JPH04503014A - ウィルムス腫瘍遺伝子の位置決定と特徴付け - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルムス腫瘍遺伝子の位置決定と特徴付は資金援助 ここに記載する研究は、国立保健研究所、カナダ医学研究会議、国立癌研究所の 資金援助を受けた。

背景 ウィルムス腫瘍（ＷＴ）は、腎臓に見られる胎児性悪性腫瘍であって、約１０． ０００人の乳児・幼児の内−人がこれに侵される。　Ｍｓｌｔｏｎａｇｔ　Ｈｎ ｍｉｎ　Ｇｅｎｅｌｉ’ｃｓ、５７：２３１−２４６　（１９８１）。

ウィルムス腫瘍の分子面の基礎はまだよく分かっていない。

ウィルムス腫瘍症例の一部（約２％）は、泌尿生殖器異常や精神薄弱ばかりでな く、無虹彩（ＡＮ２）にともなって現われ群を形成し、これは、ＷＡＧＲ複合体 として知られている１群の遺伝子におけるヒト染色体１１のＩＩｐ１３帯での体 賀的欠失が２４　：１ＢＳ−１９２（１９７９）。この場合、しばしば、両側性 ウィルムス腫瘍が観察されるが、それと同時に、周囲の腎組織に異形成度化も認 められる（腎芽細胞腫症）。後者は、悪性転換に先行する現象と考えられている 。ＢｏＶｅ及びＭｃＡｄ＊ｍｓ、Ｐｅｔｔｐｔｃｊ＋ｙｅｓ　ｏｎＰｅｄｉ＊Ｉ ｒ１ｃ　ＰＩ［ｂｏｌ、、　３：１８５−２２３　（１９７６）　ｏ劣性癌遺伝 子または癌抑制遺伝子として、ウィルムス腫瘍遺伝子座は、未分化の腎細胞の成 長を妨げる。これは一般に、癌発生に関する２段階突然変位モデルに一致し、遺 伝的には、染色体１３ｑ上の網膜芽腫遺伝子座と同様である。これらの所見から 次の結論が導かれる。

少なくとも、ウィルムス腫瘍のこの一部に関しては、網膜芽腫（ＲＢ）遺伝子と 同様、１１ｐ１３における遺伝子の不活性化が、腫瘍形成を左右する重要事項で ある。ＷＴの原因となる遺伝子の位置を特定するために、これまで相当の努力が 払われてきた。

このことは、そのような努力の跡を記載する多数の報告によって明かである。例 えば、冬型遺伝子座についてヘテロ接合性を持たない、散発性ウィルムス腫瘍の ゲノム分析では、ウイルムス腫瘍遺伝子は１１９１３の部位にあることが支持さ れる。Ｋｏａｌｏｓ。

ｅｌ　ｓｌ、、　肛１ｏｒｔ、３０９：１７０−１７２（１９８４）；　０ｒｋ ｉｎ、ｔｌ　ｓｌ、、Ｎ＊ｊｗｒｅ。

３０９：１７２−１７４　（１９１１４）；　Ｒｓｅｙｅ、　ｅｌｌ、、　Ｎ５ Ｌａｒｅ、３０９：１７４−１７６（１９８４）；　Ｆ…ｏｎ、　ｅｔ　＊１． 、　Ｎｓ＋ｍｒ＊、３０９：１７６−１７８　（１９８４）。

その他の研究に基づいて言うと、ウィルムス腫瘍は、別の遺伝子座で機能喪失が 生ずることによって起こるようである。遺伝的にウィルムス腫瘍にかかりやすい ２家系の調査において、１１ｐ遺伝子マーカーとの結合は排除された。このこと から、少なくとも、他にもう一つウイルムス腫瘍遺伝子座があることが明らかに なった。ＧｒｕＩｌｄ７．　ｅｌ　ｓｌ、、　Ｎ５ｌｕｒｅ、３３６：　３７４ −３７６（１９８Ｂ）；　ｌ（ｕ目、　ｔｌ　Ｉｌ、、　Ｎ１ｔｅｒｓ、皿：　 ３７７−３７８　（１９８Ｂ）。その後の研究では、ウイルムス腫瘍のへテロ接 合性の喪失は、１ｉｐ１３ではなく、１１ｐ１５に認められた。Ｒｅｅｗｔ、ｅ ｔ　＊１．、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ子座の可能性が考えられるけれども、１１ｐＨ のウイルムス腫瘍遺伝子座は、体質性ＷＡＧＲ欠失や、散発性腫瘍の一部におけ る体細胞性染色体再編成と関連していることは明かである。

Ｌ！ｖｉｓ、ｅｌ　ｓｌ、、Ｇｅｎｏｓｉｃｓ、　３：　２５−３１　（１９８ ８）。

ウィルムス腫瘍遺伝子を特定することには相当の関心がよせられており、そのこ とを目標にした研究があるにも拘らず、現在までのところ、ウイルムス腫瘍遺伝 子を含むと特定された領域の転写マツプは、まだ特定されていない。

発明の概要 本発明は、ウィルムス（ｔｉｌＩｌｓ　）腫瘍遺伝子に関しての細胞分析法に関 わる。また、ウィルムス腫瘍遺伝子転写部分またはコードされるポリペプチドに 関しての細胞分析法にも関わる。

ここでいう、ウィルムス腫瘍遺伝子またはウイルムス腫瘍ＤＮＡとは、染色体１ １のバンド１３　（１１ｐＨ）における障害を指す。この障害は、ＷＡＧＲまた はウイルムス腫゛瘍（すなわち、この病状を持つ細胞に見られる）の特徴である が、他の腫瘍タイプと関連していたり、または、−その原因となることも十分に 予想されるものである。本発明はさらに、ゲノム・クローン、ｃＤＮＡクローン 両方のＤＮＡ塩基配列にも関わる。この配列は、ウィルムス腫瘍遺伝子座をヒト 染色体１１のｐバンド１３（１１ｐ１３　）に位置づける体質性および癌性欠失 の境界内にマツプされる。初めて、ウイルムス腫瘍遺伝子を含む領域にマツプさ れる転写部分を特定した。この転写部分の特徴を明らかにし、それが、約５０ｋ ｂに長さに渡っていること、長さ約３ｋｂのｍ　ＲＮ　Ａ　（ＷＴ　ｍＲＮ＾と 呼ぶ）をコードしていること、を示した。

ＷＴ　ｍＲＮ＾は、小数の細胞型（すなわち、主に腎臓細胞と、造血細胞の一部 ）で発現されることが明らかになった。

この配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列についても明らかに され、そのポリペプチドの性質についても調べた。これらの性質の内のいくつか 、例えば、４個のジンク・フィンガー領域の存在並びにプロリン及びグルタミン 富裕領域の存在は、転写調節における役割を示している。１１ｐ１３という遺伝 子位置、組織特異的な発現性及び予想される機能は、１１ｐ１３ウイルムス腫瘍 遺伝子であることを裏付ける。本発明は、さらに、ウィルムス腫瘍遺伝子を特定 する方法；単離したウイルムス腫瘍遺伝子、単離した遺伝子転写部分；単離した コードされたポリペプチド；並びに、それらに基づく診断法および試薬をも含む 。本発明は、あるサンプルについて、明らかに、１１ｐＨウイルムス腫瘍遺伝子 座内に存在するＤＮＡ、そのｍＲＮＡ転写部分またはウイルムス腫瘍コードポリ ペプチドを特定する方法、並びに、この方法に用いられる材料（例えば、核酸プ ローブ、抗つィルムス腫瘍ポリペプチド抗体）を初めて利用可能にする。このこ とは、特に貴重である。なぜならば、ウイルムス腫瘍は極めて悪性であり、急速 に成長するものではあるけれども、有効な治療処方を開発することによって得ら れた、小児腫瘍学における明瞭な成功例の一つとなるものであるからである。本 発明は、ＷＡＧＲまたはウィルムス腫瘍の発生の危険度を、その出現前に推測す る手段を、また、一旦発病したならば、その存在を確定する手段を、提供する。

これにより、発病前に、または、病気の初期に治療を開始することが可能である 。

本発明はまた、ウィルムス腫瘍遺伝子と同一の、または、同様の配列を有するＤ ＮＡの存在を、他の腫瘍型（例えば、白血病細胞、畢丸腫瘍）において検出する ことのできる方法を提供する。これは、ウィルムス腫瘍遺伝子コードポリペプチ ドにたいする特異的なりＮＡプローブまたは抗体を用いることによる。

