JPH0450314B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 下記の構造を有する化合物 ここで、Ｒは−OC−Ar−COOR₁（Arはフエニ
レン或は追加の置換基として塩基、ヒドロキシ、
或は炭素原子１〜５を有する低級アルコキシのみ
を含有するフエニレンであり、R₁は水素或は炭
素原子１〜５を有する低級アルキルである）であ
る。 ２ Ｒが下記： であり、R₁が水素或は炭素原子１〜５を有する
低級アルキルである請求の範囲第１項記載の化合
物。 ３ Ｒがヘミフタロイルである請求の範囲第２項
記載の化合物。 ４ 本質的に、制薬的に許容し得る非毒性キヤリ
ヤーと有効量の請求の範囲第１項記載の化合物と
からなる、癌治療用組成物。 ５ 本質的に、製薬的に許容し得る非毒性キヤリ
ヤーと有効量の請求の範囲第２項記載の化合物と
からなる、癌治療用組成物。 ６ 本質的に、製薬的に許容し得る非毒性キヤリ
ヤーと有効量の請求の範囲第３項記載の化合物と
からなる、癌治療用組成物。 ＊明細書 本発明はメトトレキセート耐性細胞の生長に対
し高い抑制活性を示すN〓−（４−アミノ−４−デ
オキシプテロイル）−Ｌ−オルニチンの所定のN〓
−アシル誘導体及びそれらを含有する薬剤組成物
に関する。 N〓−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）
−Ｌ−オルニチン（本明細書中以降で時には
APA−Ｌ−Ornと呼ぶ）は下記の構造を有す
る： （式中、Ｒは水素である）。それは、ジヒドロ
ホレートリダクターゼ（DHFR）及びホリルポ
リグルタメートシンセターゼ（FPGS）の効力あ
る抑制剤であるが、培養における細胞生長の抑制
剤としては相対的に不活性であることが報告さ
れ、それのアミノ置換されたプロドラツグ誘導体
は細胞吸収が増大される可能性があることから、
感心のあることが提案された。ロゾウスキー
（Rosowsky）等、J.Med.Chem.，29巻、655−
660頁（1986年）。 本発明は上記構造を有し、式中Ｒは−OC−
Ar−COOR₁（Arは芳香族基であり、R₁は水素或
は低級アルキル（炭素原子１〜５）である）であ
るAPA−Ｌ−OrnのN〓−アシル誘導体に関する。
かかる化合物はメトトレキセート耐性腫瘍細胞、
例えばヒト細胞系統SCC25／R1及びSCC25／R1
の生長に対して著しく高い抑制活性を示し、その
活性はAPA−Ｌ−Ornの他のN〓−アシル誘導体
の活性よりも予期されない程に高い。本発明の化
合物はArが単環式或は二環式芳香族、好ましく
は単環式であるもの、並びに追加の置換基、例え
ば塩素ヒドロキシ或は低級アルコキシ（炭素原子
１〜５）が、芳香族基中に存在するものを含み、
好ましい化合物はＲが下記： であるものである。好ましい化合物では、−
COOR₁基が

【式】基のオルト、メタ或はパ ラの位置にあつてよい。 本発明の化合物はN〓−（４−アミノ−４−デオ
キシ−N¹⁰−ホルミルプテロイル）−Ｌ−オルニ
チン或はそのトリフルオロアセテート塩を適当な
無水カルボン酸と反応させてN〓−アシル−N〓−
（４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプ
テロイル）−Ｌ−オルニチンを形成した後、後者
を温和なアルカリ性条件下で処理してN¹⁰−ホル
ミル基を選択的に開裂させて作ることができる。
開裂反応はロゾウスキー等がJ.Med.Chem.，29
巻、1703−1709頁（1986年）に記載した。APA
−Ｌ−Ornへのヘミーフタロイル誘導体もまた４
−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミルプテロ
イル酸セスキ水和物（ロゾウスキー等、J.Med.
