JPH04506659A - 抗腫瘍溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗腫瘍溶液および腫瘍の治療方法 発明の分野 本発明は腫瘍治療用の抗腫瘍溶液を処方する方法に関するものである。もう１つ の局面においては、本発明は腫瘍疾病の新しい治療法に関するものである。

発明の背景 癌の有効な治療は医学的な確立が最も優先されているものである。血液組織、例 えば幼時白血病およびホジキンス病に関係する幾つかの全身分散病形態の有効な 治療法では長足の進歩があった。しかし乍ら、最も広汎な形態の固形悪性塊、例 えば肺、結腸、直腸および乳房、並びに初期脳腫瘍、メラノーマ等のような広汎 でないが攻撃的な他の形態の治療における進歩は緩慢であった。外科切開、放射 線療法、化学療法および免疫療法を個々の様式としてかまたは種々の組合せとし てかのいずれかで使用する多数の治療プロトコールを実験モデルおよび／または 臨床的に試験してきた医学界の主要な努力にも拘わらず上記のことは当てはまる 。

薬品治療でこれまでに解決されていない１つの主要な問題は選択性、換言すれば 健全な周囲組織または器官に障害を生じさせないで腫瘍を有効に治療する問題で ある。上記目的を達成するためにこれまで２つの一般的な方法が知られており、 それらは、ａ）ｊｌ瘍に対し選択的毒性である薬剤を使用するかまたはｂ）腫瘍 に毒性の薬剤を選択的に送達することである。正常なヒト組織を損なうことなく 細菌を選択的に殺すベニ７りンまたは他の抗生物質とは違って、癌を治療する「 魔法の弾丸」の追求はとらえ所のないまま残されている。モノクローナル抗体、 細胞毒性の免疫細胞および／または他の生物学的応答修正剤を使用する免疫療法 的手法は上記の点に関して期待をつないでいるが、今までのところ宿主毒性並び に種々の他の問題も示している。

全身に送達される化学療法剤の有用性は腫瘍に到達する薬品の量が少なくそして 骨髄抑制または胃腸毒性および種々の器官特異的毒性、例えばアトリアマインン による心臓毒性、ンスブラチンによる腎毒性およびプレオマインンによる肺部性 のような宿主毒性のため厳しく制限される。これらの併発症はを者が耐え得る総 投与量および治療回数の両方を制限する。更に、成る種の治療薬剤は体液の存在 下で比較的短い有効寿命を示し、そしてしばしば、全身的に導入されたとき部分 的にまたは完全に不活性化された状態で腫瘍に到達する。

領域送達は、腫瘍に送達される治療薬剤対全身的毒性部位に送達される治療薬剤 の比率を上昇させる方法として試験されてきた。これら方法には肝臓潅流、注入 または腹腔内の腫瘍用移植送達デバイスによる腹腔内送達、注入または中枢神経 系腫瘍用の移植可能なデバイスによる脳を髄液性への送達、注入または外科的切 除後の移植可能なデバイスによる腔内送達および腫瘍近傍に移植されたデバイス による送達のような技術によって具体化されている、腫瘍領域に通じる動脈中へ の動脈内注入が含まれていた。これら方法による成功も非常に限られている。

腫瘍内への直接送達は大量の抗腫瘍剤を固形腫瘍塊に送達するが全身的毒性部位 への送達は最小にする最適の方法として期待されている。腫瘍内直接送達は多く の腫瘍タイプで試験されてきた。化学療法剤、生物療法剤および放射線療法剤を 含む非常に広範囲の抗腫瘍剤が使用されてきた。例えば、リブラギ（Ｌｉｖｒａ ｇｈｉ）および共同研究者、チューモリ（Ｔｕｍｏｒｌ）　７２　（１，９８６ ）　、８１〜８７頁、は超音波誘導下でヒトにおける腫瘍内への直接的化学療法 の効果を研究している。彼らは５−フルオロウラシル、メトトレキセートおよび シクロホスファミドの標準的な水性処方剤を投与した。チーター（Ｔａｔｏｒ） および共同研究者、キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　 ２７　（１９７７＞　、４７６〜４８１頁、は２つのニトロソウ１ノア、即ち１ −（２−クロロエチル）−３−シクロへキンルー１−二トロソウレア（ＣＣＮＵ ）　オよび１−（２−クロロエチル）−３−（）ランス−４−メチルシクロベキ ンル）−１−二トロソウレア（ｌｉｅ−ＣＣＮＵ）の腫瘍内定位固定注入の効果 をマウスと衣芽細胞腫モデルで研究した。これらの研究者ζ１非常に大量の薬品 投与量を使用して腫瘍の治療を可能にすると思われる種々の担体を試験した。彼 らの最も適切な処方では、水に不溶性のこれらニトロソウレアは０．４％の水性 メチルセルロースに１％４させた。彼らの実験、即ち１つの腫瘍塊中への、時に は一連の１０回までの別々の、一時的に間隔を置いた注入では寿命増加はほんの 少ししかもたらされなかった。

これらや他の腫瘍内直接療法を制限する最も顕著な問題は、腫瘍塊全体を通して 致死レベルの抗ｍａ物質を送達することができないことに存する。送達担体中の 細胞毒性物質の安定性および生体利用性も問題であった。

上記を考慮すると、先行技術で既知の癌治療の限界は容易に明白である。

本発明の目的 従って、本発明の目的は腫瘍疾病の新規治療法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は抗腫瘍溶液を腫瘍内に直接送達する効果的な方法を提 供することである。

本発明の更にもう１つの目的は直接的腫瘍内送達用の効果的な抗腫瘍溶液を提供 することである。

本発明の他の目的および利点はア部は明白であり、そして１部は以下で明らかに なる。

これらや他の目的が本発明によって実現される唸様は以下で述べる要約および詳 細な説明から明白である。

本発明の要約 本発明によれば、腫瘍内直接法入用の抗腫瘍溶液は、本質的に主要活性成分とし ての抗腫瘍治療剤溶質および水と混和可能な有機溶媒担体からなるように処方さ れる。溶媒担体は、ａ）水に可溶性であることに加えて、該担体がまた生物学的 膜を通して容易に拡散し、それによって腫瘍塊に容易に浸透し、ｂ）抗腫瘍剤を 治療的に有効な値にまで溶解し、モしてＣ）溶媒担体内で抗腫瘍剤が安定で且つ 生体利用性であるように選択される。このような抗腫瘍溶液の直接的な腫瘍内注 入によって、担体は治療的に有効濃度の溶解した活性抗腫瘍剤を周囲の健全な組 織への浸入を最小にしながら腫瘍塊の少なくともかなりの量の全体に搬送する。