図の簡単な説明 第１図は、ウィルムス腫瘍遺伝子の単離、その特徴付けを示す図式である。

第２図は、ＷＡＧＲ領域の図式であり、単一コピー・プローブ、＋７−１８ｐ２ ．　＋８−３ｐ４および、＋８−３と相同のｃＤＮＡのマツプ位置を示す。

第３図は、Ｗｉ３３　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と、ヌクレオチド１から１０ ３５にわたるオーブンリーディングフレームのアミノ酸配列を示す。プロリン・ グルタミン富裕領域（ヌクレオチド６から４６８まで）におけるプロリン及びグ ルタミン残基を、四角で囲み、４ジンク・フィンガー（ヌクレオチド６７０から １００２まで）にあって、ジンク・フィンガーコンセンサスに適合するアミノ酸 に下線をづ匹また。

第４図は、Ｗｉ３３　ｃＤＮＡの図式マツプである。オーブンリーディングフレ ームを、四角く囲った領域として表わし、それから得られた、プロリン・グルタ ミン富裕領域のアミノ酸配列を、陰をつけたオーブンリーディングフレームの上 に表わす。

第５図は、Ｗｉ３３からジンク・フィンガーコンセンサス領域までの配列と、ヒ トＥＧＲＩ、ＥＧＲ２−遺伝子の配列との比較を示す図式マツプである。

第６図は、ウィルムス腫瘍ｃＤＮＡと各種ＤＮＡとのハイブリダイゼーシヨンに ついてのサザーン・プロット分析の結果を示す。

第６Ａ図は、Ｗｉ３３とハイブリダイズしたＥｃｏＲ１消化ヒトリンパ芽細胞Ｄ ＮＡのサザーン・プロット分析の結果を示す。

第６Ｂ図は、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｗｉ２とハイブリダイズさせた、Ｗｉ　１− １３ハイブリツド細胞系のサザーン・プロット分析の結果を示す。

第７図は、Ｗｉ３３　ｍＲＮＡをコードする、６個の重複コスミドのゲノム構成 を示す。Ｗｉ３３　ｃＤＮＡを含む９３Ｋｂｐゲノム領域の、ＥｅｏＲＩ複合制 限マツプを図の上段に示す。

第８図は、各種組織、腫瘍細胞系におけるＷＴ３３発現のノーザン・プロット分 析の結果を示す。

第８Ａ図は、ヒトにおける、Ｗｉ３３の組織特異性発現の、ノーザン・プロット による分析結果を示す。

第８Ｂ図は、マウス及びヒトの組織から得たＲＮＡの組織特異的分布を、ノーザ ン・プロットによって分析した結果を示す。

第８Ｃ図は、腫瘍細胞系におけるＷＴ３３発現をノーザン・プロットによって分 析した結果を示す。

第９図は、ウィルムス腫瘍融合蛋白の発現を示す。

発明の詳細な記載 本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子、当該遺伝子のｍＲＮＡ転写部分の特定と特徴 付けに基づく。また、ウィルムス腫瘍遺伝子によってコードされたポリペプチド の特徴付けに基づく。下記に詳細に述べるように、染色体１１バンドｐ１３　（ ｌｌｐ１３　）上のウィルムス腫瘍遺伝子座を特定する体質性、腫瘍性欠失の境 界内にマツプされる一連のゲノム・クローン、ｃＤＮ人クワクローン離し、その 特徴を明らかにした。同様に、後述するように、当該クローンに対応する転写単 位によつてコードされるｍＲＮＡの発現パターンを決めた。さらに、ウィルムス 腫瘍遺伝子座によってコードされるポリペプチドの特徴を調べたところ、このポ リペプチドが、転写の調節にあづかっていることを示唆するいくつかの特性を持 つことが明らかになった。

ここに記載する研究に基づき、ウィルムス腫瘍ＤＮＡの有無を測定する方法が、 細胞内におけるウィルムス腫瘍ＤＮＡ定量法と同様に、開発された。ウィルムス 腫瘍ＤＮＡとハイブリダイズする核酸プローブ、ウィルムス腫瘍ＤＮＡの転写部 分とハイブリダイズする核酸プローブも生産され、この方法の中で用いられた。

ここでは、これを、ウィルムス腫瘍遺伝子またはウィルムス腫瘍ＤＮＡと呼ぶが 、染色体１１バンド１３上の遺伝子座をこのように呼ぶのは、簡単のためであっ て、本発明を、ＷＡＧＲやウィルムス腫瘍と呼ばれる医学上の状態にのみ限定す ることを意味するものではない。したがって、ウィルムス腫瘍ＤＮＡと呼ばれる １１ｐ１３遺伝子座が、他の腫瘍型、例えば、白血病細胞、畢丸腫瘍にも見られ る（に伴う、を引き起こす）と期待しても当然である。本発明は、そのような存 在をも含むことを意図したものであり、また、等測的遺伝子またはＤＮＡ配列（ すなわち、ここに記載するプローブと交差ハイブリダイズし、それが存在する細 胞において劣性癌遺伝子または癌抑制遺伝子として働＜ＤＮＡ配列である）・を 、他の腫瘍型においても特定することのできる方法を提供する。

下記は、ウィルムス腫瘍ゲノムＤＮＡとｃＤＮ＾、　ｍＲＮ＾転写部分、コード されたポリペプチドの単離及び特徴付けを記載したものである。

分子レベルのマツピング実験によって、ＷＡＧＲ領域は、１１ｐ１３中の特定間 隔に狭められた。こ−の間隔は、赤血球カタラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝 子と、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨＢ）のサブユニットをコードする遺伝子によっ て境されている。

おける遺伝子の位置をさらに明確にするために、３つの互いに相補う戦略を用い た。すなわち、体細胞遺伝学、分子クローニング、パルス式フィールド・ゲル電 気泳動である。特定の転座・欠失染色体を分離する体細胞ハイブリッドは、ＷＡ ＧＲ領域内における個々の遺伝子の位置を解明し、特定するのに効果的な試薬で ある。さらに、相当数の１１ｐ１３　ＤＮＡマーカーが、染色体１１特異的ＤＮ Ａライブラリーから単離され、その特徴が明らかにされた。Ｌｅｖｉｓ、ｅｌ　 Ｉｌ、、１ｂｉｄ　（１９８８）；　Ｃｏｍｐｌｏｎ、ｅｊ　ｓｌ、。

Ｃｅ１ｌ、　５５：８２７−１１３６　（１９８８）；　Ｄｅｖｉｓ、　ｅｔ　 ｓｌ、、　Ｇｃｎｏｍｉｃｓ、３：２４−２７（１９８８暑）；　Ｄｔｙｉｓ、 　ｅＩ＊１．、５ｃｉｅｎｃｅ　、２４１：８４０−８４２（１９８８ｂ）；Ｇ ｅ５ｓｌｅｒ、ｚｔ　ｒｌ、、］、　Ａｍ、　Ｈｕｔ　Ｇｅａｅｔ、、　４４： ４ＢＧ−４９５（１９８９＊）；Ｇｚｓｓｌｅｒ、　ｔｌ　＊１．、５ｃｉｅｎ ｃｅ　、ｌｔ：１５？５−１５７２　（１９８９ｂ）。パルス式フィールド・ゲ ル電気泳動によって構築された長尺の制限マツプによって、いくつかのＷＡＧＲ 疾病遺伝子について、比較的長い間隔が明確になる。

ウィルムス腫瘍ＤＮＡの単離法を、第１図に、図式的に表わす。最初、ヒト染色 体１１の短腕が、他のヒト・ゲノムから分離されているハムスター・ヒト体細胞 系（１１−１１’）を用いて、コスミド・ライブラリーを作りた。その方法は、 実施例に記載しである通りである。いずれも、染色体１１の短腕にマツプされる ヒトＤＮＡを含む、１１９個のコスミド・クローンを、このライブラリーから単 離した。次に、ＷＡＧＲ領域を含むクローンを特定した。これは、ヒト染色体１ １ｐの各種フラグメントを含む体細胞ハイブリッドのマツピングパネルを用いて 行なった。

