JPH03504381A - ビンカアルカロイド封入リポソームおよびその腫瘍治療への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ビンカアルカロイド封入リポソーム およびその腫瘍治療への使用 技術分野 本発明は腫瘍治療へのビンカアルカロイドの使用に関する。

背景技術 フトモモ科（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）から得られるインドール−インドリン 骨格を含有する二量体アルカロイドであるビンクリスチン及びビンブラスチンは 、単独または他の化学療法剤と組み合わせて抗腫瘍剤として広く使用されている 。ビンクリスチンは非ホジキン病性リンパ腫とホジキン病性リンパ腫、急性リン パ芽球性白血病、ヴイルムス腫瘍、横紋筋肉腫奔よび神経芽細胞腫に対してかな りの有効性を持つことが証明されている。

ビンカアルカロイドはチューブリンに結合するために細胞毒性を有する。チュー ブリンはすべての細胞の細胞質の可溶性分画中に見いだされる二量体タンパク貿 ヤある。それは、有糸分裂時に染色体がそれに沿って移動する紡錘体を形成する 微小管中に重合した形で存在する。更に、微小管は、細胞の構造を維持したり細 胞分泌物や軸索に沿って通過する神経伝達物質のための導管を提供するのに不可 欠な役割を果たす。

ビンカアルカロイドは、チューブリンに結合することによって、微小管の集合過 程を阻害して有糸分裂紡錘体を死滅に至らしめる。

治療を制限する毒性のために、ビンクリスチンの臨床的使用は非常に評判を落と されている。２■を越えるビンクリスチンの総投与量は進行性で焼戻を引き起こ す神経毒性としばしば結び付けられる。ニューロパシーの最初の徴候は、深部腰 反射の低下および手指と下肢の感覚異常である。もっと高度の神経毒性は、脳神 経パルシックおよび足の背屈筋と手首の伸筋を激しい虚弱に至らしめるかもしれ ない。総投与量３ｍｇ以上のビンクリスチンのもっと高い投与量では、自律神経 性ニューロパシーのために便秘や腸閉塞や麻痺性腸閉塞症が起こるかもしれない 。

ビンクリスチンアルカロイドは、多くの他の抗悪性腫瘍薬と同じように、正常組 織と標的組織とを効率よく識別することができない。このような化学療法剤が選 択的にそして調節的にそれらの標的に到達することを可能にする製剤系は、癌化 学療法の相当な進歩をもたらすであろう。

発明の開示 従って、本発明の一つの目的は、上記の欠点を持たない化学療法組成物を提供す ることである。

本発明のもう一つの目的は、化学療法剤が選択的にその標的に到達することを可 能にする化学療法組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、化学療法剤が調節的にその標的に到達することを可 能にする化学療法組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、強められた抗腫瘍効果を有する化学療法組成物を提 供することである。

本発明のもう一つの目的は、弱められた毒性を有する化学療法組成物を提供する ことである。

本発明者は、本発明のこれらの目的のすべて、および下記に示されている本発明 の説明から明らかになるだろう他の目的を満たす組成物を見出した。この組成物 は、ビンカアルカロイドが封入されたリポソームを少なくとも一種含有する組成 物である。ここで、ビンカアルカロイドはビンクリスチン、ビンブラスチン、ビ ンデシンまたはこれらの混合物である。

図面の簡単な説明 添付の図を参考にしながら下記の詳細な説明に目を通すことによって本発明がも っとよく理解されれば、本発明およびその利点の多くが容易にもっと十分に評価 されるだろう。

図１は、遊離ビンクリスチンとリポソームに封入されたビンクリスチンの血漿的 薬物動態を示す。

図２は、静脈内投与された５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームに封入されたビン クリスチンの血漿内薬物ｈａを示す。

図３は、薬剤投与の７２時間後のＬＬ２１０白血病での遊離ビンクリスチンとリ ポソームに封入されたビンクリスチンの細胞毒性を示す。゛ 図４は、マウスでの遊離ビンクリスチンの細胞毒性を示す。

図５は、マウスでのリポソームに封入されたビンクリスチンの細胞毒性を示す。

発明を実施するだめの最良の形態 発明者は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン（デアセチルビンブラ スチン）またはこれらの混合物をリポソーム中にカプセル化する新規な方法を見 出した。この知見は、遊離薬剤と比べてリポソームに封入されたビンカアルカロ イドの薬物動態と組織内分布はかなり違っており抗腫瘍活性が著しく増加し、毒 性がかなり低下するという更なる発見を可能にした。

