JPH04504564A - 有機酸で処理しリポソームにカプセル封入した親水性活性物質を含む薬用合成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　有機酸で処理しリポソームにカプセル封入した親水性活性物質を含 む薬用合成物 ！呵ｍ分立 本発明は、有機酸で処理して２個の分子間に複合体を形成し５リボンームにより カプセル封入したところの親水性活性物質を含有してなる薬用合成物に関する九 行技術例！！ 薬効特性を示す物質は多く存在するが、その中にすべて良好な薬効物質を有する とは限らないため、効率よく使用することは出来ない、投与を増すことで、こう した非効率な薬効を補おうとする場合かえって毒性につながるのは疑う余地もな い、従って、活性物質において、反応が極めて弱く、極めて持続性の短い時にこ れを補うため投与を高めると毒性が高められたり或いは副作用（アレルギー系、 消化器系、腎臓系、神経系、血液系その他の副作用）を起こす危険性がありうる 。特に、ゲンタミシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉ　ｎ）及びその他アミノグルコサイ ド抗生物質等における腎臓毒性、耳科襄性、神経毒性が今まで集中的に引き上げ られ報告されている。

しかも、ゲンタミシン等の抗生物質のカプセル封入に関する刊行物（Ｍｏｒｇａ ｎ、Ｊ、Ｒ，ａｎｄ　Ｗｊｌｌｉａｍｓ、に、Ｅ、、１９８０．Ａｎｔｉｍｉｃ ｒｏｂ、Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、よヱ°５４４　５４８：Ｂａｒｚ ａ、Ｍ、　、Ｂａｕｍ、Ｊ、ａｎｄ　５ｚｏｋａ、Ｆ、、１９８４．Ｉｎｖｅｓ ｔ、ｏｐｈｔａｌｍｏｌ、Ｖｉｓ、ｓｃ　２旦　４８６−４９０）によれば、カ プセル封入の程度が５％ないし２５％程しか達成できないことを伝えている。

その他公報（ＷＯ−Ａｌ−８８１０４５７３，Ｔｈｅ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ；Ｗｏ−Ａｌ−８７１０００４３，Ｔｈｅ　ＬｉｐｏｓｏｍｅＣｏｍ ｐａｎｙ；５ｃｈｒｅｉｅｒ、Ｈ，ａｎｄ　ｃｏｌ＋、、１９８７．Ｊ。

Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　５：１８７−１９２＞では、抗生物質 のカプセル封入技術に関して無機分子の使用のみ言及されているだけである。

又、脱水リポソームからなるゲルを調製する過程で有機酸を使用することが欧州 特許（ＥＰ−Ａｌ−０２１１６４７）より公知となっているが、これは薬物分子 と結合するものではなく、カプセル封入した分子と比べるとｐＨ値が極めて高く なる。この場合の有ｍ酸はリポソームの再水和作用を起こすためのみに使用され る。

光９し２ＪＬ的 本発明は、カプセル封入した後に活性物質を放出する際、外部媒体における同活 性物質の濃度と反比例するような形式で自己印胴する重要な特質を有する製品を 提供するものである。従って、毒性につながる投与量もしくは不充分な投与量の 問題を起こさないとともに、投与した抗生物質を持続して作用させる利点がある 。

斯かる特質は一定の応用部門、特に眼科方面で貴重となる。この眼科方面の利用 については後に説明するが、この分野では、活性物質の濃度が高すぎる場合、取 り返しのつかない障害を与えてしまうことがある６本発明の製品は更に５ｏ％に なる程の高いカプセル封入度がある。

隻咀の社微部分 上記目的を達成するため、本発明は、親水性活性物質を有機酸で処理し、双方の 分子を結合せしめ、リポソームによりカプセル封入した薬用合成物を提案するも のである。この薬用合成物は、親水性活性物質が有機酸のカルボキシル基又はそ の複数のカルボキシル基と結合した際、リポソーム内の容量が最大となることを 特徴としてもよい、親水性活性物質の中では、アミノグルコサイド抗生物質（ａ ｍｊｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）が好ましい。

アミノグルコサイド抗生物質とは、側鎖に複数のＮＨ，基を構成するグリシジル 残留物からなる分子と解釈されている。斯かる用語には、所謂アミノグルコサイ ド抗生物質と今まで薬学上定義したものに相当する分子の他の分子票をも含むも のとする。