このようにして単離したクローンの内、３種（ＪＴ−１８，１８−３゜ＪＩＧ− １５）が、ウィルムス腫瘍遺伝子を含む領域にもつとも近接してマツプされてい るようであった。ｌ１ｌ−３，１１０−１５の制限マツプから、相当な重複が明 らかになったので、このコスミドの内の一つ（３８−３）だけをさらに分析する ことにした。

ＩＴ−１８Ｐ２．　Ｊ８−３ｐ４と名付けた単一コピー配列をサブクローンし、 それぞれ、ＪＴ−１８，１８−３コスミドから特定した。これら単一コピーのＤ ＮＡ配列の微細な位置については、一連の体細胞ハイブリッドにたいするハイブ リダイゼーションによって決めた。このハイブリッドは、ＷＡＧＲ領域内の特定 の間隔を示す転座および欠失を有する患者から得たものである。これは、実施例 に詳細に記述し、その所見を要約したマツプは第２図に示す。

ｃＤＮ＾ライブラリーをスクリーンするためのプローブとして、Ｊ８−３ｐ４を 用いた。Ｊ８−３ｐ４をこの目的のために選んだのは、そのマツプ位置から、こ れが、ウイルムス腫瘍遺伝子座にごく近いか、その内部に含まれることが示され たからである。さらに、実施例で説明するように、二つの観察所見から、１Ｂ− ３ｐ４が、転写単位の一部を含んでいることが示唆されたからである。ヒト胎児 性腎（ＨＥ　Ｋ）細胞から得たｃＤＮ＾ライブラリーを、３８−３ｐ４でスクリ ーニングした。ノーザン・プロットの結果に基づき（実施例参照）、ヒト成人腎 ライブラリー、ヒト前Ｂ細胞ライブラリーもスクリーニングした。この３個のラ イブラリーから得た４種のｃＤＮＡクローンを詳細に調べた。すなわち、ＨＥＫ から得たちの二つ（ＷＴ４．　ＷＴ２）　、ヒト成人腎臓からのもの一つ（ＷＴ ２２）　、前Ｂ細胞系から得たちの一つ（ＷＴ３３）である。もう一つ別の相同 性ｃＤＮ＾クローン（ＷＴ１３）を、ＨＥＫライブラリーから単離した。これに は、独立に単離した保存ゲノムＤＮＡクローン、λに１３を用いた。Ｇ　Ｉ　ｓ 　ｓ　ｅ　ｒ、　Ｔ、著、ヒト１１番目染色体の微細構造と進化、理学博士論文 、マサチューセッツ工科大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州（１９８ｇ） 。

ｃＤＮＡクローンＷＴ３３は、長さが２３１３塩基対（ｂ　ｐ）で、単離した中 では最長のものである。このものは、単離したクローンの５°、３°の両方向へ もつとも遠くまで延びている。他の４つのｃＤＨ＾は、長さが約１０００から１ ２００ｂｐであるＤＮＡ配列の共通内部領域を共有している。

ｃＤＮ人クロりンＷＴ３３を選んでその後の分析対象とした。このことについて は、実施例に詳細に記載しである。ＷＴ３３ヌクレオチド配列を決定し、予測し たアミノ酸配列を得た。いずれも第３図に示しである。塩基配列分析から、３４ ５個のアミノ酸から成る連続オーブンリーディングフレームの存在が明らかにな った。これは、ヌクレオチド１から１０３５に渡っている。このオーブンリーデ ィングフレームが、ＷＴ３３コード部分の大部分を代表しているようであるが、 イニシエーターのメチオニン・コドンを含んではいないらしい。プライマー拡張 実験によって、ＷＴ３３に相当するｍＲＮ＾の５゛末端に、さらに２ｏｏｂｐが 存在することが示唆された。このｃＤＮＡに相当する遺伝子座の転写パターンは 、多少、複雑である。ＲＮＡ　ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた実験に よって、ｍＲＮ＾のコード領域の５°セグメントのｍＲＮＡ塩基配列に変動のあ ることがあきらかになった。これから、各組織タイプ間には、いろいろのスプラ イシングパターンのあることが示唆された。

特に興味深いのは、ヌクレオチド６７０から１００２までが、４個の、相接触す る「ジンク・フィンガー」領域をコードしていることである。ＷＴ３３　（第５ 図）によってコードされる４個のジンク・フィンガーは、すべて、ジンク・フィ ンガーの共通配列に適合する（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、、　ｅｌｓｌ、　ＥＭＢＯＬ 、４：　１６０９−１６１４（１９８５）；　Ｅｙｘｎｓ、　Ｒ，Ｎ、、　ｅｊ 　ｓｌ、、Ｃｅ１ｌ、　５２：ｉ３　（１９８ｇ）　）　、ジンク・フィンガー 間＋７）Ｈ／Ｃ結合は、ＴＧＥ−Ｒ／に−Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ｘというアミノ酸配列に よって代表されるが、これも、得られたアミノ酸配列の中に保存されている（Ｓ ｈｕｈ、　Ｒ，、ｅｌ　ｔｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　４７：１０２５−１０３２　（ １９８６））。

他のポリペプチドについても、ＷＴ３３に関連する配列を調べていくと、最近特 定された、２種のヒト初期成長反応（ｅｓｒ１７ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｓｐｏｎｓ ｅ　）遺伝子ＥＧＲＩ（Ｓｕｋｈｘｌｕ、　ｅｌ　ＩＩ、、　Ｃｅ１ｌ、　５３ ：３７−４３　（１９８１１））とＰＣＲ２（ｌｏｓｔｐｈ、ｃｌ　Ｉｌ、、Ｐ ｒｏｃ、Ｎ５ｊ１．　Ａｃ１ｄ。

のアミノ酸配列との間に５１％の類似性のあることが明らかになった。初期成長 反応遺伝子は、細胞増殖を制御する経路にも関わりでいるらしいことが示唆され ている。ＷＴ３３の個々のジンク・フィンガーは、ジンク・フィンガー共通配列 に従って配列しており、また、第５図のように、ＥＧＲＩ及びＰＣＲ２のジンク ・フィンガーと比較される。ＷＴ３３ポリペプチドは、ＴＦＩＩＩ＾及びＳｐｌ を含む他の蛋白のジンク・フィンガーにたいして相同性を有しているが、その相 同の程度は、ＥＧＲＩ及びＰＣＲ２にたいしてもつとも高く、シかも、その相同 性は、３個の相接触するジンク・フィンガー全てにわたって観察された。

ジンク・フィンガー領域の５′　アミノ末端のアミノ酸の内容も、転写因子と考 えられる蛋白質独特のものである。アミノ末端から、最初のジンク・フィンガー の起始部まで、高濃度のセリン（１０，２％）、プロリン（９，８％）、グリシ ン（９，７％）、スレオニン（８，８％）、グルタミン（７，９％）の諸残基が 存在する。これらのアミノ酸は、ＥＧＲＩ及びＥＧＩＩ２によってコードされる ポリペプチドのアミノ腋末端にも高頻度で見られる。

プロリン及びグルタミン富裕領域は、数種の疑転写因子及び転写因子においても 特色として特定されている。Ｍｉｌｃｂｅｌｌ　ｘｎｄＴｉｉａｎ、５ｃｉｅｎ ｃｅ、２４５＋３７１−３７８　（１９８９）　ｏまた、高濃度のスレオニン及 びセリンが、Ｓｐｌを含む数種の転写因子にも観察されている。Ｃｏｕ＋ｅ７． 　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ、５５：８８７−８９８　（１９１１Ｂ）。

前述のように単離したｃＤＮ＾ＤＮＡンと、１ｌｐ１３におけるゲノムＤＮＡ配 列との関係についても、探査の目を向けた。これは、実施例に詳細に記述した通 りである。簡単に言うと、ＷＴ３３ｃＤＮ＾セグメントを、ヒト２倍体細胞系由 来のゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、かつ、１団の体細胞７％イブリッドに ハイブリダイズさせた。これにより、１１ｐ１３内における微細な構造マツピン グが得られた（表）。第６Ａ図に示したように、ＷＴ３３ｃＤＮ＾は、正常ヒト ＤＮＡの７個のＥｃｏ旧フラグメントとハイブリダイズする。それぞれ長さは、 　１３．５．　１０．４．　６．１．　５．７゜３．７．３．１及び１．８５ｋ ｂである。体細胞ノーイブリッドの分析によって、これら制限フラグメントのす べてが、染色体１１のバンド］）１３に位置することが確認された。さらに、こ れらのＤＮＡ配列は、ＷｉＴ−Ｈ細胞系およびこの系由来の／’ｔイブリッドか ら、すべてホモ接合的に欠失している（第６Ｂ図、および、未発表データ）。