Chem.，29巻、655−660頁（1986年））とペルシ
リル化N〓−フタリル−Ｌ−オルニチン（ボダン
スツキー（Bodanszky）等、J.A.C.S.，86巻、
4452−4459頁（1964年））とを反応させてN¹⁰−
ホルミルN〓−フタルイミド誘導体を形成した後
に同時にイミド環をアルカリ性条件下で脱ホルミ
ル化及び開いて作ることができる。 化合物を慣用の製薬上許容しるう非毒性キヤリ
ヤーに混合或は溶解して治療組成物とすることが
できる。有効剤の有効投与量は簡単な試験によつ
て容易に求めることができる。 例 N〓−（４−アミノ−４−デオキシ−N¹⁰−ホルミ
ルプテロイル）−N〓−フタリル−Ｌ−オルニチン N〓−フタリル−Ｌ−オルニチンハイドロクロ
リド（1.19g、４ミリモル）をCH₂Cl₂（25mL）に
懸濁させた液に、Et₃Ｎ（0.89g、8.8ミリモル）及
びMe₃SiCl（0.96g、8.8ミリモル）を連続して加え
た。混合物を25℃で18時間攪拌し、減圧下で蒸発
乾固させ、残分をジメチルホルムアミド
（30mL）に還流温度で再溶解した。溶液（溶液
Ａ）を下記に説明する操作中ずつと暖め続けた。 Et₃Ｎ（0.809g、８ミリモル）を含有する乾燥Ｎ
−メチルピロリジノン（35ml）中にN¹⁰−ホルミ
ル−４−アミノ−４−デオキシプテロイル酸セス
キ水和物（0.732g、２ミリモル）を懸濁させた液
に、塩化ｔ−ブチルオキシカルボニル（273mg、
２ミリモル）を加え、周囲温度で15分間攪拌した
後に、溶液Ａを半分加えた。10分後に、塩化ｔ−
ブチルオキシカルボニルの第２部分（137mg、１
ミリモル）を加え、次いで20分して溶液Ａを四分
の一加えた。更に10分した後に、同じ塩化カルボ
ニルの第３部分（68mg、0.5ミリモル）を加え、
15分して溶液Ａを八分の一加えた。最後の順序を
繰り返した。１時間後にMeOHを加え、全ての
揮発性物質を減圧下で除いた。残分をEt₂Ｏ（150
ml）と共に摩砕し（triturate）、不溶性物質を溶
媒系（５：４：１ CHCl₃−MeOH−NH₄OH）
に吸収させ、充填したシリカゲルカラム（29×
3.0cm）にかけ、第２の溶媒系（14：６：１
CHCl₃−MeOH−NH₄OH）で溶出した。R_f0.41
（シリカゲル、10：６：１ CHCl₃−MeOH−
NH₄OH）における主スポツトを他の小さいスポ
ツトと共に含有するフラクシヨンをプールし、第
２のカラム（36×3.0cm）で再びクロマトグラフ
イーにかけ溶媒系（28：12：１ CHCl₃−
MeOH−NH₄OH）で溶離した。R_f0.32（シリカ
ゲル、10：６：１ CHCl₃−MeOH−NH₄OH）
に単一スポツトを含有するプールしたフラクシヨ
ンを蒸発させて出発物質を生じた（155mg、回収
率21％）。R_f0.41に単一スポツトを含有するプー
ルしたフラクシヨンを蒸発させ、少量のMeOH
に再溶解させ、それから静置して生成物の一部を
晶出させた。母液をEt₂Ｏに加えて生成物の残り
を再沈殿させた； 494mg（40％）；融点235℃（分解）；IR（KBr）
3430、1710（イミドＣ＝０）、1670、1645cm^-1。分
析（C₂₈ H₂₅N₉O₆・2H₂Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。 N〓−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）
−N〓−ヘミーフタロイル−Ｌ−オルニチン（N〓
−ヘミフタイルAPA−Ｌ−Orn） 前述した生成物（469mg、0.75ミリモル）を
0.25N NaOHに溶解した溶液を25℃に6.5時間保
ち、PHを10％酢酸で4.3に調製した。生成したゲ
ルを一晩攪拌し、遠心分離によつて分離し、５：
４：１ CHCl₃−MeOH−NH₄OHに再溶解し、
シリカゲルカラム（26×2.0cm）にかけ、次いで
10：６：１ CHCl₃−MeOH−NH₄OHで溶離
し、プールしたフラクシヨンを蒸発乾固させ、残
分をEtOHから晶出させた：122mg（収率26％）。
分析：（C₂₇ H₂₇N₉−O₆・H₂Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
生成物は式（式中、Ｒは下記： である）の構造を有する。 溶離剤としてアセトニトリル８％を含有する
0.1M酢酸アンモニウム（PH7.8）を用いた分取
HPLCによつて更に精製した生成物40mg分から生
物検定サンプルを得た。 本発明の範囲内でない他のN〓−アシルル−
APA−Ｌ−Orn化合物を、N¹⁰−ホルミルAPA
−Ｌ−Ornの種々のカルボン酸無水物を縮合さ
せ、次いでアルカリ性脱ホルミル化して調製し
た。該化合物は上記式の構造において、Ｒが下
記を表わすものを示した： 化 合 物 Ｒ ２ COCH₃ ３ COCH₂CH₂COOH ４ COC₆H₅ ５ COC₆H₄Cl−４ ６ COC₆H₃Cl₂−３，４ L1210／R81ネズミ白血病細胞からMTXアフ
