JPH04503259A - 多数の試料を乗せるフィルターおよびその他の支持体の迅速・指標分析用の顕微鏡用ステージおよび前記ステージを使用する、そのような試料の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多数の試料を乗せるフィルターおよびその他の支持体の迅速・指標分析用の顕微 鏡用ステージおよび前記ステージを使用する、そのような試料の分析法 本発明は、可撓性または硬直で、生物学的又はその他であり得る複数の試料を載 せる多孔性支持体（フィルター）又は非多孔性支持体を保持するためのステージ に関し、且つ上記ステージを使用して前記試料を分析する方法に関している。該 ステージは、光学式顕微鏡の下に置くのに適当であり、在来のステージに重ねて 置くことも可能であるが、取替えて使用することもできる。本発明のステージは 、特にコンピュータによる自動画像分析を使用することによって、試料を迅速に 分析するのに特に適している。

顕微鏡観察では、検体はスライドグラス上に置き、一般にカバーグラスで覆われ ることが想い浮かぶ。フィルター上の細菌を分析するときには、フィルターが十 分に平坦であることを確認するために現在知られている唯一の実施可能な方法が 、フィルターをスライドグラスとカバーグラスの間に置くことであるとすれば、 この付加の支持体が当然存在することになる。

一般に、顕微鏡のステージには焦点調節台に固定されている固定用面が含まれて いる。このステージの平面はＹ方向に移動し、スライドは、Ｘ方向に移動可能な 万力によって保持されている。スライドはステージに対面して置かれ、スプリン グの押さえ金具が側方でスライドを押さえている。実用面では、このシステムに は次の２つの欠点がある。

１）スライドグラスはステージの面に対して少し傾いていることがあり得る。

２）スプリングによって生じる側方からの応力によってスライドにわずかな曲が りが生じることがある。

従って、大倍率で、Ｘ−Ｙ軸の移動を行うと、顕微鏡操作者が一般に絶えず片手 でマイクロメーターのねじを動かしていなければならない程度に焦点を再調節し 続けることがどうしても必要となる。

顕微鏡と組み合わされた画像分析コンピューターの使用がますます増加すること によって、ステップモーターによって駆動されるＸＹステージが使用されるよう になった。更に高級化したモデルでは、特殊な上置型ステージによってスライド の圧迫方法が改善されている。

在来分析、自動分析のいずれが実施されるかにかかわらず、スライドが非常に薄 くて（１、２ｍｍ）且つ非常に長い（７５ｍｍ）場合には、システムには、決し て正確には平面にならないスライドグラス（最も一般的なサイズは７５ｍｍＸ　 ２５ｍｍＸ　１゜２ｍ１１１である）が使用される。更に、スライドは安価な消 耗品であり、これに対して非常に特殊な光学的性状を要求することはできない。

スライドが薄いことが光学的理由から望ましいことが認められている。通常の顕 微鏡使用では、光は集光器経由で下から入る（透過光）。照明が強力で均一であ ることを確保するには、対物レンズと同様に集光器も物体に接近させておくこと が必要である。

このことは、非常に大倍率では不可能である。１００倍の倍率（２０００倍の総 合倍率を与える）を持つ対物レンズは、物体から約０．　２ｍｍの距離に配置さ れる（これでは、物体の上方にカバーグラス用の隙間が丁度残るだけである）。

もちろん、外蛍光（６ｐＨＩｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　）を使用する場合には、照 明は対物レンズ経由で入るので、集光器を使用する必要はない。

フィルターを使用する場合、スライドとカバーグラスの間にフィルターを置くこ とは、フィルターを十分に平坦にするのに利用できる唯一の技法である。

濾過は、基体や液体中に含まれている粒子の分析用に、ますます多用されている 現状である。これらの粒子は性状が様々であり、生物学的、鉱物性、金属性等々 であり得る。ＩＮは、牛乳中の細菌を分離・計数することである（“ニュークレ オボア（ＮＵＣＬＥＯＰＯＲＥ）”マリボア（Ｍ［１ＬＬＩＰＯＲＥ　）“等の 商品名で知られているフィルターを使用する）。

液体マウント支持体が必要になることも記憶しておくべきである。この支持体に は、油、粘稠支持体（カナダバルサム）、オーバータイム（ｏｖｅｒ　ｌｉｍｅ 　）を設定する支持体などがある。

対応する操作は比較的困難であり、高い分析効率という考えと相入れない可能性 が高い。

更に、正確な平面性の標本を得ることも非常に困難である。フィルターを正確に 圧縮することは不可能で、上記のマウント液の厚さに生じる避けられない不同に よってカバーグラス自体に変形が生じる（このことは、液浸油が対物レンズとカ バーグラスの間に挿入された場合には、あまり重大ではない）。

それゆえ、乾燥時に直接観察するため、簡単にスライドグラスの上にフィルター を置（ことは理論的に不可能であることを知っておくべきである。フィルターの うねりが非常に大きくなると考えられる。しかし、そのような観察がもし可能に なれば、簡易性と迅速性の点で、極めて大きい利点が生じるであろう。

従って、最適の性能を示す自動画像分析は、試料を調製・観察する方法の不適性 によって劣化した性能を示している。ジェー・シー　ビスコント（Ｊ、Ｃ，ＢＩ ＳＣＯＮＴＥ）は、別途、画像分析による連続観察用に透明フィルムを使用する 方法を記載している（フランス特許ＦＲ−２５６５３５０およびヨーロッパ−ビ ーシーティー　特許出願ＷＯ３５１０５５６３で公表された特許を参照）。