特に、ゲンタミシンを４．５のオーダーのｐＨ値において有機酸を使用して処理 する。

有機酸の中でも、アミノ酸が好ましく、特にグルタミン酸もしくはエチレンコハ ク酸やクエン酸などのポリカルボン酸が好ましい。

しかし、酢酸やギ酸なとの革純な酸でもよい。

本発明で使用するリポソームはコレステロールを有する所謂“多重層”状（ＭＬ Ｖ）のものである。

本発明では、リポソームに間し、Ｅｇｇ　Ｐｃ／Ｃｈｏｌの分子比が４／１〜４ ／６の間であるコレステロールを有する複層状リポソームを概す好ましいものと する、該分子比のうち、４／６に近い分子比が特に好ましい。

更に、本発明によれば、親水性活性物質を直接カプセル封入することにより、即 ち、親水性活性物質を有機酸に接触することにより、リポソームの形成とともに 、カプセル封入して上記製品を得る方法を提供する。

本発明の製品は、カプセル内の活性主要物が放出する際、外部媒体に放出した度 合に対して逆比例して放出されることが判明され、非常に製品の価値が高いもの である。生体の局部又は全身に応用することができ、リポソームをその同性に従 い目標物に指向させるといった副次的な作用を持たせることもできる。又、何か を付着させてリポソームすることもでき、この場合、特にある膜や組織に優先し てリポソームを寄せる場合に適している。

本発明の製品の好ましい態様は、ｐＨ値が４．５〜７５の間において、リポソー ムを浮遜せしめた状態である。

必要に応じ、ＰＨ値を生体レベルに再調整した後、リポソームを調製してこれを 非経口的に適用したり、エアロゾールとして適用してもよい、又、経口投与も考 えられるが、経口投与の場合、ゲンタミシン等の物質は通常吸収されない。

又、本発明の製品は身体局部用の薬品、特に眼科用の薬品の調製に使用できる利 点がある。

の　い、の 本発明に係る製品は、親水性活性物質と有機酸基もしくは複数の有機酸基とを結 合させた後、リポソームによりカプセル封入したことを特徴とするものであるこ れより、本発明に係る製品の調製手順を具体的に示す様々な試験結果と実際の例 に基づいて同製品を詳細に説明する。

尚、本発明が提案する技術の効果は、諸々のパラメーターを逐次検討して立証し たものである。

Ｈ４，５における　ン　ミシン　ルタミン　の　ム酸塩基滴定法により、親水性 活性物質と有機酸とを混合させると同親水性活性物質と同有機酸のカルボキシル 基とが特異結合する特性がある。

０．９９８Ｍのグルタミン酸を０．ｌ０１ＭのＫＯＨと０．９９９ＭのＨｃｌと で滴定を行った（図４の参照）、同一の手順により０．９９８Ｍの飽和状態のゲ ンタミシンについて滴定を行った（図１ｂ参照）、これら２つの分子を１モル対 １モルで混合して滴定を行った０図１ｂが示すように、ＰＨ値が４．５のオーダ ーのもとにグルタミン酸のカルボキシル基の一つが消失した。

ル　ミン　ム　ｔ・ゲン　ミシンの１ポソームカプセルリポソームの形成ｆ１１ 時間経過して、ゲンタミシンがカプセル封入されたことを測定。

土層Ω余任 リポソーム合成体：卵黄（Ｅｇｇ　Ｐｃ）とコレステロール（Ｃｈｏｌ）のホス ファチジコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｈｏｌ　１ｎｅ）斯かる合成要素の 分子比：４７３及び４／６脂質要素の総量：６０ｍｇ ゲンタミシ７：１ｍｇ、１０ｍｇ及び２０ｍｇカプセル封入時の容量：　１ｍ１ ．０．５ｍｌ及び０．２５ｍ１力プセル封入時のＰＨ値：４．５及び７．５力プ セル封入時のＩ！衝液：グルタミン酸／ＫＯＨ（浸透度：水の２８５ｍ０５ｍ／ Ｋｇ）腎ポソーム　プセル　の　゛ ＥｇｇＰｃとコレステロールの乾燥膜を形成し：上記のグルタミン酸とゲンタミ シンの混合物を加え；渦流によってリポソームを浮遜させ； 室温にて１時間インキュベートし； ５０００ｒｐｍにて１０分閲還心分離し：カプセル封入時のｐＨ値と同じｐＨ値 に緩衝処理したグルタミン酸溶液を使用して、リポソーム小球体（Ｌｉｐｏｓｏ ｍｅ　ｐｅｌｌｅｔ）を洗浄する。