本発明の利点は、本発明の以下の表および図面を含む詳細な説明を考慮すると明 白である。

図面の簡単な説明 図１は、本発明に従って処方されそして使用された特定の抗腫瘍溶液を使用して 実験的脳腫瘍の治療が行われた実施例で得られた結果を示す図である。

本発明の詳細な説明 上記したように、本発明によれば、直接的腫瘍内送達用の抗腫瘍溶液は、本質的 に抗腫瘍剤溶質および水と混和可能な有機溶媒担体からなるように処方される。

該担体は治療的に有効な値の抗腫瘍剤が腫瘍塊の少なくともかなりの雪の全体に 搬送されるように作用する。これは水と混和可能な有機溶媒担体を、８）担体が 細胞膜から容易に拡散することによって腫瘍に浸透し、ｂ）腫瘍剤が担体に溶解 して治療的に有効な値になり、モしてＣ）腫瘍剤が担体中で安定で生体利用性で あるように選択することによって達成される。

本発明によれば、抗腫瘍剤の直接的送達および細胞への運送用の溶媒担体は、水 に可溶性でありそしてまた水性溶液から生物学的細胞膜中にそしてそれを通して 分配され拡散する水混和性の有機溶媒である。それらの有用性は治療剤に対する 溶媒力に基づくだけでなくそれらが腫瘍に有効に浸透し得ることにも基づいてい る。本発明の溶媒担体中では、水性相からの分子の移動はそれらの高い水溶解性 によって行われるが、これは好ましい実施態様では生理学的状態で非常に大きい かまたは殆ど同等に大きい。膿瘍物質の大部分は水性であるので、有機溶媒成分 の水混和性または溶解性が重要である。更に、本発明の水混和性有機担体は水性 溶液から細胞膜内へ移動するのに十分な膜溶解性を有している。この能力を達成 する分子特性は、モリソン（Ｍｏｒｒｌｓｏｎ）およびボイド（Ｅｏｙｄ）　、 オルガニックケミストリー（Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈａｍｉｓｔｒｙ）　、４１２ −４１３頁、アリンアンドペイコン（＾１ｌｙｎ　ａｎｄ　Ｂａｃｏｎ）インコ ーホレイテッド発行、ボストン、１９６６、に記載されているようにして測定し て約１．　Ｇｏｏダルトン未満の分子量、および分子式で示されるように電気的 中性（即ち、荷電なし）である。水性溶液から脂肪への分子移動の直接的な測定 は、例えば、コーンフォード（ｃｏｒｎｆｏｒｄ）等の「新生児および成人にお ける脂肪介在性の血液−脳一関門浸透性の比較」、アメリカンジャーナルオブフ ィジオロギ−（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ ｙ）　２４３　（１９８２）　、Ｃ１６１〜Ｃ１６８頁に記載されたような分配 係数である。本発明の好ましい水混和性有機溶媒は少なくとも約０１の分配係数 を有している。上述のコーンフォード等も、脳取込み舟橋を使用して分配係数と 真の細胞膜拡散測定間の密接な関係を証明している。

上記特性を有しそしてその結果本発明の直接送達担体として有用な水混和性有機 溶媒の例には、メタノール、エタノール、！−プロパツール、２−プロパ／−ル 、１−プロペン−３−オール（アリルアルコール）、２−メチル−１−２プロパ ツール（三級ブチルアルコール）、ジアセトンアルコール、Ｎ’Ｎ’−ジメチル ホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、１．３−ジオキサン、アセトン、ピリ ジン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールおよびプロピレングリコールが ある。

本発明者はエタノールが特に有用であることを見い出した。これらに加えて、他 の有用な有機溶媒担体はまた、それらの水可溶性および生物学的膜拡散性によっ て確認することができる。上記で特に示したアルコール類と比較して、１〜ブタ ノールの有用性は幾分限定され、一方Ｃ４より高い脂肪族アルコールの使用はそ れらの水溶解性が限定されるため本発明では使用禁忌とされよう。

水性担体は、水が細胞膜中にそしてそれを通して適当にＫＢせずそしてその結果 抗腫瘍剤成分を腫瘍塊を通して有効に搬送し得ないので、本発明の治療溶液では 直接的送達溶媒担体として無効である。水は上記したように細胞膜を通しての拡 散が乏しいので、水性担体中に溶解した抗腫瘍剤の運搬有効性は抗腫瘍剤自体の 細胞膜拡散特性、即ち、抗腫瘍剤自体の水溶解性および細胞膜を通しての拡散性 にのみ依存する。従って、腫瘍塊を水性処方物から得られる非常に高い抗膿瘍剤 値で治療することを所望する場合、論理的には水溶解性の高い抗腫瘍剤を使用し なければならないことになる。このような抗腫瘍剤は、それらの本質そのものに よって、細胞膜拡散性が乏しくそしてそれ故それ自体顕著には腫瘍塊に浸透しな い傾向がある。他方、それ自体が組織に良く浸透する薬剤の水性溶液を使用する 場合、例えば、１．３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣ ＮＵ）の場合には、このような薬剤の水溶解性が本質的に低いため、比較的低濃 度の抗腫瘍剤を有する溶液を使用しなければならない。更に、ＢＣＮＵのような 多数の既知の抗腫瘍剤は水性溶液中ではあまり安定でないが、本発明の水混和性 有機溶媒担体中でははるかにより安定である。

動物油のような類脂性物質も本発明の有機溶媒成分としては有効でない。このよ うな類脂性溶媒は一般的に水中で混和可能でなくそしてその結果一般的に腫瘍塊 の水性相を通してのそれら分子の移動が不足している。更に、類脂性物質中で溶 解性の高い抗腫瘍剤は、それらの水溶解性が一般的に本質的に低く膜溶解性が高 いため、通常はｌＷ痛拡散特性が少ない。