各スライドについて、画像分析を初期化し特に焦点調節を確認することが必要で ある。

この焦点調節問題は、小さな粒子の分析で最も困難な部分であり、特に最近の分 析の場合にそうである。

このような情況においては、細菌の大きさは、１ミクロン以下であることがある こと、および最適の観察条件下では、視野の焦点深度は約半ミクロンであること を念頭におくとよい。従って、約１ミクロンの平坦性の欠陥は、細菌を完全に焦 点から脱れさすのに十分であり、そのため細菌は自動分析には不適となる。

画像分析では、最良の焦点を得るために自動調節を実施することが可能であるが 、この操作は時間が掛かる。

最良の調節（観察された物体で最高の鮮明度）を得るために、３乃至１０段階（ 増分０．２５５ミフロンフステージで検査することが必要になる。

フィルターの表面の平坦性に大きな変動（例えば約５０ミクロン）がある場合に は、何もない視野に対する画像分析は、この視野に実際に細菌がないのか、それ ともこの視野がひどく焦点かうずれているのかを決定することができなくてはな らない。

このような視野を分析するには、通常１０〜２０秒が十分に必要である。

不都合なことに、これにはまったく誤った成績を与えるリスクがあるので、この ような視野を“飛ばしてしまう“ことはできない。

英国特許出願２１４１２５４（フィルスＭｉｌｅｇ）には、対象を観察窓で安定 した位置で観察できるように保持する装置が記載されている。この目的のために 、この装置は次の組合せ構成を具備している。

平行した主要面およびその中に貫通した開口の中心部に配置された透明材料性の 光学的観察窓を持つ板、光学的観察窓の周囲の環状の吸引隙間、環状の吸引隙間 を真空源（又は減圧源）に接続するダクト。

更に詳しくは、フィルスは、可撓性フィルムを支持するのに不適当である在来の 顕微鏡のスライドキャリアーを交換し、更に汚染又は擦れが生じないように、上 側の主要面への接触を避けることが最も重要であると述べており、その結果、フ ィルスは本発明の技術的背景を構成し、また一方で本発明の最も詳細な態様も図 示しているものと考えるべきである。

従って、本発明の目的は、可撓性又は硬直な、多孔性支持体（フィルター）又は 非多孔性支持体を支持し、生物学的又はそれ以外でありうる試料を載せるステー ジ、即ち従来のステージより良好に実用上の要求条件を満足するステージを提供 することであり、これは特に、１）正確に平坦である分析用支持体を得ることを 可能にする ２）コンピューターによる自動画像分析用又は手動分析用として、分析が容易に できるように指標を付ける方式で（同一の支持体の上に配置し、つねに同一のＸ 、Ｙ、Ｚ方式で表示した）１個以」二の試料を、自動的且つ迅速に把握するのに 特に適している ３）最良の焦点を自動的に探すのにも適している４）透過光、外蛍光（’ｅｐｉ −ｆｌｕｏｒｅｓｃｃｔ＋ｃｅ）いずれの方式による観察にも適合する ５）支持体をカバーグラスなしで直接観察することが可能になり、これによって 極めて短焦点の対物レンズを使用することが可能になり、従って性能の向上が得 られる６）乾燥観察にも油浸観察にも適合する７）特に光学顕微鏡に適用するよ うにされているが、電子顕微鏡又はその他の観察手段にも使用できる。

本発明のステージの優れた適用例は、ニュークレオボア型の微細孔フィルター上 で細菌数を測定することである。

本発明は、可撓性又は硬直であり、生物学的又はそれ以外の方法で観察・分析さ れるべき１個以上の試料を載せる、可撓性又は硬直な、少なくとも１個の多孔性 又は非多孔性の支持体を固定するためのステージを提供し、このステージは、支 持体支持板が内部に取り付けられる孔を持ち、従ってここに保持されている試料 を観察することが可能になり、更にこのステージには吸引によって支持板上に支 持体を圧迫する装置が含まれ、該ステージの特徴は、それには更に支持体および 、従って分析されるべき前記の試料に自動的に指標を付ける装置が含まれ、前記 装置には、ステージの孔に相当する開口を持つカードが含まれ、同時にステージ の上でカードを中心に置く装置、即ち位置指標決定装置も含まれており、前記支 持体は、前記開口の境界を定めているカードの環状部分の回りのカードの主要面 の一つに固定されるように設計されていることである。

本発明によると、カード位置指標決定装置には、ステージによって移動される、 ２本の相当する中心合せのスタッドを受け入れる少なくとも２つの孔が含まれて いる。

本発明のステージの好ましい実施態様は、下記の組合せを具備する、支持板に対 して支持体を圧迫する手段を含んでいる。

少なくとも支持板の回りに取り付けられており、前記の板およびステージおよび 少なくとも、この板から突出している支持体の環状の周辺部によって画定されて いる気密の環状隙間、 真空を形成することによって、分析されるべき支持体の少なくとも前記の環状周 辺部に吸引力を与える装置；ステージの中に作られ、気密性の吸引隙間を真空を 作成する装置と連通させる、少なくとも１個の気密の通路。

