JPH0563160B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は核酸上で起つた突然変異等の塩基配列
の変異を検出する方法に関する。

（従来技術とその問題点） 近年、遺伝子工学の進歩に伴ない、動物、植
物、細菌、ウイルス等の生物の遺伝情報が明らか
になりつつある。特に人間の遺伝子に対する解析
は急速に進んでおり、遺伝病、癌等においては核
酸の塩基配列のレベルで明らかになりつつある。
その結果ある種の遺伝病では、核酸に塩基配列の
僅か一部分の変異、即ち点突然変異に困ることも
知られている。以上のように遺伝病等の診断は、
核酸の塩基配列を調べ正常な塩基配列と比較する
ことにより可能である。従来の方法によれば、例
えばまず核酸試料を細胞から抽出し制限酵素によ
り切断し、電気泳動法等の方法で核酸の断片で大
きさに従つて分離し、分離した該断片をサザンブ
ロツテイング法によりフイルターに固定化し、ラ
ジオアイソトープで標識された核酸プローブとハ
イブリダイズさせ、そのパターンにより変異の有
無を判定する方法があげられる。また、他の方法
として、例えば核酸試料を直接フイルターに固定
化し、これにラジオアイソトープで標識された核
酸プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリツド
の安定性を測定して変異の有無を判定する方法、
あるいは、核酸試料と核酸プローブをハイブリダ
イズさせ、これをホルムアミド勾配をつけたアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、ハイブリツドの
変性点をオートラジオグラフにより測定して変異
の有無を判定する方法等があげられる。しかしな
がら、例えば制限酵素を用いる方法では操作が複
雑で時間がかかり、また核酸塩基配列の変異が必
ずしも制限酵素による切断パターンとして現れな
い等の問題点がある。また、核酸試料と核酸プロ
ーブのハイブリツドの安定性の変化を調べて変異
の有無を判定する方法においては、核酸試料中の
変異の有無の検出に先立つて対照を定めて、該対
照の安定性について詳細な検討が必要である。こ
の理由は核酸試料と核酸プローブがハイブリツド
を形成するための塩基間の水素結合、即ちアデニ
ン−チミンまたはウラシル（Ａ−ＴまたはＵ）、
グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）において、Ｇ−Ｃ
結合はＡ−Ｔ（またはＡ−Ｕ）結合に較べ強力で
あり、従つてＧ−Ｃ結合に割合によつて該ハイブ
リツドの安定性が変化する事による。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは従来技術にみられる問題点を解決
すべく鋭意研究を行なつた結果、簡単な操作によ
り迅速に実施可能でしかも核酸試料塩基配列中の
変異の有無を判定するための対照を必要としない
方法を完成させた。即ち本発明は核酸プローブを
もちいて核酸塩基配列における変異を検出する方
法に於いて、 担体に固定化した核酸プローブに対し核酸試
料をテトラアルキルアンモニウム塩溶液中でハ
イブリダイズさせ、 ハイブリダイズしなかつた核酸試料を除去し
た後、 ハイブリツド形成時の温度から０℃〜100℃
の範囲に温度を上昇させて核酸試料を解離さ
せ、 解離した核酸試料を測定する ことを特徴とする核酸塩基配列における突然変異
の測定法に関するものである。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明では、核酸試料への核酸プローブの特異
性を得るために、10塩基以上の長さを有する核酸
プローブを用いることが望ましい。また、例えば
核酸試料と対応する核酸プローブのハイブリツド
が100塩基対以上となる場合においては、核酸試
料中の変異による該ハイブリツド中のミスマツチ
が少数であると、該ミスマツチに起因するハイブ
リツドの安定性の変化は微妙となり測定しにくく
なる。従つて、用いる核酸プローブは10〜100塩
基、更に好ましくは15〜80塩基程度のものがよ
い。但し、この様な場合においてもハイブリツド
中のミスマツチが複数存在する場合、さらには核
酸試料中の変異が複数個の塩基の欠失あるいは挿
入等によるときはこの限りではない。核酸試料と
しては、動物細胞例えば白血球細胞、腎細胞、肝
細胞等また、細菌、ウイルス等の微生物、さらに
は植物細胞等から抽出した核酸を用いることが出
来る。核酸プローブは、核酸試料中の変異の有無
を調べたい部分とハイブリダイズ可能な状態で固
定化されていれば良く、この様に固定するため、
末端固定が好ましい。担体としては、天然あるい
は合成ポリマー等、水溶液に不溶性で通常の生化
学反応に適用される温度範囲で安定であるもので
あればなんら制限はない。固定化の方法として
は、例えばセルロースを担体とした時は、核酸プ
ローブの5′末端の燐酸基を介して燐酸エステルの
形で共有結合固定することが出来る。また核酸プ
ローブの末端に脂肪族アミノ基を有したような誘
導体であれば、アミノ基に対して反応性のある基
を導入した担体に対して、例えばアミド結合ある
いはウレタン型結合等のような形で共有結合させ
ることも出来る。