様々な角度より試験を行い、その結果を表１にまとめな。

表１．ＰＨ値、リポソーム成分、カプセル封入容量の点から分析したグルタミン 　・ゲンタミシン　４体のカプセル　（％ｐＨゲンタミシン　分子比　容量　カ プセル封入率（％）　Ｎｍ　ｍｌ　土準：差 ４．５　１　４／３　１　１０．５±１　２４４．５　］　４／３　０．５　１ ８．２土０，３　３４．５　１　４／３　０．２５２＋、６　１４．５　１　４ ／３　１　７．８±０．９３７．５　］　４／３　１　１０１±１．５　２６４ ．５　１　４／６　１　３３．５±３１０４．５　１　４／６　０，５　３７． ５±５３４゜５　１　４／６　０．２５４６．ｌ　１４．５　＋０　４／６　１ 　３５．４±３，５４４．５　２０　４／６　１　３５±３５８７．５　１　４ ／６　１　３３．５土３６カプセル封入効率は８％から４６％まで差異がある。

最適なカプセル封入状態を得たのは、ｐＨ４，５のらとに容量０−２５ｍ１にお ける４／６のリポソーム合成体を使用した場合であった。

カプセル　率に・　るグルタミン　Ｈの１実験を行った条件ニ ー脂質濃度：６０ｍｇ／ｍｌ −ゲンタミシン濃度＋１ｍｇ／ｍ＋ −グルタミン酸のｐ）（値：３．４．５．７．５−インキュベート時閉・１時間 ゲンタミシンのカプセル封入効率はｐＨ３がらｐｉ−１４，５において高まり最 大となる。ｐＨ７，５ではカプセル封入効率はｐＨ４，５の測定のものと比べ若 干低い（図２ａ参照）。

―ポソーム”　に　る　ルタミン　Ｈのリポソームの容量を測定する手段として ”Ｃで標識したイヌリンをカプセル封入する方法をとった。実験を行った条件は 次の通りである。

−脂質濃度：６０ｍｇ／ｍｌ −ゲンタミシン濃度：２０ｍｇ／ｍｌ −グルタミン酸ＰＨ値：３，４．５，７．５−Ｔｒ　ｉ　５−Ｈｃ　Ｉｌｌ衝液 ｐＨ値ニア、５−インキュベート時間：１時間 表２が示すように、リポソーム内の容量はｐＨ７，５において、グルタミン酸の 存在下ではＴｒｊｓ−Ｈｃｌ［衝液に対し増加はない、しかし、ゲンタミシンを ｐＨ７，５のＴｒｉｓ−Ｈｃｌ［衝液に加えると、リポソーム容量は変化する、 一方、ｐＨ７，５でグルタミン酸にゲンタミシンを加えるとリポソームの大きさ が一段と高まる。

表２．ｐＨ値及びカプセル封入媒体成分の点から分析したリポソーム内の容量 の ｐＨゲンタミシン含有のりポソーム　ゲンタミシンを含有しないリポソーム合成 体ミ＞ＩＩ／ｋＯＨＴｒｉｓ−ｔｌｅｌ　グルタミン　／ＫＯ３Ｔｒｉｓ−Ｈｃ ｌ４．５　１７６±５μｍ９０±１９ｍ１７．５　ｎ、３±１１６７±０．６＃ ＋　５３±３Ｊｌｌ　５４±５１緩衝剤として使用したグルタミン酸にゲンタミ シンを加えると３つのｐＨ値において、リポソーム容量が増大する。特にｐＨ４ ，５ではゲンタミシンが加えられることによってリポソーム容量が２倍に増大し 、より参著となる（表２及び図２ｂ）。

その　の　に　るリポソームカプセル。

エチレンコハク酸、酢酸、ギ酸を使用してｐＨ４，５のちとにゲンタミシンのカ プセル封入を行った。

この場合のカプセル封入効率はグルタミン酸で行った時の実験条件と同じ条件で 分析してみるとグルタミン酸によるカプセル封入効率の数字と同一の結果となっ た。

特に、眼利治療用のクエン酸／ギ酸＃！Ｉ衡液を使用してカプセル封入を行った 。

表３．ｐＨ値及びリポソーム成分（脂質６０ｍｇ）の点から分析した、クエン酸 ／ギ！ｔＩＩｙＩＩ！Ｊ液と混合せるゲンタミシンの　プセル　（％） ｐＨゲンタミシン濃度　分子比　カプセル封入％　Ｎｍ　ｍｌ　±　゛日 ４．５１４／３　１５．９＝６ｊ　３ ？、５　］　４／３　１２．５土２，１　３４．５１４／６　３４±２．８３ ７．５　１　４／６　３５土４．Ｉ　３尚、前記＃ｌＷＩ液と混合したゲンタミ シンをｐｉ−１４，５又はｐＨ７，５のもとに、Ｅｇｇ　Ｐｃ　Ｃｈｏｌの分子 比が４７６のリポソーム組成でカプセル封入すると、最適なカプセル封入効率（ ３５％）を得る。