該板は、ステージを貫いている孔の境界の壁の部分から突出している環状の受け 座の半径方向内側の端に固定されており、支持体が押し付けられる板の観察面は 、前記板が前記孔内に置かれた場合には、ステージ上面と同じレベルになり、前 記板は、前記受は座によってその孔の壁面から、半径方向外側の表面部が離れた 状態となり、その結果気密吸引隙間が、前記の半径方向外側の板の表面部と、板 が上に固定される受け座の表面部と、ステージを貫く孔の境界を形成している壁 の前記の部分と、気密的に板とステージを貫く孔の壁の間の隙間を覆う支持体の 前記の環状周辺部との間に形成され、この通路は、ステージ中の形成される少な くとも１個のめくら溝によって形成される支持体の環状の周辺部に少なくとも吸 引を適用するための気密の隙間に真空を形成するための装置に接続しており、ま た真空を形成するための上記の装置につなぐための、吸引オリフィスを備えてい る気密の閉塞片（この吸引溝に対するもの）を受け入れるための受け座を含んで いる。

前記の実施態様の有利な変更では、観察板に対して支持体を圧迫する前記装置に 、 少なくとも板の周囲に作られており、前記板ステージ、板をはみ出している支持 体の環状周辺部によって画定されている気密性環状隙間、および 支持体の前記の環状周辺部を少なくとも磁化するのに適した電磁界を成立させる ことによって分析すべき支持体の少なくとも前記の周辺部に吸引を与えるための 装置、支持体の環状周辺部には強磁性体の環状バンドを取り付け、又はそれで構 成された 組合せを具備している。

上記の実施態様の別の有利な変更では、支持体処理装置は、 真空を発生させることによって、分析すべき支持体の少なくとも１つの環状周辺 部に吸引力を与える装置を具備し、該装置は支持体の前記周辺部と通じており、 観察板は少なくとも前記周辺部に対応する部分では多孔性であり、支持体の前記 周辺部は観察板に対して押し付けられる。

これら２種の異なった実施態様の有利な配置では、この板は、ステージを貫いて いる孔の境界になっている壁の部分からはみ出している環状の受け座の半径方向 内側の端に固定されており、支持体が押し付けられる板の観察面は、前記板が前 記孔内に置かれた場合には、ステージ上面と殆んど同じレベルになり、前記板は 、前記受は座によってその孔の壁面から、半径方向外側の表面部が離れた状態に 保たれ、気密吸引隙間が、前記の半径方向外側の板の表面部と、板がその上に固 定される受け座の表面部と、ステージを貫く孔の境界を形成している壁の前記の 部分と、気密的に板とステージを貫く孔の壁の間の隙間を覆う支持体の前記の環 状周辺部との間に形成される少なくとも１個のめくら溝によって形成される支持 体の環状の周辺部に少なくとも吸引を適用するための気密性隙間に真空を形成す るための上記の装置に接続するための吸引オリフィスを備えている気密の閉塞片 を受け入れるための受け座を含んでいる。

」二記実施態様および上記のその変更の好ましい配置では、板には、上記の吸引 隙間に作られた吸引力を、支持体中の微小方形（又は微小区画）のそれぞれの回 りの支持体の底面にも分配されるように、支持板の観察面、即ちその上方の主要 面を微小溝の格子によって相当する微小方形又は微小区画に細分されるようにし て、観察面に配置された微小溝の格子が形成されており、これによって支持体は 吸引時に、より良好に圧縮されることになる。

前記の配置に加えて、本発明には下記の説明から明らかになるその他の配置も含 まれている。

本発明は、添付の図面に関する下記の更なる説明によってよりよく理解されるで あろう。

図１は、本発明のステージの平面図である。

図２は図１．に示されたステージの■〜■線断面図である。

図３は、分析すべき試料を保有する支持体に対する支持板を受け入れるためのス テージにある孔に適用できる、より大きな縮尺の図２の詳細図であり、吸引によ って支持板に支持体を押し付けるのに必要とされるような真空をその内部に形成 する間隙の配置を示している。

図４は、より大きな縮尺の吸引溝の断面図を示しており、この溝は一端が閉じら れており、前記吸引隙間をオリフィス（図５の小片に設けられている）経由で吸 引装置と接続している。

図５は、図１と図４に示されている溝を閉じるための気密閉鎖片の平面図であり 、これによってこの溝が気密の吸引通路に変えられる。

図６は、図３に示された支持板の変形実施態様の平面図である。

図７は、図６に示された支持板の■〜■断面図である。

図８と図９は、それぞれ、適切な場合には本発明のステージと共に使用するため の支持体保持カードの上面図と底面図である。

しかしながら、これらの図面およびその説明の相当する部分は、本発明の主題事 項を例示するためだけに示されたもので、これらはそれらについていかなる種類 の制約となるものではない。

図１と図２に示されている本発明のステージ１は、長方形であり、軽合金で作ら れている。この合金の中実板を機械加工して、その上面に、２本の横方向の環状 部即ちリブ３と４および２本の縦方向のリブによって区切られている一種の槽２ を形成する。この槽の形状は、浸液観察を行った場合に液の流出を防ぐのに役立 つ。ステージ１は、通常の顕微鏡ステージの上に置（オーバステージとして使用 可能であり、或いはその代りに置くこともできる。