本発明では、核酸試料と核酸プローブ間のハイ
ブリツドにおける塩基対組成に由来する安定性の
違いを排除するために、全工程をテトラアルキル
アンモニウム塩の存在下で行なう。テトラアルキ
ルアンモニウム塩はＡ−Ｔ（あるいはＡ−Ｕ）結
合及びＧ−Ｃ結合の結合強度を均一にする。従つ
てハイブリツドの安定性は該ハイブリツドの塩基
対数にのみ依存する。このとこはハイブリツドの
解離を引き起こす条件、即ちハイブリツドの安定
性をその塩基対数から容易に推測することを可能
とするものであり、強いては核酸試料塩基配列の
変異の有無を判定するための対照を必要としない
ことを意味する。テトラアルキルアンモニウム塩
は2.0〜3.5モル／リツトル好ましくは2.4〜3.0モ
ル／リツトルの濃度が好ましい。この濃度範囲以
外では先に述べたような効果が低下する。また、
テトラアルキルアンモニウムのアルキル鎖は、炭
素数１〜２のものが好ましく炭素数３以上のテト
ラアルキルアンモニウム塩では先に述べた様な効
果が低下する。核酸試料と核酸プローブをハイブ
リダイズさせるには、通常知られた方法、例えば
40℃〜70℃の温度下で接触させ後に温度を徐々に
低下させるなどして行なえばよい。ハイブリツド
を形成しなかつた核酸試料は洗浄により除去し、
ハイブリツドを形成した核酸試料は引き続き該温
度を上昇させることにより再び解離させる。この
時核酸試料と核酸プローブ間にＡ−Ｔ（Ａ−Ｕ），
Ｇ−Ｃ結合以外のミスマツチした部分が存在する
ハイブリツドでは、完全に相補的に結合したハイ
ブリツドに比べて安定性が低いため比較的低い温
度で核酸試料の解離が起こる。完全相補的にハイ
ブリダイズした核酸であつても90℃〜100℃では
解離しているので温度は核酸試料と核酸プローブ
がハイブリツドを形成した時の温度を基準として
０℃〜100℃の範囲に上昇させればよい。解離し
てきた核酸試料は、例えば紫外域の吸光度、また
操作に先立つて該核酸試料をラジオアイソトープ
あるいは蛍光物質等の標識を施した場合には、そ
れら標識を測定することにより行なえばよい。ま
た溶出してきた核酸試料をポストラベルし測定し
てもよい。以上説明した様な操作を迅速、簡便に
かつ正確に行ない得る本発明の実施の一態様とし
て核酸プローブを固定化した担体をカラムに充填
しテトラアルキルアンモニウム塩溶液を移相とし
て様いたカラム形成を挙げることができる。この
場合には担体としてカラム充填の容易なビーズ
状、あるいは粒子状のものを用いることが好まし
い。本形式においては、テトラアルキルアンモニ
ウム塩溶液の温度を随時上昇させる事でハイブリ
ツドの安定性に起因する核酸試料の溶出を連続的
に測定することが出来る。