カプセル　しｔ・ゲンタミシンの ゲンタミシンをｐＨ３，ｐＨ４，５及びｐＨ７，５のちとにカプセル封入した後 、ゲンタミシンがリポソームより放出する場合の放出時間と放出のための最適な 量について調べてみた。

そのため、次のような２個の生理媒体によりゲンタミシン放出の分子的な動きを 分析した。

−ｐＨ７，２，３００ｍＯｓｍｏ　Ｉ／Ｋｇの水におけるウシの眼の硝子体液 −ＰＨ７，２，２８７ｍＯｓｍｏ　Ｉ／Ｋｇの水におけるウサギの血漿 一３７°Ｃでゲンタミシンの放出を行う。

実験のための条件ニ ー脂質濃度＋６０ｍｇ／ｍｌ −ゲンタミシン濃度：１ｍｇ／＋ｎｌ −Ｅｇｇ　Ｐｃ／Ｃｈｏｌの分子比：４７３−グルタミン酸によるカプセル封入 のＰＨ値：３，４．５．７．５リポソームを形成し洗浄した後、出来たリポソー ムの小球体を上記硝子体液又は血漿１ｍｌの中に浮遜させる。

そして、リポソーム中に残るゲンタミシンを数回測定する。

ウ　の　（３ａ ｐＨ４，５のもとにグルタミン酸を使用して形成せるリポソームからのゲンタミ シン放出は緩やかである。血漿中に放出するゲンタミシンが臨界値に達すると、 ゲンタミシンはリポソームからの放出を停止する。この時、血漿を取り替えると 、ゲンタミシン放出は再び行われる。（図３ａを参照０図中Ｗは、ゲンタミシン で満たされた血漿を新しい血漿に取り替える時点を示す、）斯くして、数回血漿 を新たに処理した後、リポソームからゲンタミシンが完全になくなる。これは言 い換えると、ゲンタミシンをカプセル封入したリポソームを生物の体液に注入す ると、リポソーム中のゲンタミシンの総量がリポソーム外界のゲンタミシン温度 により逆印刷されながら徐々に放出していくことを示す。

１と班±生液土Ω旗門 ｐＨ４，５又はＰＨ７，５のちとにグルタミン酸Ｍｔ液を使用してゲンタミシン をカプセル封入した場合に、このカプセルがウシ硝子体液中においてゲンタミシ ンが放出していく過程は上記ウサギ血漿中の放出と同様である（ＩＺ３ｂ）。

即ち。

一緩やかな放出 一硝子体液中ゲンタミシンが飽和 −その硝子体液を取り替えて放出を再回ここで、硝子体液が飽和状態になるまで のゲンタミシンのパーセンテージは、ｐＨ４，５よりもｐＨ７，５の方が大きい 。

従って、グルタミン酸によるカプセル封入のｐＨ値の選択によって様々な治療条 件に応じて薬物の放出特性を示す薬品形態を提供することができる。

ところで、ｐＨ３のもとにグルタミン酸でカプセル封入したゲンタミシンを生物 体液に注入した場合、上記のようなゲンタミシン混度による逆抑制は行われない 、ゲンタミシンはそのまま継続して放出される（図３ｃ）〉インビボ（ｉｎｖｉ ｖ□　にお番るウサギ　のゲンタミシン実験条件： −リポソーム：ゲンタミシン２０ｍｇ／ｍｌと脂質（Ｅｇｇ　Ｐｃ／Ｃｈｏｌの 分子比が４７６のもの）２０ｍｇ／ｍ＋、カプセル封入のための時間：１時間− ゲンタミシン１ｍｇを含むリポソーム小球体をＯ，１ｍｌとりこれを麻痺した複 数類のウサギの硝子体液に注入。