リブ３と４は、リブ５と６より高くなっており、後者の端より上方にあり、また 前者は、リブ５と６の間の距離より更に長く伸びている。２つの翼状物７と８は 、リブ３と４の２つの上端から外端へ突出しており、ステージ１に高度の硬直性 を与えるのに役立っている。

図示された例では、これらの翼状物の厚さは、リブ３．４とリブ５．６の高さの 差に殆んど等しくなっている。

槽２の底９に穴ｌＯが開けられている。ステージ１が重ね台として使用される場 合には、ステージ１を１１ａ。

１１ｂ、ｌｉｅの参照番号で示されているような３つの点で通常ステージに取り 付けて、この穴１０を顕微鏡（図示せず）自体の通常のステージに合せるように しなければならない。ステージ１の支持平面に対する平行性がマイクロメーター ねじ（図示せず、より正確には調節されるのは、下記のガラス板の平行性である ）によって調節できるように、これらの点は、孔によって形成されている（少な くともｌｌａとｌｌｂの孔には雌ねじが切られている）。

長方形の穴１２ａと１２ｂは、９０°回転できるスプリング式の止め部材を受け 入れ、上記の支持平面に固定される（図１と２では示されていない。また止め部 材も図２では省かれている）。緩めた位置では、止め部材１３はステージ１を解 放しているが、これに対して締め付は位置では止め部材は、長方形孔１２ａと１ ２ｂの壁面と作用しあうことによって、該ステージを顕微鏡のステージに対して 固定するのに役立つ。より正確には、締め付は位置では、止め部材のばねがステ ージ１を３つの前述の固定点１１ａ、ｌｌｂ、ｌｌｃに押し込んでいる。

本発明によると、ガラス板２０（図３参照）は、ステージ１の穴ｌＯの中に置か れ、数人を画定して壁１４から穴１０の中心に向い突出し、底の肩部即ち段１６ 上に画成されている当り座１５に支えられている。もっと正確には、この当り座 は肩部１６の面取りされた末端１６ａになっており、肩部の上に当り座が接着又 はその他の手段、例えばねじ込みによって固定されている。このようにして環状 の隙間１７（例えば幅約１　ｍｍ）がガラス板２０と穴１０の壁１４の間に形成 される。この隙間は分析される支持体２７によって覆われるようにされており、 この時、板２０からはみ出している周辺の環状部２７ａによって隙間１７は気密 的にカバーされ、板２０の観察面２８（即ち支持体２７が当っている面）は、ス テージ１の底９の上面２９と同一線上にある。従って、この隙間は、板２０の半 径方向外側の表面部３０；この板のための固定座の表面部３１；ステージ１にあ る穴１０を画定している壁１４の部分；板２０と穴１０の壁の間の隙間１７を気 密的に覆っている支持体１７の環状周辺部２７ａの間に画成される。

ステージ１の底９に溝１８が形成され、これは一端１９ａでは閉鎖されており、 その反対側の端１９ｂでは環状隙間１７へ開放されている（図１では、この溝は 穴ｌＯの直径の延長上に伸びているように図示されている）。

図５に示された小片のような、この溝の気密のための閉鎖片２２を受け入れるた めに、当り座２１が溝１８内に形成され、これによって気密の通路が形成される （もちろん気密の通路は、その他の方法でも作ることが可能である）。小片には オリフィス２３が設けられ、これは真空を作成する装置に吸引末端部品を通じ接 続するための吸引オリフィスを構成する。

閉鎖板２２は、当り座２１に接着される（もちろん、その他の固定法も使用可能 であり、特に微小密封輪を嵌め込み、微小ねじを使用して、ねじ止めすることも 可能である）。

前記結合末端部品を通じオリフィス２３を真空を作る装置（図示せず）に接続す ることによって、ガラス板２０の周囲の環状隙間１７を真空にすることが可能で あり、この板は支持体２７が極めて平坦になることを保証するために修正されて いる。

このようにして支持体に吸引を与えることによって、支持体２７の周辺部２７ａ による恒久的な張力を受けて、支持体はガラス板に対してしっかりと且つ正確に 圧し付けられる。

吸引は、ガラス板２０に対する便利な代替えになり得る透明な非多孔性支持体に も適用することができる。このような支持体では、吸引及びそれによって生じる 圧迫は、少なくとも通常のスライドグラスの場合と等価な品質の平坦性を与える 。

通常のスライドグラスと同等の内部寸法を持つ取り外し可能な枠が与えられたな らば、このステージは通常の観察にも使用できる。この枠は、減圧された部位以 外のすべての吸引部位に密接するように設計され、それにおいては通常のスライ ドグラスは変形することなく、しっかりと押しつけられることになる。支持体が ガラス板に対して正確に圧迫されることによるもう１つの帰結は、物体カバーグ ラスなしで、即ち満足すべき平坦性を示す支持体を得るために先行技術で利用可 能な唯一の手段となっている要素を使用することなく、支持体を観察することが 可能になることである。物体カバーグラスを排除することによって、きわめて短 焦点距離の顕微鏡対物レンズを使用することが可能になり、これによって性能の 向上が得られる。

更に、支持体に緊張をかけることによって支持体のうねりを減少させることで、 乾燥状態でフィルターを直接観察することが可能になり、これによって前記のよ うな簡易性と迅速性の利点が得られる。