この領域内部におけるゲノムＤＮＡの構造をさらに分析するために、ＷＴ３３を プローブとして用い、他のニスミドＤＮＡクローンを単離した。第７図は、この 分析によって得た４個のコスミド（Ｌ１５６．　Ｌｉ５Ｑ、　Ｌｉ２Ｑ、Ｌｉ２ Ｓ−１）に加えて２個の最初のコスミド（］８−３及び月０−１５）　、および 、ファージ・クローンλｋ１３の複合マツプを示す。Ｇｌｇｓｅｔ、　Ｔ、著、 ヒト１１番目染色体の微細構造と進化、理学博士論文、マサチューセッツ工科大 学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州（１９８８）。クローンされたゲノム配 列は、９０ｋｂより長いＤＮＡセグメントに広がっていた。ゲノムクローンとｃ ＤＮＡクローンとを関係づけるために、各コスミドのＥｃｏＲ１消化物を、ＷＴ ３３　ｃＤＮＡセグメントとハイブリダイズさせた。このようにして、ゲノムＤ ＮＡにたいするｃＤＮＡのサザーン・ハイブリダイゼーションによって観察され た７個のＥｃｏＲＩフラグメントのすべてが、この重複クローン集合中に特定さ れた（第７図）。転写単位の方向性は、各コスミドの制限消化物を、ＷＴ３３　 ｃＤＮＡの各種部分領域由来のプローブとハイブリダイズさせることによって確 定した（実施例参照）。これらのデータから、ＷＴ３１の転写単位は、コスミド Ｌ１５６のＮｏ１１部位近接位置から始まり、３°方向に続いて、１．８５ｋｂ ＥｃｏＲ１フラグメントまで延びていることが示される。このフラグメントは、 コスミドＬ１０９．　Ｌ１５５−１．　１１０−１５．　１８−３およびクロー ンλｋ１３に共通である。これらのハイブリダイズするＥｃｏＲ１フラグメント は約５０　ｋｂにわたった。ＷＴ３３　ｃＤＮＡは、完全長ではないので（上記 参照）、全遺伝子のサイズは、５０ｋｂよりも大きいであろう。

クローンしたゲノムＤＮＡ中の制限酵素認識部位の分析によって、同領域のパル ス式フィールド・ゲル電気泳動マツプとの直接比較が可能である。第７図に示し たように、ＷＴ３３　ｃＤＮＡの５°末端をコードする、ゲノムＤＮＡセグメン トの５°末端は、制限酵素Ｎｏｔ　Ｉの認識部位を含んでいる。パルス式フィー ルド・ゲルマツピングによって、１１ｐ１３ウイルムス腫瘍遺伝子は、２個の隣 接するＮｏｔ　ｌフラグメントの境界内に位置することが証明された。このフラ グメントの長さは、５００ｋｂと３２５ｋｂである。Ｓｋｉ　ｌ及びＮｏｔ　１ 両方によって消化されたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションの結果から、コ スミドＬ１５６におけるＮｅｔ　１部位は、３２５ｋｂと５００ｋｂのＭａｌ　 ｌ制限フラグメント間の接合部を表わすことが確認された。パルス式フィールド ・ゲル分析によって、５００ｋｂ　Ｎｏｔ　ｌフラグメントは、３２５ｋｂＮｏ ｔ　１よりも動原体よりであることが分かっているから、転写は、動原体から末 端小粒の方向に向かって進行するに違いない。

コスミドＬ１５６は、いくつかの制限酵素にたいして、ジヌクレオチドＣｐＧを 含む認識配列を備えた部位を持つ。この制限酵素としては、Ｎｏｔ　ｌ、　Ｂｓ ５ＨＩｆ及びＥ＊１１がある。上記データ及びパルス式フィールド・ゲル分析か ら、Ｎｏｔ　１部位を取り囲むゲノムＤＮＡ領域にｒＨＴＦ島（ｉｓｌ＊ａｄ） 　Ｊのあることが明らかになった。ＨＴＦ島は、転写単位の５°末端によく見ら れる。

Ｂｉｒｄ、＾、、ｓｌ　Ｉｆ、、Ｃ！ｌｌ、４０：９１−９９　（１９８５）； 　Ｂｉｎｄ、Ａ、、Ｎｔｌｕｒｅ。

３２１：２０９−２１３　（１９８６）；　Ｌｉｎｄｓｓ７．　Ｓ、、！ｌ　ｔ ｌ、、Ｎｓｊ＋＋ｒｅ、３２７：３３６　（１９８７）、これから、コスミ゛ド Ｌ１５６のゲノムＤＮＡは、Ｗ丁３３転写単位の５°末端を含んでいる可能性が あることが示唆゛された。

ＷＴ３３転写部分（２）の大きさ、組織分布についても評価した。

これは、一連のノーザン・プロット実験によって行なった。第８Ａ図は、ヒヒの 各種組織から単離した全細胞性ＲＮＡにたいするＷＴ３３　ＣＤＮＡのハイブリ ダイゼーションを示す。約３ｋｂ長のａ＋ＲＮ八種がへヒヒの腎臓、膵臓ＲＮＡ 中に検出された。３ｋｂのかすかなハイブリダイゼーション・バンドが、長く露 光すると、心臓に認められた（第８Ｂ図）。一方、筋、肝臓、空腸、回腸及び脳 由来のＲＮＡには、検出可能なハイブリダイゼーションは認められなかった（第 ８Ａ図）。ＷＴ３３は、マウス組織由来のＲＮＡとのハイブリダイゼーションに おいても、有効なプローブである。ＷＴ３３と相同な３ｋｂ　ｄＮＡ種も、マウ ス組織内に認められた。ＷＴ３３と相同な３ｋｂ　ｄＮ人種は、マウス腎臓に観 察される（第８Ｂ図）。成熟マウスにおける、ＷＴ３３　ｍＲＮ＾の組織特異性 発現パターンは、ヒヒのものと似ている。マウスにおける発生研究から、ＷＴ　 ３３　ｄＮＡは、胎児腎臓にもっとも高度に発現することが判明した。この発現 は、ウィルムス腫瘍の起源組織と考えられている、後腎芽体における成長調節に あづかる遺伝子と一致する。Ｂｏｖｅ、＠ｌ　ｔｌ、、（１９７６）　１ｂｉｄ 、ＥＧＲＩ及びＥＧＲ２遺伝子と相同性であるという所見からも、ＷＴ３３が、 腎芽細胞の成長調節にあづかっていることが示唆される。

下記のものを含む腫瘍細胞系スペクトラムは、ＷＴ３３　ｃＤＮＡにたいして検 出可能なハイブリダイゼーションを°示さなかった。

すなわち、神経芽細胞腫の２種（ＳＫ−Ｎ−Ｂｓ　（２）及びＮＧＰ）　、網膜 芽細胞腫（ＶＥＲＩ）、乳癌（ＭＣＦ７）　、−骨肉腫の２種（ＨＯＳ及び０２ ０５）、黒色腫の２種（ＳＫ−ＭＥＬ−１３０及びＳＫ−ＭＥＬ−１４７）　、 膀胱癌（Ｅｉ）、結腸癌の２種（ＳＥ４８Ｇ及びＷＩＤＲ）　、子宮頚癌（Ｈｔ Ｌｓ）及びＥｐｓｊｅｉｎ−Ｂｓｒｒウィルス形質転換Ｂ細胞系の２種（ＴＳＨ −１及びＴＳ）Ｉ−２）である。対照的に、いくつかの散発性ウィルムス腫瘍か ら単離したＲＮＡでは、３ｋｂ位置に、ＷＴ３３　ｃＤＮＡにたいして強度のハ イブリダイゼーションが認められた。１例を、第８Ｃ図に示す。

同様に、２種の造血細胞系、すなわち、浄血白血病（Ｋ５６２）と急性リンパ性 白血病（ＣＥＭ　）から単離したＲＮＡも、３ｋｂ位置に、ＷＴ３３にたいする 強いハイブリダイゼーションを呈した。