使用すべき抗腫瘍剤が有効的に安定で生体利用性のままでありそして治療的に有 効な濃度にまで溶解され得る場合、そして水混和性の有機溶媒担体が水性または 類脂性物質の存在下でその腫瘍浸透能を維持できる場合、上記溶媒担体はこのよ うな水性または類脂性物質の存在に耐えることもできる。従って、この状況に遭 遇した場合、本発明の水混和性有機溶媒担体は、ａ）腫瘍に浸透する溶媒能、ま たはｂ）抗Ｉｌｌ瘍剤の安定性、生体利用性若しくは溶解性の顕著な損失が生じ る濃度までは上記水性または類脂性物質を含有することもできると、本発明者は 明確に予期している。明らかに、本発明の水混和性有機溶媒担体中で耐え得る水 性または類脂性物質の最大濃度は、含有される特定の水性および／または類脂性 物質、特定の抗腫瘍剤、有機溶媒担体、並びに処方される抗腫瘍剤濃度の関数と して非常に広範に変動することができる。かくして、本発明の範囲内の抗腫瘍剤 自体てに有効な有機溶媒担体中での上記水性または類脂性物質の特定の耐え得る 最大ｓ度を述べることはできない。

本発明によれば有効な直接的送達抗腫瘍溶液に処方できる抗腫瘍剤には化学療法 剤、生物療法剤、および細胞毒性または細胞増殖抑制活性を示す放射線療法剤が ある。開示された方法を使用して、治療的に有効な投与量の実質的に任意の抗腫 瘍剤溶質を、抗腫瘍剤の的確な本質またはその分子的作用メカニズムを考慮する ことなく、腫瘍塊の少なくともかなりの量の全体に送達させることができる（経 過中に該薬剤の腫瘍外活性化が必要な場合を除いて）。有用な化学療法剤にはア ルキル化剤、例えば白金配位化合物、ナイトロジエンマスタード、ニトロソウレ ア、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネートおよびトリアゼン：代謝拮抗 剤、例えば葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体：ホルモン、例え ばアドレノコルチフステロイド、プロゲスチン、エストロゲンおよびアンドロゲ ン２並びに種々のサブクラス類のもの、例えばメチルヒドラジン誘導体およびア ミドキンムがある。有用な生物療法剤にはニチニチンウアルカロイド；抗生物質 ：モノクローナル抗体；薬品およびトキシンのモノクローナル抗体細胞毒性抱合 体１例えばリシンＡ鎖またはアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質：サイト カイン、生物学的応答修正剤；　リンホカイン：インターフェロン：インターロ イキン：成長因子：成長因子阻害剤：天然、組換え体および合成タンｉ＜り質、 酵素、ペプチドおよび核酸並びにそれらの機能的均等物がある。有用な放射線療 法剤には放射性同位元素標識モノクローナル抗体、特異的な腫瘍優先性を示す他 の放射性同位元素標ｗ１ｍ瘍帰巣性薬剤および代謝物、並びに腫瘍局在化優先性 は全く示さないが本発明の溶解特性を有する放射性同位元素標識薬剤がある。

操作においては、細胞！性の場合、抗腫瘍剤は好ましくはその５０％腫瘍破壊性 投与量（ＴＤ５０％）、即ち腫瘍細胞の５０％を殺害する薬剤の濃度より少な（ とも２０グ（ｌｏｇ）大きい濃度にまで有機溶媒中で溶解させる。これによって 、得られた治療＃液をＷ１１部質中に直接注入するとき、Ｍｉ致死１１１１度の 薬剤が腫瘍塊の少なくともかなりの量の全体に送達されることが保証される。有 機担体が腫瘍塊に浸透すると、有機担体と一緒に治療的に有効で膿瘍に対し致死 濃度の薬剤溶質が輸送される。このようにして、高レベルの抗腫瘍剤を別々にそ して比較的安全に腫瘍塊に送達することができる。もう１つの意味では、溶液の 水混和性有機担体成分は腫瘍内での薬剤の溶解性を大いに上昇させ、それによっ て治療的に有効な毒性レベルの薬剤を膿瘍に行き渡らせることができると考えら れる。本発明の水混和性有機溶媒担体中での溶解性が高い治療薬剤はそれら自体 通常は良好な細胞拡散特性を有する傾向があり、その結果腫瘍内投与によってそ れら自体の拡散領域、多分更に溶媒担体成分の拡散領域を超えて比較的効率的に 拡散し得ることも認識しなければならない。選択された溶媒担体中の治療薬剤の 安定性および生体利用性は、高レベルの活性薬品の腫瘍への浸透を確実にする助 けとなる。

現在使用されている特異的治療薬の多くは１部それらの水溶解性が高いという理 由で選択されており、そのことによってこれら治療薬は標準的な先行技術の送達 技術に従って投与可能となる。しかし乍ら、本発明に従って、非常に有効な抗腫 瘍剤を設計することができ、その際それらの分子構造は本発明の１つまたはそれ 以上の水混和性有機溶媒担体中での溶解性、安定性および／または生体利用性を 最適化されている。それ故、本発明は合理的な薬品設計、処方および送達の新規 な手法を明示する。

多くの場合、適当な抗腫瘍剤は既に存在するかまたは容易に合成される。例えば 、本発明に有用な周知の化学療法剤にはアセグラトン、ＢＣＮＩＩ、ブスルファ ン、ＣＣＮυ、クロラムブシル、カクチノマイシン、カルジノフィリン、クロル ナファジノ、６−クロロプリン、シスプラチン、ダクチノマインン、デメコルシ ン、エチレンイミンキノン、ハダシジン、ロムスチン、メクロレタミン、メルフ プラン、Ｍｅ−ＣＣＮＵ、ブリ力マイシン、マイトティン、マイコフェノリン酸 、ニトラクリン、ノガラマイシン、ストレプトニグリン、ストレブトゾンン、テ ガフル、テトラミン、テストラクトン、トリアジキノン、２．２°、２”−トリ クロロトリエチルアミン、トリフデルミン、トリエチレンホスフォルアミド、ト リエチレンチオホスフォルアミド、ウベニメクス、ウレタン、ビンブラスチンが ある。天然形態では適当な溶解特性を本質的には有していないと思われる抗腫瘍 ペプチド、タンパク質、酵素等は、それらの分子構造に適当なアミノ酸残基また は配列を導入することによってかまたは直接的な化学的修飾によって本発明の有 機溶媒担体中で更に溶解性とすることができる。抗腫瘍性核酸の場合でさえ、適 当な有機溶媒溶解特性を有する類似体は例えば、「後天性免疫不全症候群ウィル スのオリゴデオキシヌクレオシドメチルホスフォネートによる阻害」、サリン（ Ｓａｒｉｎ）等、ブロシーディングスオブザナンソナルアカデミーオブサイエン スユーエスエー（Ｐｒ。

ｃｅｅｄｌｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅ璽ｙ　ｏｆ　 ５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ）　８５　（１９８８）　、　７４S８〜７４５１頁 に報告された製造研究によって示されるようにして合成することができる。有用 な放射性同位元素にはりん−３２、イツトリウム−９０、コバルト−６０、金− １９８、イリジウム−１９２、ヨウ素−１３０、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１３ ２、タンタル−１８２、銅−６７、イオウ−３５およびナトリウム−２４がある 。

成る状況下では、本発明の水混和性有機溶媒担体は、適当な細胞毒性剤と組み合 わせるとき、それらで治療される腫瘍塊に対してそれ自体直接的な細胞毒性効果 を発揮するかまたは協同的毒性効果を発揮する。勿論、相互に共存可能な水混和 性有機溶媒担体−の混合物並びに共存可能な治療剤溶質の混合物も使用すること ができ、ここでは特に利用されている。

慣用の先行技術の送達方法で使用するには余りにも毒性であるとこれまで考えら れた抗腫瘍剤は本発明に基づいて今や有用であることが分かる。得られる抗腫瘍 溶液の付随的毒性は、薬剤が全身的毒性部位に殆ど到達しないので、標準的な腫 瘍性送達方法によって送達されるときに直面するほどには激しくないので、上記 のことが当てはまる。抗Ｗ瘍剤は水混和性有機溶媒担体中で高い安定性を示すよ うに仕立てることもできるが水性溶液中ではむしろ不安定である（例えば、ＢＣ ＮＵはエタノール中では安定であるが、血清中では僅か約１５分間の半減期を有 する）。

非常に希釈されていることに加えて、上記の抗腫瘍剤はまた全身的毒性部位に到 達する前に少なくとも部分的に不活性化され、該薬剤は腫瘍に浸透しそして周囲 の健康な組織に拡散する。勿論、一定の腫瘍タイプでは、その腫瘍に毒性の高い 治療剤を選択すべきである。このようにして、以下の実施例で示されるように、 腫瘍には５０％腫瘍破壊投与量より数オーダー大きい細胞毒性レベルで投与する ことができる。

以下の説明用で非限定的な実施例は、本発明に従って処方されそして使用された 抗腫瘍溶液が、適当に局在化された場合、腫瘍を治療し得ることを証明する。

該溶液はコンピューター処理断層Ｘ線撮影法、超音波、ガンマカメライメージン グ、陽電子放出断層Ｘ線撮影法または磁気共鳴腫瘍イメージングを使用して非常 に正確に腫瘍標的に直接注入することができる。標準的な送達用針に加えて、よ り新しい柔軟性の皮膚針も有用な道具である。

実施例の研究は単一の腫瘍的注入を使用したが、別個の腫瘍領域への複数回注入 は薬剤の治療的に有効な投与量を腫瘍塊全体に行き渡らせるのに更に有効である ことを証明しよう。同様に、総投与量、濃度、送達される処方容量、および送達 速度は一定の腫瘍タイプ、サイズおよび構造に対して最適化することができる。

毒性領域はこれらパラメーターを最適化することによって正確に制御することが できる。ｍ瘍塊中に送達される抗腫瘍溶液の容量および濃度は致死レベルの薬剤 溶質をＩｌｌ瘍全体に届けるのに十分でなければならない。Ｍ瘍構造に関する担 体、治療剤の溶解性、注入数、およびそれらの配置に依って、腫瘍容量より少な いか、腫瘍容量より多いか、または腫瘍容量にほぼ等しい総処方量を使用するこ とが有用である。これらの例においては、担体溶媒容量が腫瘍全体を浸すのに十 分でないような場合には、上記したような好ましい細胞毒性剤の最適溶解特性が 腫瘍塊全体に厘る拡散を更に容易になるように促進する。

膿瘍治療における外科的介在が腫瘍細胞を局所的にそして血流中に播種すること があり、そ１．てこれによって実際神経膠腫および他の腫瘍の再発および転移が 発生することがあることは周知である。本発明によって、注入切開（１回または 複数回）によって流される腫瘍細胞は治療溶液を針量口部から放出するとき治療 容量内にあるように思われるので、上記の問題は改善される。

記載した方法は好ましくは溶液を送達するために針を使用するが、移植可能なデ バイスを使用することもできる。しかし乍ら、このような任意のデバイスは、有 機溶媒担体が治療的に有効な投与量の薬剤を腫瘍全体に運ぶことができるように 、担体および治療剤を同じ速度で放出できなければならない。針送達はまた大き い治療容量を利用できるが極く小さい切開しか必要でないという利点も有する。

これは手術できない腫瘍に特に重要である。

身体のあらゆる部分に生じる腫瘍は本発明を使用して治療することができる。

これらには脳、結腸、直腸、乳房、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮、翠丸、神経組織 等の初期および転移腫瘍が含まれる。