イニテイクロマトグラフイーによつて精製した
DHFRの抑制を求めた。ケンプトン（Kempton）
等、J.Med.Chem.，25巻、475−477頁（1982年）
の分光光度アセイ手順を用いてメトトレキセー
ト、アミノプテリン及びAPA−Ｌ−OrnのIC₅₀を
標準或は対照として求め、かつまた該手順を用い
て上記の化合物２〜６、並びに下記の表において
化合物７として同定したN〓−ヘミ−フタロイル
APA−Ｌ−OrnのIC₅₀も求めた。また、化合物の
内のいくつかを、ネズミの肝臓から部分精製した
FPGSの抑制剤としても試験した。結果を下記の
表１にまとめる。

【表】 モスマン（Mosman）、J.Immunol.Meth.，65
巻、55−63頁（1983年）の手順を用いて、牛
（bovine）胎児血清10％を含有するRPMI1640培
地中で48時間培養したL1210及びL1210／R81ネ
ズミ白血病細胞に対し同じ化合物群について細胞
毒性アセイを行つた。 加えて化合物の内の４つを、牛胎児血清10％を
含有するダルベツコの改質イーグル培地中で48時
間培養したヒトCEM及びCEM／MTXリンパ芽
球に対して試験した。IC₅₀（μM）値を表２の最後
の２欄に報告し、MTXに対して標準化した値を
カツコ内に挙げる。

【表】 対である。
表２に示す化合物７の高い活性は、他の化合物
がたとえ、全てが表１に示す通りに、DHFRに
ついて事実上同じ活性を示しても、全て活性が低
かつたことを考えると顕著であつた。 また、化合物７がCEM／MTX細胞に対して
MTXより16倍効力があり、親のMTX感応性細
胞系統に対してMTXに比べて13倍効力が低いに
すぎなかつたことは注目するに足る。 標準或は対照としてのメトトレキセート及びメ
トトレキセートのγ−ｔ−ブチルエステル及び
N〓−ヘミ−フタロイル−APA−Ｌ−Ornを、
MTX感応性及びMTX耐性ヒト扁平上皮癌細胞
に対する生長抑制活性について、ロゾウスキー
等、Cancer Res.，45巻、6205−6212頁（1985
年）に記載されている手順に従つて細胞単一層を
薬剤に連続して約２週間暴露させて試験した。
IC₅₀（対照に比べて細胞生長を50％抑制するのに
要するミクロ分子濃度）の結果を、MTXのSCC
15細胞（１欄２及び２欄）或はSCC 25細胞（３
欄及び４欄）に対するIC₅₀に大して標準化した数
（カツコ内）と共に表３に示す。MTX化合物及
びMTXのγ−ｔ−ブチルエステル化合物につい
ての結果はロゾウスキー等、Cancer Res.，45
巻、6205−6212頁（1985年）及びJ.Med.Chem.，
28巻、660−667頁（1985年）からそれぞれ引用す
る。

【表】 表３中の２つの細胞系統のMTX耐性のレベル
はL1210／R81細胞或はCEM／MTX細胞のもの
よりも低いが、ヒトにおけるMTX服量反応の極
めて高い性質が、腫瘍が患者におけるこのレベル
の耐性に達する際に、MTX投与量のそれ以上の
増大が可能でないことから、これらの試験結果は
意味がある。表３に示す通りに化合物７は親の
SCC 15及びSCC 25細胞に対してMTXよりも10
〜30倍効力があつたが、tBMTXはMTXに比べ
て少なくとも10倍効力が低かつた。その上、
tBMTXはMTX耐性SCC15／R1及びSCC25／R1
サブラインに対してMTXに比べて少なくとも30
倍効力が低かつたが、両方の耐性細胞に対する化
合物７の効力は親細胞に対するMTXの効力を越
える。 化合物７の投与量及び毒性データ 私たちは、マウスを使つたイン・ビボでの研究
において、４〜24mg／Kg／注射の範囲の投与量
（水溶液で１日２回で10日間（bid×10）腹腔内注
射により与える）が十分許容的であり且つ増加さ
れた生存という形態での治療的利益を与える（未
処理の対照の寿命の３倍に至る）ということを見
出した。毒性は、同じスケジユールにおいて、36
mg／Kg／注射にて観られた。１日１回での９日間
のスケジユール（qd×９）では、生存の増加は、
bid×10法における程ではないにもかかわらず、
２〜32mg／Kg／注射の投与量も又治療的であり且
つ非毒性であつた。これらのデータを表４及び５
に示す。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 活性が肉腫（M5076）並びに白血病細胞
（L1210）に対して観られ、且つその肉腫はbid×
10又はqd×９スケジユールでの最大許容投与量
のメトトレキセート（MTX）に対して完全に耐
性であるということに注意すべきである。私たち
は、この肉腫モデルにおけるN〓−ヘミフタロイ
ルAPA−Ｌ−Orn（化合物７）の効果の理由は治
療的レベルまで安全に増大され得る投与量に達す
ることである（他方、MTXを用いては、毒性が
すぐに投与限界に達するため、これは不可能であ
る）と考えている。