（発明の効果） テトラアルキルアンモニウム塩の存在により、
ハイブリツド中のＡ−Ｔ（Ａ−Ｕ），Ｇ−Ｃ結合の
結合力を均一にすることが可能となる。従つて、
本発明では、核酸試料と対応する核酸プローブと
のハイブリツド中のＧ−Ｃ組成を考慮せず、該ハ
イブリツドの長さ、つまり塩基対数のみを安定性
の測定時に考慮すればよい。即ちある塩基対数の
完全相補的なハイブリツドが核酸プローブと核酸
試料に解離する温度はテトラアルキルアンモニウ
ム塩溶液中では、塩基組成に左右されることな
く、同一温度で生じる。即ち、核酸試料と核酸プ
ローブにミスマツチの存在するハイブリツドから
の核酸プローブが解離する温度は完全相補的なハ
イブリツドから、核酸試料が解離する温度に比べ
低温である。この安定性の変化、即ちハイブリツ
ドからの核酸試料の解離温度の変化を測定するこ
とで、核酸試料中の変異を検出する事が出来る。
本発明では、上記の様に核酸試料中の変異の有無
を測定する方法において、従来の制限酵素を用い
た方法に比べ、より正確に塩基配列の変異を把握
する事が出来る。

また、更には核酸試料と核酸プローブ間のハイ
ブリツド中の塩基組成の影響を排除出来るため、
検出のたびごとにハイブリツドが完全相補的であ
る場合の安定性を知るための対照を必要としな
い。

（実施例） 以下の実施例により本発明のさらに詳細な説明
を行なうが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

（実施例 １） 「核酸プローブ固定化ゲルの調製」 DNA合成装置により下記に示した塩基配列の
5′末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド誘
導体を合成した。これをカルボニルジイミダゾー
ルで活性化たセルロースと反応させることにより
核酸プローブを固定化したゲルを調製した。

5′NH₂−AGG TGA ATT TCT TAA ACA
GCT 3′ 続いて、前述の核酸プローブと完全相補的な塩基
配列を持つ21量体、及び5′側から11番目に１ミ
スマツチを有する21量体の計２種類のオリゴヌ
クレオチドを、DNA合成装置により合成した。
塩基配列は以下の通り。

3′TCC ACT TAA AGA ATT TGT
CGA 5′ 3′TCC ACT TAA ACA ATT TGT
CGA 5′ 温度グラジエント槽内に核酸プローブを固定化
したカラムをセツトし、3Mテトラメチルアンモ
ニウム、緩衝溶液（15mM NaCl，1.5mM
NaCitrate.pH7.0）で平衡化し、槽内の温度を50
℃に保ちつつ、バルブより試料核酸を注入しカラ
ム内でハイブリダイズさせた。

この間、温度を40℃まで徐々に下げハイブリツ
ド形成を促進させ、30分後にFlowを開始し
（100μl／min.）ハイブリダイズしなかつた試料を
洗い出した。50分に温度上昇を開始しカラム内で
ハイブリダイズしている試料を溶出させ、溶出し
てきた核酸を紫外吸収（260nm）でモニターし検
出した。図１は完全相補21量体及び中央に１ミ
スマツチをもつ21量体の混合試料を前述のシス
テムを用い分離した例である。それぞれの溶出時
間は67分及び82分でであつた。結果を図１に示
す。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１の測定結果を示すものである。
縦軸は吸光度及び温度、横軸は時間である。図中
のANNEALINGは核酸試料をカラム内でハイブ
リダイズさせている時間で、この間は移動相の流
れはない。FLOW STARTで移動相を流し始め、
SEPARATINGで核酸試料の分離を開始する。
最初の振り切れているピークはハイブリツドを形
成しなかつた過剰の核酸試料で２番目のピークは
１ミスマツチを有する核酸試料、３番目のピーク
が完全相補的な核酸試料の溶出をそれぞれ現して
いる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 核酸プローブを用いて、核酸塩基配列におけ
   る変異を検出する方法において、 核酸試料と、該試料に対応する担体に固定化
   した核酸プローブをテトラアルキルアンモニウ
   ム塩溶液存在下でハイブリダイズさせ、 ハイブリダイズしなかつた核酸試料を除去し
   た後、 ハイブリツト形成時の温度から０℃〜100℃
   の範囲に温度を上昇させて核酸試料を解離さ
   せ、 解離した核酸試料を測定する。 ことを特徴とする核酸塩基配列における突然変異
   の測定法 ２ 核酸プローブを固定化した担体をカラムに充
   填し、テトラアルキルアンモニウム塩溶液を移相
   として用いることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法