この結果から、腎臓細胞や、造血細胞系株の一部にＷＴ３３転写部分の発現が証 明された。この結果は、ヒヒの腎臓及び膵臓で主に観察された組織特異的発現と 一致する。

かくして、前記の方法を用いて、ウィルムス腫瘍遺伝子に対応するＤＮＡが特定 され、単離され、配列決定された。このＤＮＡは、約５０ｋｂの広がりを持ち、 長さ約３ｋｂのｄＮ＾をコードする転写単位をコードしていることが判明した。

このｍＲＮＡは、ごく限られた範囲の細胞型にしか発現されない。すなわち、主 に、腎臓、造血細胞の一部である。この遺伝子座によってコードされるポリペプ チドは、転写の調節にあづかっている可能性を示唆するいくつかの特性を有する 。この特性の中には、４個のジンク・フィンガー領域の存在、プロリン及びグル タミン富裕領域の存在も含まれる。予測されるポリペプチドのアミノ酸配列から 、２種の、は乳類成長調節ポリペプチド、ＥＧＲＩ、ＥＧＲ２にたいする目立っ た相同性が明らかにされた。この遺伝子の遺伝学的位置、組織特異的発現及びそ の配列から予測される機能は、この遺伝子が、１１ｐ１３ウイルムス腫瘍遺伝子 であることを示す。

ウィルムス腫瘍遺伝子の単離と特徴付けの結果、ウィルムス腫瘍遺伝子または、 ウィルムス腫瘍遺伝子の代表的な部分に関してサンプルを分析する方法が、この 方法に有効な試薬（例えば、核酸プローブ、抗体）と同様に利用できるようにな った。

この方法は、診断目的にも用いることができる。例えば、ＷＡＧＲ症候群、およ び／またはウィルムス腫瘍発症の可能性・危険度を推定する場合、ＷＡＧＲまた はウィルムス腫瘍と関連する、または、おそらくその兆候である症状を呈する個 人について、その病気の有無を決める場合、などである。例えば、ある個人から 得た細胞を、既知の技法を用いて、第３図に示したヌクレオチド配列の全部もし くは一部をプローブとして調べることができる。このようなプローブのヌクレオ チド配列は、第３図のものと厳密に同じである必要はない。第３図の配列と、用 いた条件下でウィルムス腫瘍遺伝子とハイブリダイズするのに十分な類似性を持 っていればよい。細胞（例えば、血液、腎臓）は、出生前でも出生後に入手した ものでもよい。ウィルムス腫瘍遺伝子の存在は推測できる。細胞は、ウィルムス 腫瘍ＤＮＡや、コードされたＲＮＡ転写部分および／またはウィルムス腫瘍遺伝 子によってコードされたポリペプチドに関して分析することができる。例えば、 細胞を、出生前、または出生後に入手して、分析し、ウィルムス腫瘍ＤＮＡに関 して分析することができる。

これは、普通のプロット法（例えば、サザーン・プロット法）や、ウィルムス腫 瘍のすべて、または、一部とハイブリダイズする（と相補的な）、放射性ラベル したＤＮＡプローブを用いて、実行できる。放射性ラベルしたＤＮＡプローブは 、ハイブリダイゼーションを起こすのに適当な条件下で、その細胞ＤＮＡを、相 補的ＤＮＡとハイブリダイズできるように処理した細胞ＤＮＡと結合させること ができる。サンプル中の標識ＤＮＡプローブと相補的ＤＮＡ　（もしあれば）と がハイブリダイズし、標識ＤＮＡプローブ／サンプルＤＮＡ複合体を形成するの に十分な時間を経過させた後、既知の方法を用いて（例えば、オートラジオグラ フィー）、標識ＤＮＡプローブ／サンプルＤＮＡ複合体の検出を実行する。標識 は、検出することができ、その存在が、プローブＤＮＡが相補的ＤＮＡと結合す る能力に干渉しないものである限りどんな物質でもよい（例えば、蛍光物質）。

標識ＤＮＡプローブ／サンプルＤＮＡ複合体を検出する方法は、用いる標識の型 に依存する（例えば、蛍光発光団を用いる場合には、蛍光検出法を用いる）。必 要なら、サンプルから入手したＤＮＡを増幅することもできる。これには、ポリ メラーゼ連鎖反応のような既知の技法を用い、この増幅したＤＮＡを、ウィルム ス腫瘍ＤＮＡの有無の分析に供する。たとえサンプルＤＮＡが増幅されても、生 成物は、対象の増幅ＤＮＡ（ウィルムス腫瘍ＤＮＡを含むＤＮＡ）と、対象のＤ ＮＡ以外の増幅ＤＮＡを含む、増幅混合体である。一般に、増幅混合体中のＤＮ Ａは、既知の技法を用いて、大きさに基づいて分離される。化学的な検出方法も 用いられる。分離された増幅ＤＮＡは、既知の技法を用いて、対象ＤＮＡについ て分析する。既知の技法とは、例えば、サザーン・プロット法、ＤＮＡ配列決定 、適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化または臭化エチジウム染色ゲルによ る可視化等である。

また、プローブとして、ウィルムス腫瘍遺伝子の全部、または、一部を用いて、 サンプル中のｍＲＮＡを検出することができる。この方法は、ある個人の細胞か ら得たｍＲＮＡを用いても、または、細胞から得たｍＲＮＡを既知の増幅法、例 えば、ＲＮＡＰＣＲ等によって増幅して用いてもよい。いずれの場合にしろ、Ｒ ＮＡは、既知の技法、例えば、ノーザン・プロット法を用いて分析される。

ウィルムス腫瘍遺伝子コードポリペプチド（または、あるポリペプチド部分）に たいして特異的なＷ体も、診断目的に使用することができる。このような抗体は 、既知の方法で生産することができる。Ｍｓｉｉｓ目＄、Ｔ、ら、「分子クロー ン法、実験室操作法Ｊ　、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨｓｒｂｏｒ　（１９８２） 　ｏ本実施態様においては、ウィルムス腫瘍遺伝子゛によってコ・−ドされるポ リペプチド（例えば、第３図の配列のすべて、もしくは、一部、または、それと 機能的に等価のものによってコードされるもの）にたいして特異的な抗体を、あ る個人から得たサンプル（例えば、腎臓細胞、血液細胞）と混合する。使用した 抗体は、検出できるように標識できる（例えば、放射性物質または蛍光物質で） 。標本中のポリペプチドおよび抗体が、合体あるいは結合し、ウィルムス腫瘍遺 伝子によってコードされたポリペプチド／特異的抗体複合体が形成するのに十分 な時間を経過させた後、複合体の存在（有無、および・または量）を、既知の技 法を用いて決定する。もし標識した特異的抗体を用いたのであれば、標識複合体 の存在を決定する（例えば、オートラジオグラフィー、蛍光検出法によって）。

または、サンプルを、固相の支持体（例えば、ニトロセルロース、ガラス・スラ イド、ポリスチレン・ビーズ、免疫磁性体ビーズ）と混合させてもよい。この支 持体には、複合体中に存在する抗体にたいして特異的な抗体を付しておく。これ により、サンプル中の（例えば、ポリペプチド／特異的抗体複合体中の）特異的 抗体が、固相の支持体に結合する。

このようにして得られた固相支持体結合複合体をサンプルから°取り出し、既知 の技法を用いて検出する。例えば、ウィルムス腫瘍遺伝子にコードされたポリペ プチド・特異的抗体複合体中の抗体が標識されているならば、支持体結合複合体 の検出は、その標識を検出することによって実行される。

前記のプローブ（例えば、ＤＮＡプローブ、ａｌｌｌｌＡプローブ及び抗体プロ ーブ）を用いて、個人個人のウィルムス腫瘍遺伝子の違いを決定することができ る。この違いは、当該遺伝子における、前述した欠失または置換である場合もあ る。この遺伝子について、観測するのに好都合な部分と言えば、ジンク・フィン ガー領域をコードする部分、もしくは、その発現産物、好ましくは、ジンク・フ ィンガー領域の少なくとも一部をコードするヌクレオチドであり、抗体プローブ は、当該残基そのものとの親和性を検出する。前述したように、プローブは、第 ３図に示した遺伝子全体、または、その一部に対するものである。この技術分野 でよく知られているように、このような部分は、少なくとも、約２０ヌクレオチ ド長でなければならない。ある好ましい実施態様では、あるプローブは、ＰＣＲ のプライマーのうち少なくとも一つとして、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡを調べるこ とによりてその遺伝子の中の欠失または変更を決定するのに役立つ。本開示に基 づく技法から明かな通りである。ある機能的な部分に、このような欠失または変 更のあることを検出したことは、癌性または前癌性状態の存在を示唆する。上記 プローブは、ヒト由来の細胞、液体を調べることができる。例えば、ヒトから、 あらかじめ定めた細胞または液体サンプルを取り、プローブを、その細胞または 液体サンプルに加え、プローブから、ウィルムス腫瘍遺伝子の機能的部分に変更 または欠失があるかどうかを確かめる。そのような変更または欠失は、癌性もし くは前癌性状態の存在を示す。標準的な技法、例えば、サザーン・プロット法、 ノーザン・プロット法、ＰＣＲ，ＥＬＩＳ＾、イムノアッセイを、この確定に用 いることができる。