本発明のビンカアルカロイド封入リポソームを含有する組成物は、癌療法での新 規なアプローチに相当する。遊離化学療法剤の投与量を制限する毒性がリポソー ムを使ったカプセル化によって効果的に弱められるので、より高投与量を投与す ることができる。更に、リポソーム中に内包された同投与量の薬物は、担体系に 基づくどんな治療形式のどんな抗癌剤でもまだ見られたことがないもっとずっと 高い治療効果を提供する。その機序は十分にはわかっていないけれども、一つに は、薬剤がリポソーム中に内包された形で投与されるとその薬剤の薬物動態が変 化することによるらしい。

従って、本発明は、ビンカアルカロイド封入リポソームを含有する組成物を提供 する。ビンカアルカロイド封入リポソームは、ビンクリスチン封入リポソーム、 ビンブラスチン封入リポソーム、ビンデシン封入リポソーム、あるいはビンクリ スチンとビンブラスチンとビンデシンのうちの少なくとも二つの混合物がリポソ ームに封入されたものであってもよい。

ビンカアルカロイドの遊離塩基または塩（例えば、硫酸塩またはアンモニウム塩 ）を溶媒中に溶かすことによってリポソームへの新人材料を得ることができる。

ビンカアルカロイドの遊離塩基が使用される場合には、溶媒は比較的非極性の有 機溶媒であることが好ましい。塩の形が使用される場合には、使用される溶媒は 極性有機溶媒、例えば、メタノールまたはエタノールであることが好ましい。ビ ンカアルカロイドが溶媒中に完全に溶けた時に、溶媒化された化学療法剤にカル シオリビンの溶液を添加することによって、溶かされたビンカアルカロイドをカ ルシオリピンと結合させる。カルシオリピンを溶かすのに用いる溶媒としてはメ タノールまたはエタノールが挙げられる。

次に、こうして得られた混合物を、ゆるやかに撹拌して不活性雰囲気下で乾燥す るまで蒸発させる。不活性雰囲気としては、窒素、アルゴンまたはこれら二つの 組み合わせが挙げられる。

次に、この乾燥した混合物にホスファチジルコリンとコレステロールとホスファ チジルセリンまたはジセチルフォスフェー）　（ＤＣＰ）を加える。次に、得ら れた混合物をゆるやかに撹拌して均質な溶液として不活性雰囲気下で乾燥するま で蒸発させて脂質と薬剤膜を生じさせる。

次に、乾燥した脂質を溶液中に再懸濁させて、その溶液中で水和させた後に超音 波処理する。ここで使用される溶液は、食塩液、燐酸塩で緩衝化された食塩水、 ラクトース液、グルコース液、マンニトール液または他のどんな既知の緩衝化さ れた生理的液であってもよい。透析および／または高速遠心分離によって、非封 入ビンカアルカロイドをビンカアルカロイド封入リポソームと分離する。

所望ならば、ビンカアルカロイド封入リポソームを保存可能にするために凍結乾 燥してもよい。しかしながら、ビンカアルカロイド封入リポソームが溶液中で安 定な場合には、食塩水またはラクトース媒質中で保存することができる。

上記の調製法において、ビンカアルカロイド封入リポソームを調製するために使 用される成分の相対的な量は次の通りである。ビンカアルカロイドは６．８〜９ ．２重量部の量で使用される。カルシオリビンは３０．６〜４１，４重量部の量 で使用される。ホスファチジルコリンは１０２〜１３８重量部の量で使用される 。コレステロールは３４〜４６重量部の量で使用される。そして、ホスファチジ ルセリンまたはジセチルホスフエートは６．８〜９．２重量部の量で使用される 。

これらの化学療法剤封入リポソームは、非ホジキン病性リンパ腫、ホジキン病性 リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ヴイルムス腫瘍、横絞筋肉腫および神経芽 細胞腫の治療に有用である。これらの腫瘍を治療する際には、適切な薬用担体ま たは賦形剤中に溶かされた化学療法剤封入リポソームを一回静脈内投与するかあ るいは５分から３０分にわたって連続的に静脈内投与する。連続投与では、適切 な薬用担体または賦形剤中に懸濁された治療剤封入リポソームを浸透ポンプを使 って投与することができる。

本発明で使用することができる担体は、薬学的に許容される製剤中への有効成分 の適用を容易にする賦形剤と助剤から成る好適な薬用担体を含む。有効成分の静 脈内投与に好適な剤形には、有効成分の懸濁液を含む。