更に、支持体に優れた緊張を与え（吸引部の変化によって調節可能）、従って平 坦性の欠陥を減少させることによって、支持体に保持されている試料を観察する 画像分析の実施中に自動焦点調節を有効に実施することができる。このような平 坦性によって、平坦性のばらつきの問題が未解決のまま残っている試料に体して 自動焦点調節を特徴とする特許容できない、前記の焦点調節誤差が減少する。

更に、板そのものの平坦性に起因する可能性のある欠陥を考慮に入れることも可 能になる。このためには、特に、画像分析による自動焦点調節を管理するのに役 立つコンピューターのメモリーは、位置の関数として、板の欠陥に関する情報を 記憶することができ、従って、新しい視野の画像を入力する前に、分析中に修正 を行うことができる。

本発明の範囲を越えずに、板の観察面、例えば図６の板２０ａにおいて、互いに 直角に交差する２つの微小溝２５ａと２５ｂのセットを形成することによって、 支持体が押し付けられるガラス板に対する支持体の平坦性を更に改善させること も可能である。これによって環状隙間１７と、従って吸引溝１８と吸引オリフィ ス２３とも連絡する格子が得られる。このようにして、格子溝付きのガラス板２ ０ａの上面にある支持体は、支持体が前記の環状吸引隙間１７の上にある支持体 の環状周辺部に加えられる吸引によって緊張を受けるだけでなく、４つの微小満 ２５によって画成されているような支持体の上の小さな内部方形２６の各々がそ れぞれに緊張を受けることによっても、ガラス板に押し付けられ、これによって 支持体はガラス板に対してより良好に圧迫されることになる。

微小満２５は、生じる格子がフィルター上で観察される試料の位置と合致するよ うに、換言すれば各試料が４つの微小溝による枠の中に入るように配置され、従 って、いろいろな試料を逐次分析することが可能になる。

更に加えるべきことは、本発明のステージ１は、外蛍光による観察に利用できる だけでなく、透過光、例えば集光器による透過光による通常の観察にも使用でき ることであり、しかもこれがステージ１上の透明な支持体を用いても達成される ことである。ステージに使用されるガラス板の２〜３ｍｍという厚さは、通常の スライド厚さより大きいことは事実であるが、集光器を通常の顕微鏡の場合はど 支持体に近づけないようにすると、それにもかかわらず、より長い焦点距離を持 ち、良好な成績を与える集光器が利用できることを認めておくべきである。

使用された顕微鏡技術とは無関係に、従って利用された顕微鏡とも関係なしに、 本発明のステージを取り付け、カメラと併用される顕微鏡は、支持体によって保 持される試料（細胞、細菌その他）が顕微鏡観察の管理用、とりわけ自動焦点調 節用や粒子計数用にコンピューターに入力されている画像分析ソフトウェアによ って分析されることを可能にする。

照明レベルの関数として、上記の画像分析ソフトウェアは、カメラによって認め られる画像中の蛍光を発する物体の数を決定する。

上記のことから、本発明によって、内部に負荷されている画像分析ソフトウェア を持つコンピューターのＵｌｌの下で画像分析器に更に接続されているカメラに 接続されている顕微鏡によって、支持体に保持されている１個以上の試料に対し て独創的分析方法を適用実施できることは明らかであり、この方法はこの支持体 の平坦性のばらつきを減少させるように、また上述の画像分析器による最良の焦 点の自動調節が実際に効果を発揮するように、分析されるべき支持体を本発明の ステージに取り付けられている板に対して密着させるという先行の操作によって 構成される特徴（これは適切な観察や計数を行うために不可欠のものである）を 持っている。

上記の配置に基づいて、この板に対して支持体を圧迫する好ましい方法は、支持 体が押し付けられる板の回りに気密の隙間を確立することによって、支持体の少 なくとも１つの周辺の環状の部分に吸引を適用することであり、この隙間は、少 なくとも前記の周辺部に吸引を加える装置に接続するのに適したものである。

更に、出願人は、詰りを自動的にモニターしながら、また使用したフィルターに 指標を付けながら、複数の試料を濾過する並列濾過装置を考案したが、この装置 は対応特許出願の主題内容となる。分析すべき多数の試料を同じフィルターの多 数の別々の区域に載せているフィルターは、該ステージによって、本発明の分析 法を適用して能率的に分析できる。

更に、本発明のステージは、好ましくは可撓性のプラスチック材料によって作成 され、上記の対応特許出願に図示され、説明されている形式のものである支持体 保持カードと効果的に共用される。便宜的に、このカードも、本出願に添付され ている図面の図８と図９に示され、その図ではカードは参照符号３２で示されて いる。

この場合には、分析される支持体は、本発明のステージ１の穴１０に対応する円 形開口３４の境界となっている符号３３の環状帯においてカード３２に接着する ように設計されている。

このようなカードを使用すると、カード（図８の符号３５）に手がかりになる刻 み目又は孔を付けておくか、もっと簡単に、分析される支持体の周囲部を切り込 んでおくか穴を開けておくかによって、カードをキーシステムと併用して効率を 改善できる。更に、このカードは、特に、図１で一点鎖線で示され、符号２４ａ と２４ｂが付けられているような２本の心合せのスタッドによって、本発明のス テージに便利に中心金ぜをすることができ、またカード３２の開けられている２ つの心合せの穴即ちステージ１への心合せができると、カードは、支持体や、従 ってその上に保持されている試料（１個以上）に指標を付けるための独創的な手 段となり、またそれに対して支持体を押し付けるために使用される手段によって ステージに押し付けられる。