本法は、ＷＡＧＲ及びウィルムス腫瘍の早期発見に有効である。

結果として、外科、化学療法、および／または放射線療法という形での早期治療 が可能になる。例えば、本法は、腹部に成長する塊、腹痛、血尿、または、ウィ ルムス腫瘍を疑わせる身体的症状（例えば、発熱、おう吐、食欲不振、不快、赤 血球増加症、高血圧）を有する患者において、上記状態を診断するのに用いるこ とができる。

ウィルムス腫瘍遺伝子を検出する本法は、また、他の腫瘍型において、ウィルム ス腫瘍の場合と同一のまたは相似の障害を特定するのにも用いることができる。

すなわち、ある特定の型の腫瘍の形成に直接あづかったり、または、その唯一の 原因であるということはないにしても、ウィルムス腫瘍遺伝子（すなわち、本明 細書中で、ウィルムス腫瘍遺伝子と呼ぶＤＮＡ配列）または、それと緊密な関連 を持つ遺伝子が他の腫瘍型（例えば、白血病細胞、畢丸腫瘍）に発現すること、 および、そのような遺伝子が、それらの腫瘍型と因果的に結びついていたり、ま たは、そのような腫瘍型の、信頼度の高い指標（マーカー）として役立つことを 期待するのは当然だからである。従って、本法、および、適当な試薬、例えば、 ここに記載したコスミド・クローンやウィルムス腫瘍遺伝子自体のＤＮＡ配列等 を用いて、他の腫瘍型においても、染色体１１バンド１３における同様の障害を 特定することができる。ここに記載したＤＮＡ配列を用いて、ある腫瘍サンプル について（例えば、白血病細胞、畢丸腫瘍）、既知の技法やここに記載した方法 を用いて、変化した１１ｐ１３配列を特定することができる。

このポリペプチドまたは、その免疫活性部分を、治療的または診断的目的のため に用いることができる。

例えば、ウィルムス腫瘍遺伝子ｃＤＮＡ配列を、好ましくは、第３図に示した配 列、または、ＡＴＧ開始配列を含む、それと機能的に等価のもの、ｃＤＮ＾配列 から下流の３′方向のポリアデニル化配列、さらにできれば複製開始部を含むベ クターを用いて、細胞にトランスフェクトすることができる。ベクターにはまた 、サプレッサー遺伝子の発現を促進するためにプロモーターを含ませる。ベクタ ーで用いるプロモーターは、既知のプロモーターのいずれであってもよく、その 選択は、使用したい宿主細胞によって支配される。すなわち、この細胞は、所期 の生成物の発現を可能にするように選ばれたものである。レトロウィルスプロモ ーターが好ましい。そのようなプロモーターとして、＾ｋｙ、　５Ｌ３−３及び フレンド・ウィルスのようなレトロウィルスプロモーターが挙げられる。ベクタ ーは、好ましくは、エンハンサ−を含むものがよい。そのようなエンハンサ−は 本技術分野で既知であり、例えば、ウィルス性エンハンサ−がある。

さらに好ましくは、組織特異性のエンハンサーを含むことが望ましい。ベクター は、さらに、マーカー遺伝子を含むものが好ましい。それによって、形質転換細 胞検出が容易になるからである。そのようなマーカーは、この技術分野において はよく知られており、抗生物質耐性遺伝子を含んでもよい。例えば、細菌性ネオ マイシン耐性遺伝子が挙げられるが、これは、真核細胞において、抗生物質６４ １ｇにたいして、優勢な、選択可能な耐性を付与する。

異なる細胞系は、トランスフェクトされたサプレッサー遺伝子ＤＮＡを取り込み 、適当なプロモーターを用いて発現するにあたって、その能力はまちまちである が、広範な宿主細胞を使用することができる。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３．　ＣＩＯ ，ＣＯ３，５Ｆ−９（＾ＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１７１１）及び５Ｆ−２１が好 ましい。普通、は乳類細胞が好ましいが、本発明の細胞系は、それだけに限られ るものではない。例えば、大腸菌のような細菌細胞を用いることもできる（実施 例参照）。

細胞系を形質転換させるのに、ベクターを用いることができる。例えば、この技 術分野でよく知られた様々の方法を用いて、ｐｓｉ／２　（エコトロピック、　 ｅｃｏｌｒｏｐｉｃ　）　、ｐｓｉＡＭ　（アンホトロピック、　ｘｍｐｈｏｌ ＋ｏｐｉｃ　）細胞系に導入することによる。好ましい方法としては、燐酸カル シウム共沈澱法があり、これについてはＷｉｇｌｅｒ、ｅｌ　！＋、、　Ｃｅ具 　１６：７７７−７８５　（１９７９）を参照されたい。上記細胞系は、ベクタ ー由来のゲノムを含む、感染性、複製欠損、マウス白血病ウィルスを構成的に生 産する。Ｃｏｎｅ、ｅｌＩ＋、、　ＰＮＡＳ　８１：６３４９−６３５３　（１ ９８４）；　Ｍｘｎｎ、　ｅｔ　ｘｌ、、Ｃｅ具　Ｕ；１５３−１５９　（１９ ８３）　トランスフェクションの二日後、マーカー、すなわち、抗生物質耐性遺 伝子を調べることによって、細胞を選択することができる。また、ベクターもこ の遺伝子を含んでいることが好ましい。抗生物質耐性クローン、例えば、Ｇ４１ ８は、短期間に、通常７−１０日で、明らかになる。

抗生物質耐性クローン、ｐｉｉ／２．　ｐｃｉ／ＡＭを単離し、大量のサプレッ サー遺伝子産物を生産するクローンを選び出す。次に、この細胞を、標準培養液 で培養し、必要に応じて、収穫する。

次に、この細胞の生産するタンパク質を用いて、サプレッサー遺伝子産物（蛋白 質）にたいする抗体を生成する。得られた抗体は、意図する特定の応用に従って 、ポリクロナールでも、モノクロナールでもよい。このような抗体は、当業者に よく知られた技法を用いて調製することができる。例えば、蛋白質、または、そ の蛋白質の抗原性部分を、カサガイのヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に結合させ、 ウサギのような動物の中で抗体を生成させることができる。通常、抗体を生成す るには、ペプチド−ＫＬＨの複合体を、約２カ月に渡って、数回注入する。次に 、標準法を用いて、抗体を、血清から収集する。また、別のやり方として、細胞 内に、モノクロナール抗体を生産させることもできる。すなわち、細胞に、ハイ ブリドーマ細胞を形成するのに用いられる標準融合法によって、その蛋白にたい する抗体を生産させることもできる。（Ｋｏｈｌｅ＋、　Ｇ、、ｅｌ　１１．、 　Ｎｓｌｗｒｅ　２５６：４９５　（１９７５Ｌ引用によって、この内容に含め ることにする）。

通常、この方法では、抗体産生細胞と、恒久細胞系、例えば、ミエローマ細胞と を融合させ、ハイブリッド細胞を作る。また別のやり方として、Ｈｏ５ｅ他の方 法を用いてモノクロナール抗体を、細胞から生産することもできる（Ｈ■ｅ、　 ｅｌ　ｉｆ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５　（１９８９）、引用によっ て、この内容に含めることにする）。