本発明の利点は、有機溶媒担体としてエタノールそして抗腫瘍剤溶質としてＢＣ ＮＯを使用して本発明によって抗腫瘍溶液を処方する以下の実施例を参照して理 解することができる。エタノールは水混和性であり、そして細胞膜を通して効果 的に拡散する。ＢＣＮＵはエタノール中で高度の細胞毒性のレベルまで溶解可能 であり、そしてエタノール中で安定で生体利用性のまま維持される。この例の抗 腫瘍剤組成物溶液によって腫瘍モデルを、慣用の送達方法を使用して実現される 濃度より数ログ大きいＢＣＮＩＩ濃度で治療することができる。この溶液および その直接的腫瘍内送達方法の有効性は得られた結果で証明される。この溶液の定 位固定的に固定した単回注入は４１％の治癒率、即ち治療した５６匹の動物のう ち２３匹の治癒をもたらし生存期間（ＩＬｓ）を４３３％増加させた。この結果 は、対照目的で使用した注入法が治療される腫瘍塊の大きさまたは構造を全く考 慮していなかったという事実からみて一層驚（べきことである。実施例の実験が 行われるまでは、ＢＣＮＵもまた他の単一の細胞毒性剤も、腫瘍部位への送達モ ードに関係なく、上記腫瘍モデルで単回治癒をもたらすことは決して知られてい なかった。

実施例 腫瘍 Ｔ９神経膠肉腫を本試験では使用した。Ｔ９はファルコンのプラスチックフラス コ中単層組轍培養物内で維持した。フラスコには、２０％のウシ新生児血清、非 必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、並びにペニシリン、ストレプトマイシンおよび アンホテリンンＢを含有する抗生物質抗真菌溶液を補充したイーグルの最少必須 培地（Ｇｉｂｃｏ）を入れた。培養物は５％の二酸化炭素を含有する高湿度の雰 囲気中でインキユベートした。細胞が単層を形成しそして融合したとき、それら をトリプシン処理（０２５％のトリプシン、０２％のエチレンジアミンテトラ− 酢酸）し、モして継代培養した。種々の継代から得られた細胞分別物は１０％（ 容Ｍ）のグリセリンを有する液体窒素中で冷凍保存した。

動物 体重１５９〜２００　ｇで日令６０〜８０日の雄ＣＤＦラット（フィノンヤ−３ ４４）　（、二ニーヨーク州ジャーマンタウンのＴａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ） は試験前に１乃至２週間実験室条件に馴化させた。動物にはビニーリナラノトチ ャウおよび水を１由に与え、そして明−暗サイクル（１２時間点灯、１２時間消 灯）を有する室内で１ケージ当たり６匹を維持した。実験は全て午前９時から午 後７時の間に実施した。

脳内腫瘍移植 Ｔ９細胞はトリプシン処理し、フラスコから採集しそしてりん酸緩衝生理食塩水 中に懸濁した。細胞は血球計で計数し、そＩ、て生存性はトリバンブルー排除法 によって測定した。移植直前に、細胞は２５ゲージの針を備えたハミルトンマイ クロリットルンリンジ（７０２）中に吸入した。１０μｍ容量中の７０万個の腫 瘍細胞は各動物の右尾状半球中に定位固定的に注入した。この腫瘍接種では、動 物はベントパルビタールナトリウム（２５〜ｓｏｎｇ／ｋｇ）を腹腔内に使用し てゼロ（０）日目に麻酔しそして定位固定フレーム内に入れた。頭の毛を刈り、 正中線縦軸頭皮切開を行い、そしてブレグマを確認した。歯科用ドリルを使用し て、１１ｍのバー穴をブレグマの右３■１で冠状縫合の後ろ１醜に開けた。次に 針の先端を大脳中に硬膜表面の下５１１１１１の深さまで下げ、次いで１ｕ＋後 退させた。この後退法の目的は細胞を注入できる小さいポケットを創ることであ った。不注意な脳室内注入を緩和するために針斜角は横を向くように位置させた 。細胞は２分間で徐々に注入した。次いで、針を引き抜きそしてバー穴を骨ワッ クスで密閉した。手術部位はホヒドンーヨウ素溶液で清浄化し、そして頭皮切開 はクリップで閉じた。

抗腫瘍溶液 ＢＣＮＵ　（カルムスチン）、二ニーヨーク州ンラキュースのブリストルラボラ トリーズ（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、の溶液は１５１の 無水エタノールにＢＣＮＵ　１００ｍｇを溶解させて製造した。腫瘍内注入は全 てこの６６、フ■ｇ／ｍｌ処方を直接使用した。この濃度は５０％腫瘍破壊投与 量より概ね３乃至４０グ大きい。各動物に送達された投与量はＢＣＮＵ　Ｓａｇ ／体重ｋｇであった。従って、体重１８０　ｇのラットには０．９ｍｇのＢＣＮ Ｕの総投与量と等量の１３．５μｌを与えた。更にＢＣＮＵ　５ｍｇ／体Ｍｋｇ を腹腔内に与えた動物では、この６６．７１ｇ／ｍｌ溶液は使用直前に滅菌水で 更に５ｍｇ／■ｌに希釈した。これは比較的低い投与量であり、そしてラットで の腹腔内ＢＣＮＵで測定したＬＤＩＯの４０％に近い。５ｍｇＢＣＮＵ／　ｋｇ の投与量はラットでのｓｏＩｇ／平方メートルに等量である。

しかし乍らこれは、種間毒性の差異のため、ヒトには外挿することはできない。

！ｌ瘍内ＢＣＮＵ ラットはエーテルおよびベントパルビタールナトリウム（２５〜３ｏ１ｇ／ｋｇ ）で麻酔（５、そして定位固定フレーム内に入れた。クリップおよび骨ワックス は注意深く除去した。ＢＣＮＵ溶液は最初の腫瘍移植で使用したのと同じ技術を 使用してそして同じ座標にセットしたハミルトンマイクロシリンジセットによっ て腫瘍に直接送達させた。前と同様に、手術部位はポビドン−ヨウ素ｒＢ液で清 浄化しそして頭皮はクリップで閉じた。

治療 以下の例は腫瘍、内に送達されたＢＣＮＵＣＮ型溶液の治療効果を評価するため に使用］５だ。動物は全てゼロ（０）日月に腫瘍を移植した。対照には処置をゼ ず、担体対照には７日目に無水エタノールを単回腫瘍内注入Ｉ７た。１つの実験 群には、７日目に５鮎／体重ｋｇの投与量で、無水エタノールに溶解した腫瘍内 ＢＣＩＩＵを単回注入した。別の実験群には７日目に５μｌｇ／体重ｋｇの腫瘍 内ＢＣＮＩＩ単回注入を与え、次いで１２０目に別のＢＣＮＩＩ投与量（５ｍｇ ／体重ｋｇ）を腹腔内に送達させた。