静脈内投与のための溶液は、約０．１〜９９．５重量％、好ましくは約２５〜８ ５重量％の有効成分を、賦形剤と共に含有する。

投与の量と経路および使用される担体および／または添加剤は、治療される腫瘍 の種類によってまたそのような腫瘍に対する既知の治療方法により異なる。典型 的な投与量は、ヒトでは１ｍ２当たりビンカアルカロイドとして１．２〜１．６ ■である。

下記の具体例の説明の過程で、本発明の他の特徴が明らかになるだろう。なお、 これらの具体例は本発明を例示するために示されており本発明を制限するための ものではない。

脂質成分を調べて、リポソーム中に捕らえられた薬剤の効率パーセントを測定し た。我々の研究所で開発された最良の脂質の組み合わせは次の通りである。

硫酸ビンクリスチン８　ｍｇを、メタノール中に溶かしてゆるやかに撹拌して透 明な溶液として、エタノール中で３６■のカルシオリピンと結合させた。混合物 をゆるやかに撹拌して窒素下で乾燥するまで蒸発させた。次に、この乾燥した混 合物に、１２０■のホスファチジルコリンと４０ｍｇのコレステロールと８■の ホスファチジルセリンを加えた。この混合物をゆるやかに撹拌して均質な溶液と し、窒素下で乾燥するまで蒸発させた。乾燥した脂質を０．９％ＮａＣｅ溶液中 に再懸濁させて、暗所で３０分間水和させた後に、３７℃で３０分間カップホー ン型音波処理装置中で超音波処理した。食塩水を少なくとも三回取り替えて４℃ で２４時間０．９％ＮａＣｆに対して長時間透析することによって、薬物封入リ ポソームと非封入ビンクリスチンとを分離した。リポソーム中へのビンクリスチ ンの封入のパーセントを透析完了後に分光光度法によって測定したところ、総使 用量の７０％（Ｎ＝７）であることがわかった。

薬理学的性質に関する研究 １■／　ｋｇの投与量の遊離薬物としてのビンクリスチンと１ｍｇ　／　ｋｇお よび５■／　ｋｇの投与量のリポソーム中に封入されたビンクリスチンを、ＣＤ 、Ｆ、マウスに外側尾静脈から投与した。投与後の複数の時点で、各処置群の四 匹のマウスを殺して、特定の組織を単離して我々の研究所で改良したラジオイム ノアッセイで薬物濃度を調べるために分析した。遊離ビンクリスチンとリポソー ム中に封入されたビンクリスチンの血漿内勤態を図１と図２に示す。

１■／ｋｇの投与量の遊離ビンクリスチンの場合には５分目の最高血漿中濃度は ０．６２μｇ／−であるのに対して、１ｍｇ／ｋｇと５■／ｋｇのリポソームに 封入されたビンクリスチンの場合には５分後にそれぞれ１．５μｇ／−と４．０ μｇ／−の最高血漿中濃度を示す。５分目から２時間目までの間では、リポソー ムに封入されたビンクリスチンの場合の血漿中濃度は同じ投与量の遊離ビンクリ スチンよりも四倍以上高い。５　ｒＢｇ　／　ｋｇの投与量のリポソームに封入 されたビンクリスチンは、１ｍｇ／ｋｇ投与量の遊離ビンクリスチンまたはリポ ソームに封入されたビンクリスチンと比べて、５分目から２４４時間目での間に もっとずっと高い血漿中濃度をもたらす。

遊離ビンクリスチンの投与によって、明らかな大容量の分布とともに血漿中から の薬物のきわめて速やかな消失が生じた。しかしながら、リポソーム中に封入し てビンクリスチンを投与した場合には、血漿中からの薬物の消失はかなり遅れた 。

表１は、遊離ビンクリスチンとリポソーム中に封入されたビンクリスチンの投与 後の選ばれた組織内での薬物濃度の測定値を示す。遊離ビンクリスチンの場合に は２時間目の肝臓内の薬物濃度は１ｇ組織当たり５０％ｇであり、１■／ｋｇと ５■／ｋｇの投与量のリポソームに封入されたビンクリスチンの場合には、それ ぞれ１ｇ組織当たり１０００ｇと２６Ｏｒ＋ｇだった。しかしながら、遊離ビン クリスチンでは８時間目には肝臓内の薬物濃度は検出することができなかったの に対して、リポソームに封入されたビンクリスチンの場合には１■／　ｋｇと５ ■／ｋｇの投与量で薬物濃度は、それぞれ１ｇ組織当たり７５％ｇと１６０ｎｇ だった。更に、観察のすべての時点において膵臓内の薬物濃度は、遊離ビンクリ スチンと比べてリポソームに封入されたビンクリスチンで２倍から３倍高かった 。これとは対照的に、遊離ビンクリスチンの投与後の脳内薬物濃度は、１ｍｇ／ ｋｇの投与量でも５■／　ｋｇの投与量でもリポソームに封入されたビンクリス チンよりも高かった。１■／ｋｇの投与量の遊離ビンクリスチンまたはリポソー ムに封入されたビンクリスチンの投与後の肺内濃度は、異なる観察期間で似てい た（表１）。