例えば、ハイブリドーマは、サプレッサー遺伝子含有ベクターによって形質転換 した生細胞で、マウスを免疫することで生産することができるが、これは、この サプレッサー遺伝子産物を発現する。例えば、蛋白質全長を免疫原として用い、 その蛋白質全長に渡る特異性を持つ一群のモノクロナール抗体を生産することも 可能である。好ましくは、抗体をプローブとして作成する場合には、転写領域の いずれかのような遺伝子配列、例えば、ジンク・フィンガー領域のいずれかのよ うな遺伝子配列及び欠陥蛋白を示すと思われるポリペプチドの免疫原部分を用い るのがよい。できれば、この領域のシスティン残基のどれかの欠失または変化を 検出できる抗体を生産することが好ましい。

免疫原ペプチドは、少なくとも、８アミノ酸長でなければならない。実施例に示 したウィルムス腫瘍融合蛋白を用いて、標準法により、抗体を生産することがで きる。

宿主細胞の、十分な数の生細胞で、腹腔（１，Ｐ、）注入によりマウスを免疫す ることができる。この宿主細胞は、サプレッサー遺伝子ベクターでトランスフェ クトされることになっている。この腹腔注入の直後に、例えば、水に溶かしたサ イクロホスファミドの腹腔注射を行なってもよい。このサイクロホスファミド投 与は、第１回注入後１日か２日に繰り返す。免疫化の約２週間後、マウスに、形 質転換宿主細胞の十分量を注入し、さらに２週間、間をおく。そこで、全工程を もう一度繰り返す。

第２回の形質転換細胞注入後４日目に、動物を層殺し、第１回の融合用に、その 膵臓を入手する。

ハイブリドーマは、例えば、下記のような通常の方法を用いて、細胞を融合する ことによって生産される。すなわち、５Ｐ２１０　ミエローマ細胞で免疫したマ ウスから、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）法によって生産することができ る。細胞は、免疫マウスから無菌的に取り出し、膵臓細胞の単一細胞懸濁を、腎 臓を血清非含有培養液（例えば、ＤＭＥ）で潅流して入手する。膵臓細胞とミエ ローマ細胞を一緒に、例えば、膵臓細胞対ミエローマ細胞が５対１の比率で混合 する。次に、細胞を遠心し、上清を吸引で除去する。次に、細胞を標準法を用い て培養液中で増殖させる。ハイブリドーマは、融合操作の後増殖するが、次に、 抗ヒト・サプレッサー産物抗体の分泌について、スクリーニングを行なう。これ には、細胞の溶解産物にＥＬＩＳＡ法を用いる。陽性の結果を呈したハイブリド ーマは、限界希釈によって希釈し、クローンする。これは、細胞と、それに由来 する抗体が、本当に、モノクロナールであることを確実にするためである。ヒト ・サプレッサー遺伝子産物にたいする抗体の存在がテストの結果陽性であったハ イブリドーマ・コロニーを、培養液中で、例えば、１ｍｌ当り５ハイブリドーマ 細胞の濃度となるように希釈する。一旦、コロニーが成長したら、再び、その上 清について、ヒト拳サプレッサー遺伝子産物にたいする抗体の有無についてテス トする。もし、ＥＬＩＳＡアッセイでテストして見て、その結果が陽性であるな らば、そのコロニーを再び限界希釈でクローンする。

ここに得られた抗体は、前述したアッセイ法のプローブとして用いることができ る。このような抗体プローブは、得られる蛋白産物に影響するサプレッサー遺伝 子の変化、欠失にたいして特に感受性が高い。したがって、この抗体プローブは 、遺伝子の欠失ないし変化が、機能単位に影響を及ぼしているかどうかを調べる 場合、簡単で、能率的な手段となる。抗体プローブを用いることによって、発現 蛋白質のレベルや、発現に変化があるかどうか、についても確定することができ る。結果を、サンプリングした材料の基礎レベル、例えば、血中のサプレッサー 遺伝子産物のレベルと対照させて比較したり、あるいは、ある個体の試験細胞（ あらかじめ選んだ細胞）を、同一個体のもので、悪性のものでないと思われる、 別の細胞と比較する。もし変化があれば（例えば、変化した電気泳動度を持った 反応蛋白質が無ければ）、試験細胞は、悪性であることを示す。さらに、同一個 体から、様々な時間に細胞サンプルを採取して、それを比較のレベルとすること もできる。これは、ヌクレオチド−プローブについても実行することができる。

本発明に基づいて、抗体、またはプローブの混合体、例えば、抗体プローブ（複 数）を検出のために用いることができる。プローブ、例えば、抗体を、直接リポ ータ−でラベルしたり、従来の方法を用いて、特異的な結合ペアの片割れ（メン バー）を用いて間接的にラベルすることもできる。

特異的な結合ペアは、免疫型でも非免疫型でもよい。免疫性特異的結合ペアにつ いては、ハプテン／抗ハブテン系の抗原抗体システムが例示される。これには、 フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、 ビオチン／抗ビオチン、ペプチド／抗ペプチド等が含まれる。特異的結合ペアの 抗体メンバーは、その技術分野に熟練した人々にはよく知られている通例の方法 をもちいて生産することができる。

このような方法は特異的結合ペアの抗原メンバーで動物を免疫化することを含む 。もし特異的結合ペアの抗原メンバーが、免疫性のものでなかったら、例えば、 ノ＼ブテンだとしたら、キャリアー蛋白に共有的に結合させて、免疫性にするこ とができる。

非免疫性結合ベアには、二つの成分が、互いに自然の親和性を有し、抗体ではな い、システムが含まれる。非免疫性ペアの例としては、ビオチン−ストレプトア ビジン、内在因子−ビタミンＢ１２９葉酸−葉酸結合蛋白質、等がある。

抗体を、特異的結合ペアのメンバーで共有結合的にラベルする方法は様々ある。

方法は、特異的結合ペアのメンバーの性質、望ましい結合型、抗体の、各種結合 化学作用にたいする許容度に基づいて選ぶ。ビオチンは、市販されている活性誘 導体を用いて抗体に共有結合的に結合させることができる。この内のいくつかを 挙げると、蛋白質のアミン基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ド；炭水化物部分、アルデヒド及びカルボキシル基にカルボジイミド結合を介し て結合するビオチンヒドラジド；スルフヒドリル基に結合するビオチンマレイミ ドとヨードアセチルビオチンがある。フルオレセインは、フルオレセインイソチ オシアネートを用いて、蛋白質のアミン基に結合させることができる。ジニトロ フェニル基は、２．４−ジニトロベンゼンサルフェートまたは２．４−ジニトロ フルオロベンゼンを用いて、蛋白質のアミン基に結合させることができる。他の 標準的な結合法を用いて、特異的結合ペアの片割れに、モノクロナール抗体を結 合させることができる。この結合法には、ジアルデヒド、カルボジイミド結合、 同種官能性架橋結合、及び異種二官能性架橋結合が含まれる。カルボジイミド結 合は、ある物質上のカルボキシル基を、もう一つの物質のアミン基に結合させる 有効な方法である。カルボディミド結合は、市販の試薬１−エチル−３−（ジメ チルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いると容易である。

同種二官能性架橋結合物質（クロスリンカ−）は、二官能性イミドエステル及び 二官能性トヒドロキシスクシンイミドエステルを含めて、市販されており、ある 物質上のアミン基を、別の物質のアミン基に結合させるのに用いられる。異種二 官能性架橋結合物質は、異なる官能基を育する試薬である。もつともｉ平凡な市 販の異種二官能性架橋結合物質は、１官能基にアミン反応性のＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステルを有し、第２の官能基として、スルフヒドリル反応性基を 有する。もつとも平凡なスルフヒドリル反応性基は、マレイン酸イミド、ピリジ ルジスルフィド、活性ハロゲンである。官能基の一つとして、光活性アリール・ ナイトレンがある。これは照射されると、いろいろな基と反応する。

検出できるように標識したプローブ、例えば、抗体、検出できるように標識した 抗体、あるいは、特異的結合ペアの、検出できるように標識したメンバーを、レ ポーターに結合させる。

レポーターは、放射性同位元素でも、酵素でも、蛍光性、化学発光性または電気 化学物質であってもよい。通常用いられる二つの放射性同位元素は、Ｉ、Ｈであ る。標準的な、放射性同位元素標識法には、クロラミンＴ、ラクトパーオキシダ ーゼと、　■にはＢｏｌｌｏｎ−Ｈｕｎｌｅ＋法、３Ｈにはメチル化還元がある 。