評価 終点として生存の長さを使用して、２つの治療生活規制の効果を比較した。動物 は全て死亡時に剖検した。肺、肝臓および腎臓の肉眼検査を行い、そして脳は完 全に取り出して１０％の緩衝化ホルマリン中で３日間固定した。１つの冠状抱合 部分は腫瘍部位の中心で切断し、そして半分したものは両方ともパラフィンに埋 め込みそしてわかりに（い組織病理学試験層にヘマトキシリンおよびエオシンで 染色した。生存率の中央値は各群で計算し、そしてそのデータはウィルコキソン （Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）　ランクサムテストで非母集団特性値的に分析した。治癒 したとして分類された２３匹の動物には通常の寿命、即ち６００〜７００日を生 存している１９匹の動物および１２１．１３６．３０７．３８４日目日目織学用 に健康なままで層殺されそして観察可能な生存Ｔ９神経膠肉腫を示していない４ 匹の動物が含まれている。

結果 手術による死亡率は、ベントパルビタールナトリウム投与後で腫瘍内注入前の腫 瘍を有する動物では４７％（４／ａ６）　、腫瘍内担体注入後で７，１％（１、 ／１．４）、そしてｌ１ｉｌ瘍内ＢＣＮＵ溶液注入後で５５％（４／７２）であ った。

生存データは下記表１に要約する。対照動物（ｎ＝３５）は中央値１８日間生存 する。担体対照（ｎ　＝　１３）は中央値１７日間生存する。担体対照動物の１ 匹は通常の寿命生存し、そして治癒したと考えられた（８％）。

ＢＣＮＵＣＮ型溶液の腫瘍内単回注入を受けた動物（ｎ＝４２）は中央値７６日 間生存する。即ち３２２％の寿命増加、ｐ＜１０−６゜４２匹の動物のうち１８ 匹が治癒した（４３％）。

ＢＣＮＵＣＮ型溶液の腫瘍内単回注入、次いで腹腔内ＢＣＮ［ｌを受けた動物（ ｎ＝１．４）は中央値１０３日間生存する。即ち４７２％の寿命増加、ｐ＜１． （１−６゜５匹の動物が治癒した（３６％）。治療用生活規制に腹腔内ＢＣＮυ を添加（７ても最初の腫瘍内ＢＣＮＵＣＮ性入の治療的利益を統計的には高めな かった。

Ｔ９神経膠肉腫を有するラットの生存データ。

ＧｒｐＲｘ　ｎ　ＭＤＳ　ＩＬｓ％　治癒　治癒％　ｐｌ　無し　３５１８−０ ０　− ２ＥＴＯＲ１３１７０１８Ｎ５ ３ＢＣＮＬｌ／　４２　７６　３２２　１８　４３　＜＋ｏ−６−ＥＴＯＩＩ　 ＩＴ　Ｎ５ ４ＢＣＮＵ／　１４１０３　４７２　５　３６　＜１０−６−−ＢＣＮＵ／ ＥＴＯＩｌ＋Ｈ２０ ＩＰ ３＋同上　５６　９６　４３３　２３　４１　＜１０−６Ｇｒｐ一群、Ｒｘ−受 けた治療、群Ｉは腫瘍移植後に治療を受けなかった対照であり、群２は７日目に 無水エタノールの腫瘍内単回注入を受けた担体対照であり、群３は７日目に５薦 ｇ／ｋｇの投与量で無水エタノール中に溶解したＢＣＮＵ単回腫瘍内腫瘍（１丁 ）を受け、群４は７日目に無水エタノール中ＢＣＮＵ　（５１ｇ／ｋｇ）の単回 腫瘍内投与（ＩＴ）、次いで１２２日目７．５％の水性エタノール中ＢＣＮＩ＋ （５％ｇ／　ｋｇ）の腹腔内注入（ＩＰ）を受けた：ｎ　−各群の動物数、　Ｍ ＤＳ−腫瘍移植後の生存日の中央値、　ＩＬＳ％−寿命増加パーセント−（治療 群の生存日中央値一対照群の生存日中実値／対照群の生存日中実値）Ｘ１００． 治癒一群２の動物は組織学のために６１４日目日目康なまま層殺した１群３＋４ の２３匹の動物には通常の寿命、即ち６００〜７００日を生存している１９匹の 動物が含まれ、そして４匹の動物は１２１．１３６．３０７．３８４日目日目康 なまま層殺し、Ｔ９神経膠肉腫は示していなかった。ｐ　−ウイルコキソンラン クサムテストｆｆ１ｌｅｏｘｅｎ　ｒａｎｋ　ｓｕｍ　ｔｅｓｔ）によって決定 される統計的有意、ＮＳ−有意でない。

１つの群と考えると、ＢＣＮＵｍ液の単回腫瘍内注入を受けた５６匹の動物は９ ６日の生存中央値を生存する。即ち、４３３％の寿命増加、ｐ＜ｔｏ−ａ。２３ 匹の動物が治癒した（４１％）。

生存曲線は図１に示す。対照および担体処理群は両方とも本質的に１つの急勾配 相を示し、動物の９０％は９日から２４日の間に死亡する。対照的に腫瘍内ＢＣ ＮＵ溶液錫溶液処理群の相、即ち、動物の２３％が１８〜２４日の間に死亡する 最初の急勾配相、動物の３０％が２５から１６６日の間に死亡する第２の勾配が より少ない相、動物の５％が２５１〜３２５日の間に死亡する第３の浅底相およ び通常の寿命、即ち６００〜７００日生存する４１％からなる第４の相または群 を示す。

非処理および処理神経膠肉腫の増殖は以下のように記載される。治療には７日目 を選択した。腫瘍の平均サイズおよび動物が９日目位の早期に死に始めるという 事実が現在のモデルに課された厳しい治療要求を示している。治療しないと、腫 瘍は非常に大きい塊に増殖し、典型的には横断面で全半球に取って替わり、しば しばそれより大きい。膿瘍は時には１つの葉のように見えるが、しばしば上部葉 および下部葉を示す多数の小葉形態で増殖する。腫瘍は多くの有糸分裂を有し健 康的で密集した細胞状であった。