試験管内でのＬｌ　２１０白血病細胞に対する細胞毒性評価Ｌ１２１０白血病細 胞を１０％のウシ胎児血清とゲンタマイシン（５０μｇ／ｒｎりを添加したＲＰ ＭＩ培地１６４ｏ中に懸濁させて５％の二酸化炭素を含む空気中で培養した。２ ５ｃＩＴ１２容のプラスチック製フラスコ中の１ｍｊ２培地当たりｌＸ１０５個 の植え込み数の対数期細胞を、異なる量の遊離ビンクリスチンまたはリポソーム 中に封入されたビンクリスチンで３７℃で２４時間処理した。薬物処理後に、細 胞をファルコン試験管中に移して、６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上滑 培地を捨てて、細胞ベレットをＲＰＭＩ培地１６４０で三回洗浄した。最終細胞 ベレットを１０ｍ１のＲＰ　Ｍ　Ｉ培地中に再懸濁させて、２５ｃｍ’容のプラ スチック製フラスコ中に移してから５％の二酸化炭素を含む空気中で３７℃でイ ンキュベートして培養した。

４８時間目と７２時間目に、各フラスコからの一定量の細胞を取り出して、顕微 鏡下でトリバンブルー排除によって生存率を計数した。各フラスコ中で増殖した 細胞の数を対照と比較して決定した。図３は、遊離ビンクリスチンまたはリポソ ーム中に封入されているビンクリスチンで処理した場合の細胞の生存パーセント を示す。図かられかるように、Ｌ１２１０ネズミ白血病細胞に対する遊離ビンク リスチンのＩＣｓ。は０．００４μｇ／ｄであるのに対して、リポソームに封入 されたビンクリスチンのＩＣ６゜は０．００３μｇ／ｍｌ！である。この実験は 、リポソーム中に封入されたビンクリスチンが試験管内で白血病細胞に対して遊 離ビンクリスチンと同等の細胞毒性を有する事を示す。

マウスでのＬ１２１０ネズミ白血病を使っての抗腫瘍研究ＤＢＡ／２Ｆ、雌マウ スで連続的に腹腔内接種することによってＬ１２１０白血病を維持した。抗腫瘍 研究のために、２Ｘ１０５個のＬＩ２１０白血病細胞をＣＤ、Ｆ、雄マウス（２ ２−２５ｇ）の腹腔内に移植した。腫瘍移植の２４時間後に、マウスに２ｍｇ／ ｋｇと３　ｍｇ　／　ｋｇの遊離ビンクリスチン又は２．３．５．０および７． ５＋ｎｇ／ｋｇのリポソームに封入されたビンクリスチンを一回静脈内注射した 。各薬物投与群と生理食塩水投与白血病対照群は各群へ匹のマウスを用いた。各 動物の死亡日を観察した。ＩＬＳの％（寿命増加のパーセント）としてデータを 示す。各群の平均生存期間から平均寿命を計算して、寿命増加の％を下式に従っ て計算した。

“ｃｕｒｅｓ”として処理マウスの平均生存期間の計算に含めた。

結果を表２に示した。生理食塩水投与対照動物または空リポソーム投与対照動物 は、平均１１日間生存した。遊離ビンクリスチンの２ｍｇ／ｋｇ投与は、１４． ５日の平均生存期間と３２％のＩＬＳと２／８例だけの長期生存をもたらした。