従って本発明は、２つの目的を同時に満足するステージを提供する、即ち同時に 、 ｉ）微小溝の格子によって小分けされている支持板の観察面２０ａ（即ち上側主 要面）によって、環状吸引隙間内に作られた吸引をフィルターの底面にわたって 、且つフィルターの微小方形（または微小区画）のそれぞれの囲りに分配し、そ うして吸引中に板へのフィルターの押し付けをより良好にするための格子による 正確な圧迫を達成すること、および ｉｉ）経時的に安定しており、完全に平坦であり（精度０゜２μｍ）、完全に水 平であり（精度１μｍ乃至２μｍ）、一方で下記のような利点を個別的に、或い は組合せで示すような基準面を得ることができる。

１）比較的大きな直径の観察板を使用しても、支持体は、極めて速やかに押しさ げられる； ２）非常に正確な自動指標つけ； ３）焦点調節は安定で、再現性があり、コンピューターで修正可能である； ４）観察は、乾燥下でも油浸でも実施できる；５）２種類の照明が使用できる： 上方から（直接照明）または下方から（透過照明）。

上記から明らかなように、本発明は、いずれにしても、はっきりと記載されてい る発明の実行および実施態様に限定されるものではない。反対に、本発明は、本 発明の要旨又は範囲をこえることなしに当業者にとってなし得る如何なる変更に まで及ぶ。特に、ガラス板の周囲に作られ、分析される支持体の環状の周囲部と 少なくとも一致している気密性吸引隙間は、記載された溝１８のような単一溝に よるだけでなく、その他の同等の手段、例えば本発明のステージに開いている穴 の周囲に星状に配置された多数の気密の溝、又は多孔性ガラスによっても、真空 を作成する装置に接続できることは明らかである。

ガラス自体は、金属又は合成材料（プラスチック）のような別の材料で代替でき 、これらは表面蛍光による分析、即ち集光器による透過照明を必要としない場合 に有利となり得る。

多孔性板を使用する場合には、それは全体にわたって多孔性であってもよく、或 いは支持体の環状周囲帯に相当し、観察板に対面して使用される環状周囲部だけ が多孔性であってもよく、吸引は支持体の前記周辺帯に連絡している適当な装置 によって真空を形成して支持体に加えられる。

同様に、分析される支持体の少なくとも１個の環状周辺帯に吸引を加えることも 可能であり、それに関して、少なくとも支持体の前記の周辺帯に作用する電磁界 を形成する装置を使用して支持体を押し付け、この周辺帯には、磁化でき、従っ て磁界によって“吸引”　（引き付け）される強磁性体の環状の帯を取り付ける か、周辺帯をこのような材料で作成すべきである。

それぞれの吸引の場合に、特に分析される支持体の周辺帯の吸引は、支持体に、 観察板に対して有効に押し付けられるようにする周辺性の張力を連続的に与える 。

観察板は通常の観察スライドでも利用できることも認めておくべきである。この 場合には（この配置は図面では示されていない）、本発明のステージには、ステ ージの前記の穴（１０）に対して中心合せをするための中心観察窓が付いている 気密性フィルムが好都合に取り付けられ、一方で観察窓は前記穴（１０）より小 さく、前記観察スライドは、中心方向でその観察窓を画定しているフィルムの環 状部に固定されており、そうして吸引が加えられた時に、前記のスライドがステ ージに対して押し付けられる。

更に、丸味の付いた端のある支持体の下側の主要面への吸引を分配するための格 子の微小溝を設けること、更にそれらを同じように丸味のある輪郭を示す横断面 を持つようにすることは、より効果的な押し付は効果を得るのに好都合である。

更に、本発明のステージが在来型又はその他の形式であり得る顕微鏡ステージに 載せるための重ね台として使用する（在来型又はその他の形式の顕微鏡ステージ に取り替えて使用するのではなく）場合には、本発明のステージは、取り脱し可 能であること以外には、それ自体の以下なる自由度も備えていないが、それを載 せているステージはモーター付であり、ｘＳｙ、ｚ軸移動を行うことができる。

本発明のステージを取り付けた顕微鏡をコンピューター制御下のビデオ画像分析 による自動焦点調節システムと組合せて使用することも非常に有効なことであり 、それによって、基準面に対する、その上方の観察面の真の高度を検出して支持 体の平坦性の欠陥を記憶させることが可能であり、そうしてシステムが移動する たびに、高度の小さなばらつきに順応できるように、自動的に高度修正される（ 適当なプログラムの制御の下で）。