担体対照も死亡時に半球の大きさの腫瘍を示した。しかし乍ら、壊死、多形核白 血球および出血をしばしば伴った嚢胞が通常見られ、これは多分注入部位を示し ていた。

第１相、即ち１８〜２４日の間に死亡したＢＣＮＵ治療動物は典型的な大きい健 康的腫瘍を示した。しかし乍ら、腫瘍細胞壊死も通常は腫瘍の頂部で観察され、 一方底部では凝集して増殖していた。多形核白血球および時には出血を有する嚢 胞が見られた。

第２相、即ち２５〜１６６日の間に死亡した大部分のＢＣＮｔｌ治療動物は中心 性壊死の突起帯を有する大きい腫瘍を示した。比較的長く、即ち９４．１０８お よび９８日生存した３匹はそれらを示さなかった。これらの動物のうちの２匹は 組織学的には急性の出血を示したが腫瘍は示さず、一方３匹巨は多形核白血球お よび成る種の非常に不健康なＴ９腫瘍組織を有する大きい嚢胞を示した。後者の 動物は肺感染も有していた。

第３相、即ち２５１〜３２５日の間に死亡したＢＣＮＵ治療動物は嚢胞、壊死、 余震組織を示したが、Ｔ９神経膠肉腫は示さず、死亡原因は不明であった０通常 の寿命、即ち６００〜７００日生存したＢＣＮＵ治療動物は、密集した連結組織 被膜によって常に囲まれ、多形核白血球を含有することもある大きい嚢胞を示し た。

Ｔ９神経膠肉腫は見られなかったが、腫瘍細胞壊死が通常存在し、あたかもヘモ ジブリン顔料のようであった。リンパ球および形質細胞の広範な浸潤を有する動 物も幾らかいた。通常の寿命を生存した１匹の担体対照動物はこの同様な組織学 を示した。

腫瘍に対する急性効果を研究するために、肩痛内溶液ＢＣＮＵ治療動物（ｎ＝１ ２）の何匹かは７日、１０および１４４日目健康なまま屠殺した。組織学は、こ れらの動物が３つの群の１つに入れることができることを示した。１つの群は頂 部で腫瘍破壊を示し、腫瘍の主要部は元のままであった。第２の群では、腫瘍の 大部分は首尾良く治療されたが、少量の生存腫瘍が残っていた。第３の群では、 腫瘍は治療によって総合的に根絶され、そして壊死腫瘍組織を含有する嚢胞で置 換されていた。

これらのデータは、無水エタノール中に溶解したＢＣＮ［Ｉの単回腫瘍内注入が Ｔ９神好膠肉腫の４１％治癒率をもたらすことを示している。これらの結果は、 ＢＣＮＵも他の任意の細胞毒性剤もこの腫瘍を宵する動物での治癒を決して生じ させたことがない点で際立っている。「動脈内ＢＣＮＩＩの抗神経膠腫治療効果 に与えるジフルオロメチルオルニチンの効果、１、ツーエン（Ｃｏｈｅｎ）　ｆ ４、ジャーナルオグニューロサージ中す−６５　（１９８６）　６７１〜６７８ 頁で、同一のＢＣＮＬＩ投与量、即ち５　ｍｇ／体重ｋｇでは、全身的に送達す るとき寿命の改善はもたらされずそして動脈内に送達するとき５７％のＩＬＳが もたらされたことが以前に報告されている。他の研究者は、より高い投与量、即 ち１３．３１ｇ／ｋｇ（致死投与量の１０％）では、静脈内かまたは動脈内かの し）ずれかで送達されたＢＣＮＵは１８０％の適度のＩＬＳをもたらしたことを 報告した。このおよび他の初期脳腫瘍モデルの循環系に導入されたＢＣＮＩＩの 相対的な無効果性はヒトでのその効果の貧弱性と比例する。本研究の結果は、水 溶解性有機溶媒担体中の高濃度ＢＣＮυの腫瘍的送達がはるかに有効性の高い治 療を示すことを証明して−する。

本方法の有効性は少なくとも１部、腫瘍に直接送達された活性ＢＣＮＵの超致死 濃度に基づいているが、同時に活性な薬品の最少値しか全身的な毒性部位に到達 しない。

組織学は、直接的な腫瘍内ＢＣＮＵ溶液治療が通常の寿命を生存した動物の腫瘍 を総合的に根絶したことを示した。他方、使用した４識鵬の深さの単回注入プロ トコールは、通常の寿命を生存ｊ、なかった殆どの動物の膿瘍の一部を見逃した 。この多様性は、８）薬品注入は腫瘍移植に使用した同一の定位固定座標を使用 することによって「ねらいをつけ」、モしてｂ）Ｉｌｌ瘍はしばしばこの部位の みで（よ増殖せず、むしろ多数の葉として増殖したということを考慮すれば、驚 （ことでＩＬＬない。しばしば、上部葉は消失していることが見られたが、底部 葉は見逃して０た。

これらのデータ並びに他の幾つかの観察によって、鵬瘍深く送達されると本願処 方は腫瘍内で選択的拡散を示すことが示唆された。この点に関して、ａ）正常な 組織の最小壊死が観察され、そしてｂ）薬品注入で誘導された病変の大きさおよ び地図は７日目に組織学で見られる腫瘍の大きさおよび地図を連想させた。周囲 の正常な脳とは幾らか区別される膿瘍塊の普通の脈管系が１部これらの所見の原 因であると思われる。

上記の実施例は本発明を説明しただけのものである。本発明に従って多くの他の 有用な抗腫瘍溶液を処方することができそして膿瘍内１こ送達できること（±当 該技術分野の熟練者に明白である。それ故、本発明は下記請求項（こよってのみ 限定されると考几るべきである。