遊離ビンクリスチンの３■／　ｋｇ投与は７．５日という腫瘍マウスの平均生存 期間と一３２％のＩＬＳをもたらしたが、この事は、腫瘍マウスが腫瘍よりもむ しろ薬物の毒性のために死亡したことを示す。この群の動物はすべて１００日目 でに死亡した。これとは対照的に、すべての投与量のリポソーム封入ビンクリス チンはＬ１２１０白血病マウスでもっとずっと高い治療効果を示した。例えば、 リポソームに封入されたビンクリスチンの２ｍｇ／ｋｇ投与は３５４％より大き いＩＬＳと５００日目おいて４／８のマウスの生存をもたらした。もっと高い投 与量のリポソーム中に封入されたビンクリスチンの投与は、５００日目白血病マ ウスの大多数が生存したというさらに著しい治療効果を生じた。すなわち、リポ ソームに封入されたビンクリスチンの３．０．５．０および７．５　ｍｇ　／　 ｋｇ投与は３５４％より大きいＩＬＳとそれぞれ６／８．７／８および４／８の 長期生存をもたらした（表２）。

正常マウスでの遊離ビンクリスチンとリポソームに封入されたビンクリスチンの 毒性評価 Ｌ１２１０白血病マウスで行われた研究で、リポソームに封入されたビンクリス チンの耐性は同時に起こる治療活性の増加と共に高められる事が示された。従っ て、遊離ビンクリスチンとリポソーム中に封入されたビンクリスチンの致死毒性 を、マウスで、薬物の投与量の関数として評価した。正常なＣＤ＝Ｆ＋マウスに 、遊離ビンクリスチンを２■／ｋｇと３■／ｋｇ−回静脈内投与し、リポソーム に封入されたビンクリスチンを１．５．２．０．５．０および７．５ｍｇ／ｋｇ −回静脈内投与した。マウスの死亡を毎日観察し、毒性による体重変化を記録す るためにマウスの体重を一週間に二回測った。図４と図５に示したように、２ｍ ｇ／ｋｇの遊離ビンクリスチンを注射されたマウスは実験が終了した６００日目 で死ぬことなく生存した。しかしながら、３ｍｇ／ｋｇの遊離ビンクリスチンを 投与されたマウスは著しい死亡率を示し、マウスの９０％が８日目までに死亡し た。これとは対照的に、１．５．２．０および５．Ｑｍｇ／　ｋｇのリポソーム 封入ビンクリスチンを投与されたマウスは死亡せず６００日目１００％生存して いた。７．５■／ｋｇの投与量のリポソームに封入されたビンクリスチンの場合 には、７日目にわずか一匹の動物が死亡し、この群の残りの動物も６００日目で 生存した。この試験により、より高い投与量のリポソームに封入されたビンクリ スチンを毒性を生ずることなくマウスに投与することができる事が証明された。

表１ ビンクリスチン濃度 （ｎｇ／ｇｍ組織） 薬物　　　　　　　５’　　　１５’　　　３０’　　ｌｈ　　　　２ｈ　　　 ４ｈ　　　８ｈ　　　２４ｈ遊離ビンクリスチン　　　２．０　　　　　１４． ５　　　　　３２　　　　　２／８遊離ビンクリスチン　　　３．０　　　　　 　　？、５　　　　−３２　　　　　０／８明らかに、上記の教示にかんがみて 本発明の非常に多くの部分的変更と変形が可能である。従って、添付の特許請求 の範囲の範囲内であれば、明細書中に明記されているのとは異なった方法で本発 明を実施することもできる。

５　　　　　　　＋０　　　　　　１５　　　　　　２０ビンクリスチン［ｎｇ ／ｍυ ＦＩＧ、３ 生存率（％） 生存率（％） 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ビンクリスチン、ビンブラスチン及びビンデシンから成る群から選ばれた少 なくとも一種のビンカアルカロイドが封入されたリポソームを含有することを特 徴とする組成物。
2. ２．ビンカアルカロイドがビンクリスチンである請求項１記載の組成物。
3. ３．ビンカアルカロイドがビンブラスチンである請求項１記載の組成物。
4. ４．ビンカアルカロイドがビンデシンである請求項１記載の組成物。
5. ５．ビンクリスチン、ビンブラスチン及びビンデシンから成る群から選ばれた少 なくとも一種のビンカアルカロイドが封入されたリポソームを含有する組成物の 有効量を患者に投与することを特徴とする該患者の必要時に腫瘍を治療する方法 。
6. ６．ビンカアルカロイドがビンクリスチンである請求項５記載の方法。
7. ７．ビンカアルカロイドがビンブラスチンである請求項５記載の方法。
8. ８．ビンカアルカロイドがビンデシンである請求項５記載の方法。
9. ９．腫瘍が非ホジキン病性リンパ腫、ホジキン病性リンパ腫、急性リンパ芽球性 白血病、ヴィルムス腫瘍、横紋筋肉腫又は神経芽細胞腫によって引き起こされた ものである請求項５記載の方法。