、該温度を基準と
して０〜１００℃の範囲に上昇させれば良い。

溶出した核酸プローブは１例えば紫外域の吸光度、また
操作に先立って該１０−ブにラジオアイソトープあるい
は蛍光物質等の標識を施した場合には、それらの標識を
測定することにより行なえば良い。

以上説明した様な操作を迅速、簡便に、かつ正確に行い
得る本発明の実施の一態様として、試料核酸を固定化し
た担体をカラムに充てんし、テトラアルキルアンモニウ
ム塩溶液を移相として用いるカラム形式を上げることが
できる０本湿式により、解離し、溶出した核酸プローブ
量を連続的に測定することが可能である。この場合には
担体としてカラム充てんの容易なビーズ状、あるいは粒
状物質を用いることが好ましい、さらにこの場合におい
ては、テトラアルキルアンモニウム塩溶液の温度を随時
上昇させる事でハイブリッドの安定性に起因する核酸プ
ローブの溶出を連続的に蒲定することができる。

（発明の効果） テトラアルキルアンモニウム塩の存在により。

ハイブリッド中のＡ−Ｔ　（Ａ−Ｕ）、Ｇ−Ｃ結合を均
一にすることが可能となる。従って９本発明では、核酸
試料と対応する核酸プローブとのハイブリッド中のＧ−
Ｃ組成を考慮せず、該ハイブリッドの長さ、つまり塩基
対数のみを安定性の測定時に考慮すれば良い、即ち、あ
る塩基対数の完全相補的なハイブリッドが、核酸プロー
ブと核酸試料に解離する温度と同一のテトラアルキルア
ンモニウム塩溶液中で、該核酸プローブと同一の塩基数
を有する塩基組成の異なる核酸プローブのハイブリッド
からの解離は、その結合が完全相補的である限り、塩基
組成に左右されることなく、同一温度で生じる。核酸試
料に変異が存在する場合、あるいは、変異した核酸試料
に対応する核酸プローブを用いた時には、それぞれ該核
酸に変異のある場合、もしくは変異のない場合に対応す
る核酸プロー１との間に形成されるハイブリッドは完全
相補的なハイブリッドに比べ、安定性が低くなるため、
完全相補的なハイブリッドから。

核酸プローブが解離する温度に比べ低温で解離する。こ
の安定性の変化、即ち、ハイブリッドからの核酸プロー
ブの解離温度の変化ご測定することで、核酸試料中の変
異を検出することが出来る。

本発明では、上記の様に核酸試料中の変異の有無を測定
するもあるため、従来の制限酵素を用いた方法に比べよ
り正確に塩基配列の変異を把握することが出来る。また
さらには、核酸試料と核酸プローブのハイブリッド中の
塩基組成を排除できるため、検出のたびことにハイブリ
ッドが完全相補的である場合の安定性を知るための対照
を必要としない。

（実ＩＩｉ例） 以下の実施例により本発明のさらに詳細な説明を行なう
が、不発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１） 榎酸料碩酸のｔｌｉｌ製及び固定化は以下に示した方法
で行なった。アクチンの遺伝子そクローニングした１ラ
スミド及びそのｏｎｅ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ
の起こった同１ラスミドを持つ大腸菌を培地に接種し。

３７℃で一襲夜培蚤した。遠心により具国後、緩衝液（
ｐＨ８，０）に懸濁し、アルカリｆｉＦ液で浴面後、さ
らに緩衝液（ｐＨ４，０）を加えて中和し、これご遠心
した。得られた遠心上清に、２．５容旦のエタノールそ
那え、−８０℃にて核酸を沈澱させた後、遠心により、
プラスミドＤＮＡを口取した。得られた粗１ラスミドＤ
ＮＡはアルカリ（ｐＨ７，５）を添加し中和し、ナイロ
ンパウダ蛍光性核酸プローブの調製を以下に示した操作
で行ｔつな、まず、５°末端にアミノ基を有するオリゴ
ヌクレオチドはＤＮＡ合成装置にてｌｌ１ｌ製しコま た。このオリ浄ヌクレオチド３００μｇを０．５ｍｌの
緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解し、これに４０μｍのＦｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　
ＤＮ）溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温にて１７
ｈｒｓ反応させた後、末端蛍光０素ラベルされたオリゴ
ヌクレオチドをＴＳＫｇｅｌＯＤＳ１２０ｒで分離精製
した。

塩基配列は以下の通り。

５°Ｆ−ＧＧｒ　Ｇ＾Ｔ　ＣＡＣＣｒＧ　ＧＣＣＧＴＣ
ＡＧＧ　３゜続いて先に示した方法にて試料核酸を固定
化したナイロンゲルをカラムに詰め、これを温度グラジ
ェント装置にセットした。３Ｍテトラメチルアンモニウ
ム、　１５ａＨＮａＣ１，１，５ｓＨＮａ−ｃｉｔｒａ
ｔｅ　＠＠液（ｐＨ７，３）で平衡化し、温度を４０℃
に保つ。

カラム内に上記の蛍光性核ａｌＦ７０−プを注入し３０
分間ハイブリダイズさせた後、Ｆｌｏｗを開始しくｌｏ
ＯμＩ／ｍｉ　ｎ、）、　ハイブリダイズしなかった蛍
光性核酸プローブを洗い出す、５０分後より温度上昇を
開始し９０分後に８０℃とし。

その後１０分間８０’Ｃを保った。この間、温度に応じ
て溶出してきた蛍光性核酸プローブをアルゴンイオンレ
ーザ−蛍光検出器により検出した。その溶出パターンを
図１に示した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の実施例１における溶出パターンを示すも
のである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）核酸プローブを用いて核酸塩基配列における変異
   を検出する方法において、 ［１］担体に固定化した核酸試料とそれに対応する核酸
   プローブをテトラアルキルアンモニウム塩溶液中でハイ
   ブリダイズさせ ［２］ハイブリットを形成しなかった核酸プローブを除
   去した後 ［３］ハイブリット形成時の温度から０℃〜１００℃の
   範囲に温度を上昇させて核酸プローブを解離させ、 ［４］解離した核酸プローブを測定することを特徴とす
   る核酸塩基配列における突然変異の検出法（２）試料を
   固定化した担体をカラムに充てんし、テトラアルキルア
   ンモニウム塩溶液を移相として用いることを特徴とする
   、特許請求範囲（１）項記載の方法