−２４時ｒＷＩ後、４８時間後、それぞれウサギを殺し、硝子体液を取出す。

−硝子体液を遠心分離処理しく５０００ｒｐｍ、２０分間）リポソームと硝子体 液を分離して、この２つの分画におけるゲンタミシンの量を測定する。

−測定結果は、硝子体液に放出されたゲンタミシン量とリポソームに残留するゲ ンタミシン量の比率により算出する（表４）。

４、インビボにおける　中の　ン　ミシンのウサギ　時間　分離液中浮上した ゲンタミシンとりポソーム ハ　の Ｎｏ、１　２４時ＩＨ！　７．７９％ Ｎｏ、２　２４時間　６．２６％ Ｎｏ、３　４８時間　６．８３％ Ｎｏ、４　４８　日　５０９％ 以上のようにリポソーム小球体を硝子体液に注入した後２４時量から４８時間、 ゲンタミシンの比率は一定のままである。このことは、インビボにおいてゲンタ ミシンがゆっくりと一定して生物体液中に放出していることを示す。

Ｎｏ、４　４８　５．０９％ 以上のようにリポソーム小球体を硝子体液に注入した後２４時間から４８時間、 ゲンタミシンの比率は一定のままである。このことは、インビボにおいてゲンタ ミシンがゆっくりと一定して生物体液中に放出していることを示す。

図面の簡単な説明 第１ａ図は、グルタミン酸のみの酸塩基滴定測定を示す表。

第１ｂ図は、ゲンタミシンのみの酸塩基滴定測定を示す表。

第１Ｃ図は、ゲンタミシンとグルタミン酸の混合物に対する酸塩基滴定測定を示 す表。

第２ａ［Ｎは、ｐＨ値（グルタミン酸／ＫＯＨ）の点から分析したリポソーム（ ＭＬＶ）によるゲンタミシンのカプセル封入率を示す表。

第２ｂ図は、ｐＨ値（グルタミンＭ／ＫＯＨ）の点から分析したリポソーム内の 容量の測定を示す表。

第３ａ図は、ＭＬＶでカプセル封入したゲンタミシン（１ｍｇ／ｍｌ）のウサギ 血漿中での放出を示す表。

第３ｂ１２１は、硝子体液中のゲンタミシンの放出を示す表。

第３ｃ図は、硝子体液中のゲンタミシンの放出を示す表である。

ｍｌ　ＨＣＩ　ｍｌ　ＫＯＨ ｒｒｄ　ＨＣＩ　ｍｌ　ＫＯＨ ｍ＋　１４ｃ１　ｍｌＫＯＨ 戸 ３．００　４，５００　７，５ Ｈ 峰１＄ＸＫ） Ｕ臀６＾（ｌ（〕 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年４月１２日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．有機酸で処理し、有機酸との結合を確実にする値までｐＨ値を調整し、リボ ソームによりカプセル封入してなる親水性活性物質からなることを特徴とする薬 用合成物。
2. ２．前記親水性活性物質と前記有機酸のカルボキシル基が相互に反応することを 特徴とする特許請求の範囲１に基づく薬用合成物。
3. ３．前記線水性活性物質がアミノグルコサイド抗生物質であることを特徴とする 上記すべての特許請求の範囲に基づく薬用合成物。
4. ４．前記アミノグルコサイド抗生物質が、ｐＨ値が４．５から７．５のオーダー において、有機酸により処理された飽和ゲンタミシンであることを特徴とする特 許請求の範囲３に基づく薬用合成物。
5. ５．使用する前記有機酸がアミノ酸より選択されたもので、特にグルタミン酸か らなり、もしくはエチレンコハク酸やクエン酸算のポリカルボン酸より選択され たもの、もしくは酢酸やギ酸等の単純な酸より選択されたものであることを特徴 とする上記すべての特許請求の範囲に基づく薬用化合物。
6. ６．使用する前記リボソームが“多重層”状（ＭＬＶ）のもので、好ましくはコ レステロールを有するものであることを特徴とする上記すべての特許請求の範囲 に基づく薬用化合物。
7. ７．ＥｇｇＰｃ／ｃｈの比率が４／１から４／６の間であって、好ましくは４／ ６のオーダーであるところの、コレステロールを有する多重層リボン−ムを使用 することを特徴とする上記すべての特許請求の範囲に基づく薬用化合物。
8. ８．前記親水性活性物質を前記有機酸に接触させ、然る後、リボソームの形成と ともに、カプセル封入せしめることを特徴とする上記すべての特許請求の範囲の 製品を製造する方法。
9. ９．上記特許請求の範囲１から７までの製品を、必要に応じて生体レベルのｐＨ 値に再調節した後、非経口的、経口的またはエアロゾールとして投与する薬品を 調製するための使用。
10. １０．上記特許請求の範囲１から８までの製品を、身体の局部用の、特に眼科用 の薬品の調製に使用。