−襖　裏 補正書の写しくｎ訳文）Ｉ！出書（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的に、水混和性の有機溶媒担体および治療的に有効濃度の抗腫瘍剤溶質 からなろ抗腫瘍溶液の治療的に有効な量を少なくとも１回腫瘍塊に直接注入すろ ことからなる腫瘍塊の治療方法であって、その際上記水混和性の有機溶媒担体は 良好な細胞拡散性を有し、そして上記抗腫瘍剤は上記溶媒担体中で有効的に安定 で且つ生体利用性である。 ２．上記抗腫瘍剤が細胞毒性剤である請求項１に記載の方法。 ３．上記抗腫瘍剤がそのＴＤ５０より少なくとも２ログ大きい濃度で上記溶液中 に存在する請求項２に記載の方法。 ４．上記抗腫瘍剤がニトロソウレアである請求項３に記載の方法。 ５．上記ニトロソウレアがＢＣＮＵである請求項４に記載の方法。 ６．上記抗腫瘍剤溶質が細胞増殖抑制剤である請求項１に記載の方法。 ７．上記溶媒担体が少なくとも約０．１の分配係数、約１０００ダルトンより大 きくない分子量および電気的中性を有する請求項１に記載の方法。 ８．上記溶媒担体が最高４個の炭素原子を有する脂肪族アルコールである請求項 １に記載の方法。 ９．上記脂肪族アルコールがエタノールである請求項８に記載の方法。 １０．上記エタノールが無水アルコールである請求項９に記載の方法。 １１．上記抗腫瘍溶液が本質的に、最高４個の炭素原子を有する脂肪族アルコー ル溶媒担体およびニトロソウレア抗腫瘍剤溶質からなる請求項１に記載の方法。 １２．上記ニトロソウレア抗腫瘍剤溶質がＢＣＮＵである請求項１１に記載の方 法。 １３．脂肪族溶媒担体が無水エタノールである請求項１２に記載の方法。 １４．腫瘍塊の治療が該腫瘍の異なる領域に上記抗腫瘍溶液を複数回注入して行 われる請求項１に記載の方法。 １５．治療される腫瘍塊が脳腫瘍である請求項１に記載の方法。 １６．腫瘍塊が神経膠種でありそして使用される抗腫瘍溶液が水混和性の有機溶 媒担体として無水アルコールおよび抗腫瘍剤溶質としてＢＣＮＵから本質的にな りそして上記溶液中のＢＣＮＵの濃度がそのＴＤ５０より少なくとも２ログ大き い請求項１５に記載の方法。 １７．抗腫瘍溶液の直接的腫瘍内送達による腫瘍塊の治療用抗腫瘍溶液であって 、その際該溶該は本質的に、良好な細胞拡散性を有する水混和性の有機溶媒担体 および治療的に有効な濃度の細胞増殖抑制抗腫瘍剤溶質からなり、該溶質は上記 溶媒担体中で有効的に安定で且つ生体利用性である。 １８．上記溶媒担体が少なくとも約０．１の分配係数、約１０００ダルトンより 大きくない分子量および電気的中性を有する請求項１７に記載の抗腫瘍溶液。 １９．上記溶媒担体が最高４個の炭素原子を有する脂肪族アルコールである請求 項１８に記載の抗腫瘍溶液。 ２０．上記脂肪族アルコールがエタノールである請求項１９に記載の抗腫瘍溶液 。 ２１．抗腫瘍溶液の直接的腫瘍内送達による腫瘍塊治療用の抗腫瘍溶液であって 、その際該溶液は本質的に、良好な細胞拡散性を有する水混和性の有機溶媒担体 および白金配位化合物、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、ア ルキルスルホネートまたはトリアゼンからなる群から選択される治療的に有効な 濃度のアルキル化剤溶質からなり、該溶質は上記溶媒担体中で有効的に安定で且 つ生体利用性である。 ２２．上記溶媒担体が少なくとも約０．１の分配係数、１０００ダルトンより大 きくない分子量および磁気的中性を有する請求項２１に記載の抗腫瘍溶液。 ２３．上記溶媒担体が最高４個の炭素原子を有する脂肪族アルコールである請求 項２２に記載の抗腫瘍溶液。 ２４．上記脂肪族アルコールがエタノールである請求項２３に記載の抗腫瘍溶液 。 ２５．上記アルキル化剤溶質が細胞毒性でありそして上記溶質がＴＤ５０より少 なくとも２ログ大きい濃度で上記溶液中に存在する請求項２１に記載の抗腫瘍溶 液。 ２５．抗腫瘍溶液の直接的腫瘍内送達による腫瘍塊冶療用抗腫瘍溶液であって、 その際害溶液は本質的に、良好な細胞拡散性を有する水混和性の有機溶媒担体お よび治療的に有効な濃度の生物療法剤または放射線療法剤溶質からなり、該溶質 は上記溶媒担体中で有効的に安定で且つ生体利用性である。 ２７．上記溶媒担体が少なくとも約０．１の分配係数、約１０００ダルトンより 大きくない分子量および電気的中性を有する請求項２６に記載の抗腫瘍溶液。 ２８．上記溶媒担体が最高４個の炭素原子を有する脂肪族アルコールである請求 項２７に記載の抗腫瘍溶液。 ２９．上記脂肪族アルコールがエタノールである請求項２８に記載の抗腫瘍溶液 。 ３０．上記生物療法剤または放射線療法剤溶質が細胞毒性でありそして上記溶質 がＴＤ５０より少なくとも２ログ大きい濃度で上記溶液中に存在する請求項２５ に記載の抗腫瘍溶液。 ３１．抗腫瘍溶液の直接的腫瘍内送達による腫瘍塊冶療用抗腫瘍溶液であって、 その際該溶液は本質的に、良好な細胞拡散性を有する水混和性の有機溶媒担体お よび群から選択きれる治療的に有効な濃度の化学療法剤溶質からなる。 ３２．上記溶媒担体が少なくとも約０．１の分配係数、約１０００ダルトンより 大きくない分子量および電気的中性を有する請求項３１に記載の抗腫瘍溶液。 ３３．上記溶媒担体が最高４個の炭素原子を有する脂肪族アルコールである請求 項３２に記載の抗腫瘍溶液。 ３４．上記脂肪族アルコールがエタノールである請求項３３に記載の抗腫瘍溶液 。 ３５．上記生物療法剤または放射線療法剤溶質が細胞毒性でありそして上記溶質 がＴＤ５０より少なくとも２ログ大きい濃度で上記溶液中に存在する請求項２５ に記載の抗腫瘍溶液。