国際調査報告 一一一一〜−−−０観ＫＴ／ＦＲ８９１００５４５国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　可撓性又は硬直であり、顕微鏡により観察且つ分析されるべき、生物学的又 はそれ以外の１個以上の試料を保持する。少なくとも１種の多孔性又は非多孔性 の支持体（２７）を固定するためのステージで、このステージには支持体（２７ ）を支持するための板（２０、２０ａ）を受け入れ、底に保持されている試料を 観察することを可能にするための穴（１０）ならびに吸引によって支持体（２７ ）を支持板（２０、２０ａ）に対し圧迫するための手段を包含し、特徴とすると ころが、更に支持体（２７）、従って分析される前記試料にも自動的に指標を付 けるための手段を含み、前記手段は、ステージ１に開けられた穴（１０））に対 応する開口（３４）のあるカード（３２）ならびにステージ（１）の上に置いた カード（３２）に対して中心合せをする手段、即ち位置指標決定手段を包含し、 前記支持体（２７）は前記開口（３４）を画定しているカードの環状帯の上にカ ード（３２）の主要面の一面に固定されるようにされていることにあるステージ 。 ２　ステージ（１）に取り付けられている２つの対応する中心合わせスタッド（ ２４ａ、２４ｂ）を受け入れるための少なくとも２つの孔（３６ａ、３６ｂ）が 、カード（３２）の位置指標決定手段に含まれていることを特徴とする請求の範 囲１記載のステージ。 ３　観察板（２０）に対して支持体（２７）を圧迫する前記手段が、 少なくとも板（２０）の周囲に作られた、前記の板、ステージ（１）、板（２０ ）からはみ出している支持体（２７）の少なくとも環状周辺部（２７ａ）によっ て画定されている気密性の環状隙間（１７）および強磁性体の環状バンドを取り 付けるか、このバンドから作成された、支持体（２７）の前記環状周辺部（２７ ａ）を少なくとも磁化するのに適した電磁界を形成させることによって、分析さ れる支持体（２７）の少なくとも前記の周辺帯に吸引を与えるための装置の組合 せを具備していることを特徴とする請求の範囲１又は２記載のステージ。 ４　支持体（２７）を押し下げる手段が、真空を形成させることで、分析すべき 支持体（２７）の少なくとも環状周辺帯に吸引を与えるための装置で、その装置 は支持体の前記周辺帯と連通しており、観察板（２０）は、少なくとも前記周辺 帯に連通している部分で多孔性であり、支持体の前記周辺帯が観察板に対して押 し付けられているものである を具備していることを特徴とする請求の範囲１又は２記載のステージ。 ５　支持板（２０）に対して支持体（２７）を圧迫するための手段を含む請求の 範囲１又は２記載のステージで、 少なくとも板（２０）の周囲に設けられ、前記の板、ステージ（１）、板（２０ ）からはみ出している支持体（２７）の少なくとも環状周辺部（２７ａ）によっ て画定された気密性環状隙間（１７）；真空を形成することによって、分析すべ き支持体（２７）の少なくとも前記環状周辺部（２７ａ）に吸引を与える装置； ステージ（１）に設けられており、気密性吸引隙間（１７）を真空を作成する装 置と連通させる少なくとも１つの気密性通路（１８）； 板（２０）はステージ（１）に開口する穴（１０）を画定している壁の部分から 突出している環状の当り座（１５）の半径方向内側の末端（１６ａ）に固定され 、支持体（２７）が押し付けられる板（２０）の観察面（２８）は、前記の板が 前記の孔（１０）に取り付けられた時に、ステージ（１）の上面（２９）と殆ん ど同じレベルになり、半径方向外側の表面部（３０）を持つ前記の板（２０）は 、前記当り座（１５）によって穴（１０）の壁から離れた位置にあり、その結果 、気密性の吸引隙間（１７）が、板（２０）の前記の半径方向外側の表面部（３ ０）と、板（２０）が上方に固定される当り座（１５）の表面部分と、ステージ （１）に開口している穴（１０）の境界を形成している壁の前記部分と、板（２ ０）とステージ（１）に開口している穴（１０）の壁（１４）の間にある隙間（ １７）を気密的に覆っている支持体（２７）の前記環状周辺部（２７ａ）の間に 画成され、支持体（２７）の少なくとも環状周辺部（２７ａ）に吸引を加えるた めの気密性隙間（１７）に真空を形成させるための通路は、ステージ（１）の中 に形成された少なくとも１つのめくら溝（１８）によって形成され、真空を発生 させるための前記の装置に連結させるための吸引オリフィス（２３）を備えてい る気密性閉鎖片（２２）を受け入れるための当り座を含んでいることを特徴とす るステージ の組合せを具備しているステージ。 ６　板（２０）はステージ（１）に開口する穴（１０）を画定している壁の部分 から突出している環状の当り座（１５）の半径方向内側の末端（１６ａ）に固定 され、支持体（２７）が押し付けられる板（２０）の観察面（２２）は、前記の 穴（１０）に取り付けられた時に、ステージ（１）の上面（２９）と殆んど同じ レベルになり、半径方向外側の表面部（３０）を持つ前記の板（２０）は、前記 当り座（１５）によって穴（１０）の壁から離れた位置にあり、その結果、気密 性の吸引隙間（１７）が、板（２０）の前記の半径方向外側の表面部（３０）と 、板（２０）がその上方に固定される当り座（１５）の表面部分と、ステージ（ １）に開口している穴（１０）の境界を形成している壁の前記部分と、板（２０ ）とステージ（１）に開口している穴（１０）の壁（１４）の間にある隙間（１ ７）を気密的に覆っている支持体（２７）の前記環状周辺部（２７ａ）の間に画 成され、支持体（２７）の少なくとも１個の一方がふさがっている溝（１８）に よって成形され、真空を発生させるための前記の装置に連結させるための吸引オ リフィス（２３）を備えている気密性閉鎖片（２２）を受け入れるための当り座 を含んでいることを特徴とする、請求の範囲３又は４記載のステージ。 ７　支持板（２８）には、上記の吸引隙間（１７）に作られた吸引力を、支持体 （２７）中の微小方形（又は微小区画２６）のそれぞれの周囲の支持体（２７） の底面にも分配されるように、支持板の観察面（２０ａ）、即ちその上側の主要 面を微小溝（２５ａ、２５ｂ）の格子によって相当する微小方形又は微小区画に 細分することで、観察面（２８）に配置された微小溝（２５ａ、２５ｂ）の格子 が形成されており、これによって支持体（２７）が吸引時に、更により圧縮され ることを特徴とする請求の範囲５又は６記載のステージ。 ８　ステージが槽（２）の形状であることを特徴とする請求の範囲１から７の何 れかに記載のステージ。 ９　槽（２）が実質上、長方形であり、横方向リプ（３、４）と縦方向のリプ（ ５、６）によって画定されていること、及び横方向のリブには、ステージを支持 板にステージを固定する装置と併用できるようにするのにも役立っ補強翼状物（ ８）が設けられていることを特徴とする請求の範囲８記載のステージ。 １０　観察板が、ガラス材料、金属材料、プラスチック材料の群から選択された 材料から作成されていることを特徴とする請求の範囲１から９のいずれかに記載 のステージ。 １１　可撓性又は硬直であり、顕微鏡によって観察及び分析される、生物学的又 はその他の、１個以上の試料を保持している、少なくとも１つの多孔性又は非多 孔性の支持体（２７）を固定するためのステージであって、前記ステージは媒質 （２７）を支持し、従って底に保持されている試料を観察するための板（２０： ２０ａ）を受け入れるための穴（１０）ならびに吸引によって支持体（２７）を 支持板（２０；２０ａ）に対して圧迫する手段を含み、特徴とするところが支持 板（２０ａ）が、上記の吸引隙間（１７）に作られた吸引力を、支持体（２７） 中の微小方形（又は微小区画２６）のそれぞれの周囲の支持体（２７）の底面に も分配するための格子を形成するように、支持板の観察面（２０ａ）、即ちその 上側の主要面を微小溝（２５ａ、２５ｂ）の格子によって相当する微小方形（又 は微小区画）に細分することで、観察面（２８）に配置された微小溝（２５ａ、 ２５ｂ）の格子を含んでおり、これによって支持体（２７）が吸引時に、更によ り圧迫されることにあるステージ。 １２　可撓性又は硬直であり、顕微鏡によって観察及び分析される、生物学的又 はその他の、１個以上の試料を保持している、少なくとも１つの多孔性又は非多 孔性の支持体（２７）を固定するためのステージであって、前記ステージは、支 持体（２７）を支持し、従って底に保持されている試料を観察するための板（２ ０：２０ａ）を受け入れるための穴（１０）ならびに吸引によって支持体（２７ ）を支持板（２０；２０ａ）に対して圧迫する手段を含み、その特徴とするとこ ろが、支持体（２７）、従って分析される前記試料に自動的に指標をつける手段 、ステージ（１）に開口している穴（１０）に対応している開口（３４）を含む カード（３２）を具備する前記手段、ならびにステージ（１）の上のカード（３ ２）の中心合わせ、即ち位置指標決定を可能にする手段を更に含んでおり、前記 支持体（２７）は、前記開口（３４）を画定している、カードの環状帯の上で、 カード（３２）の主要面の１つに固定されるようになっていること、更に支持板 （２０ａ）には、支持板の観察面（２８）、即ちその上側の主要面を微小溝（２ ５ａ、２５ｂ）の格子によって細分することによって、上記の吸引隙間（１７） 内に形成された吸引を支持体（２７）の微小方形（又は微小区画２６）のそれぞ れの周囲の支持体（２７）の底面にも分配するための格子が形成されるように配 置された観察面（２８）内の微小溝（２５ａ、２５ｂ）が設けられており、これ によって支持体（２７）が吸引時に更により圧迫されることにあるステージ。 １３　顕微鏡によって観察及び分析される、生物学的又はその他であり得る１個 以上の試料を保持している、少なくとも１つの支持体を固定するためのステージ で、支持体によって保持されている試料を観察する穴（１０）があり、また吸引 によって前記支持体を圧縮するための手段を含んでおり、前記支持体は、実質上 一般の観察用スライドグラスである観察板によって保持され、特徴とするところ が、吸引によって支持体を圧縮する手段は、ステージに開口している前記の穴（ １０）に対して中心を合せるために中央に観察窓が付いている気密性フィルムを 具備し、前記穴（１０）より寸法が小さいので、前記観察用スライドは、吸引が 加えられた時に、上記スライドがステージに対して圧迫されるように、それの観 察窓を中心側で画定しているフィルムの環状帯に固定されることにあるステージ 。 １４　一般的又はその他の形式であり得る顕微鏡ステージに取り付ける重ね台と しての請求の範囲１から１３のいずれかに記載のステージの使用。 １５　一般的又はその他の形式であり得る顕微鏡ステージの代替品としての請求 の範囲１から１３の何れかに記載のステージ。 １６　請求の範囲１から１５の何れかに記載のステージが備えられた顕微鏡。 １７　ビデオ画像を分析することによって自動焦点調節を行うコンピューター制 御システムと協働することを特徴とする、請求の範囲１６記載の顕微鏡。