本発明に用いるのが適当な酵素としては、次のものがあるが、それに限定される ものではない。西洋ワサビ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β −ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ラクタマ ーゼ、ウレアーゼ及びリゾチーム。酵素標識は、ジアルデヒド、カルボジイミド 結合、また、抗体の特異的結合ペアの片割れへの結合に関して記載したように、 同種二官能性架橋結合物質、異種二官能性架橋結合物質を用いることによって促 進される。

選ぶ標識法は、酵素に付属する官能基、標識の対象となる物質、および、その両 方の結合条件にたいする許容能力による。

本発明に用いられる標識法は、下記のものを含む、最近よく用いられる方法の内 のどれかであってよいが、それらのみに限定されるものではない。すなわち、Ｅ ｎｇｖｓｌｌ　ｘｎｄ　Ｐｅｔｒｌ＋ｕｎｎ。

Ｉｍｍｏｎｏａｓｓａ７　４　（３）　：２０９−３２７　（１９８３）及びＪ ｇｂｌｏｎｓｋｉ、　Ａｌ１１ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４８：１９９　（１９８５）　らの記載した方法である。

標識は、例えば、スペーサーや、特異的結合ペアの他の片割れを用いるような間 接法によって行なってもよい。この１例として、ビオチン化した抗体を、無標識 のストレプトアビジン及びビオチン化酵素で検出するやり方がある。この場合、 ストレプトアビジンとビオチン化酵素は、順番に加えたり、同時に加えたりする 。したがって、本発明では、検出に用いられる抗体は、直接レポーターで、検出 できるように標識されたものでもよいし、特異的結合ペアの第一メンバーで間接 的に検出できるように標識されたものでもよい。抗体が、ある特異的結合ペアの 第１メンバーに結合している場合は、検出は、抗体と特異的結合第１メンバーの 複合体を、前述したように、標識または無標識の特異的結合ペアの第２メンバー と反応させて行なわれる。

さらに、無標識検出用抗体は、この無標識抗体にたいして特異的な、標識抗体と 、無標識抗体を反応させて、検出することができる。このような抗−抗体は、前 述した方法のどれかを用いて、直接または間接に標識することができる。例えば 、抗−抗体は、ビオチンに結合させることができるが、これは、前述したストレ プトアビジン−西洋ワサビ・パーオキシダーゼ系と反応させることによって、検 出することができる。

ある好ましい実施態様として、ビオチンを利用するものがある。ビオチン化抗体 を、次に、ストレプトアビジン−西洋ワサビ・パーオキシダーゼ複合体と反応さ せる。オルトフェニレンジアミン、４−クロロナフトールまたはテトラメチルベ ンジジン（ＴＭＢ）を用いて、呈色性検出を行なうことができる。

本発明を実行するにあたって、望ましいイムノアッセイ方式は、フォワードサン ドウィッチ・アッセイであって、この方式においては、捕捉試薬は、通例の技法 を用いて、支持体表面に固定させる。

アッセイに用いられる適当な支持体には、合成ポリマー支持体が含まれる。例え ば、ポリプロピレン、ポリスチレン、置換ポリスチレン（例えば、アミノ化ポリ スチレン、カルボキシル化ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ポリアミド、 ポリ塩化ビニル等、ガラス・ビーズ、アガロース、ニトロセルロース等、がある 。

。前述したように、癌性状態、前癌性状態に侵されている人を、好ましくは、上 記プローブで診断された人を、治療することも可能である。これは、ウィルムス 履瘍サプレッサー遺伝子産物の治療量を供給することによって行なう。これは、 この技術分野で既知の、いくつかの方法によって実施することができる。

遺伝子移送法を用いて、ウィルムス腫瘍遺伝子またはその機能的フラグメントに 一致するヌクレオチド配列を含むベクターを調製し、そのようなベクターを用い て、悪性細胞を形質転換してもよい。ベクターは、好ましくは、Ｂｒｏｗｎと５ ｃｏｆｆが記載したようなレトロウィルスベクターがよい。Ｂｒｏｗｎ　■ｄ　 ５ｃｏｔ。

ｉｎ　ＤＮＡ　ＣＩｏＩｌｉＢ　、ｗｏｌ　Ｉｌｌ、　Ａ　Ｐｒ＞ｃｌｉｃｓｌ ＾ｐｐｒｏ１ｃｈ、ｃｂ、９゜”Ｒｆｆｉｊｒｏｖｉｒｓｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ″ 、　ＣＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　（１９Ｂ？）。

また、例えば、ウイルムス腫瘍形賀転換細胞系を用いて、機能的ウィルムス腫瘍 遺伝子産物を多量に生産することもできる。

次に、これを、単離・精製し、発熱物質やエンドトキシンをほとんど含まないよ うにする。この遺伝子産物は、好ましくは、少なくとも約９０％の純度に、より 好ましくは、少なくとも９５％の純度に、さらにより好ましくは、少なくとも９ ８％の純度になるように精製する。次に、この精製蛋白を、標準的な製薬法を用 いて、例えば、注入、キャリヤー結合性調剤等によって、悪性細胞に移送される ようにパッケージする。この精製蛋白は、治療的に有効な量を使用する。治療的 に有効な量は、本開示に基づいて、簡単に経験的に決めることができる。

次に、本発明を、下記の実施例を用いてさらに具体的に説明する。

患者細胞系、ＤＧ−８５−１４３６，ＧＭ４６１３から、染色体１１または転座 染色体を含む、体細胞ハイブリッドを分離した。ＤＧ８５−１４３６は、家族性 無虹彩を持つ患者から得た繊維芽細胞系であって、染色体１１．２２の細胞学的 にはバランスした転座を含む（ｔ（１１；２２）　（９１３；Ｒ１２，２））　 。Ｍｏｏｓｅ、ｅｌ　ｇｌ、、ｈｍ、Ｇｅｎｅｊ、、７２：　２９７−３０２　 （１９８６）。ＧＭ４６１３は、繊維芽細胞系であり（ヒト突然変異細胞保存施 設（８＋１０１１１１　Ｇｕｅｌｉｃ　Ｍｕｌ＊ｎｌ　Ｃｔｌｌ　Ｒｅ５ｐｏ＠ １ｌｏｒ７　）、Ｃｓｍｄｅｎ、ニューシャーシー）、染色体２．１１に関わる 、細胞学的にバランスした転座を示す（ｌ　（２；１１）　（ｐＨ；ｐ１３）） 。これは、ボッター症候群を呈する新生児から得たものである。Ｐｏｗｅｒ。

Ｉｎ　：　Ｎｏｒｍｘｌ　ｓｎｄ　Ａｂｎｏｒｍｓｌ　Ｄｔｗｚｌｏｐｍｅｎｌ 　ｏｆ　ｌｂｅ　Ｋｉｄｎｅ７．　ＹｅａｒＢｏｏｋ　ＭｅｄｉｃＩＩ　Ｐｕｂ ｌ、、　Ｃｂｉｅｌｇｏ、ＩＬ、、　ｐｐ、　３−７９．８３−１２３及び２５ ９−２８１　（１９７２）。体細胞ハイブリッドは、先に記載されたようにして 単離された。Ｇ１５ｓｅｒ、ｅｌ　１１．、　Ｎ５ｌｕｒｅ、３２１：　２８２ −８８７（１９８６）。これらハイブリッドの染色体１１の半数型を、染色体１ １の短腕と長腕の両方に対するＤＮＡプローブを使用して、ＲＦＬＰ分析で確定 した。最初のＤＧハイブリッドはすべてｄｅｒ　（ＩＩＬ　ｄｅｒ　（２２）及 び正常染色体１１を保持していた。細胞表面抗原研究によって、あるハイブリッ ドＤＧ−７Ａ−３の小集団は、ｄｅｒ　（２２）染色体しか持たないことが判明 した。ｄｅｒ　（２２）染色体しか持たない２種のハリブリッド、Ｒ１９−２Ｃ ，Ｒ１９−３Ｂを、ＤＧ−７＾−３集団から、細胞表面抗原選択法によって単離 した。これは、１１ｐ＋５のｍ５ｒ２表面抗原を保持しているものを選択し、か つ、１１ｐ１３の転座位置にたいして動原体側にあるＭＩＣＩ表面抗原を排除す るように選択することによった。ボッター患者の場合、ｄｅｒ　（ＩＩ）　（Ｈ Ｇ２−５）、　ｄｅｒ　２（ＢＹ＾２−５）、または、正常の染色体１１　（Ｂ Ｙ　８２−３１のみを保持するＧＭ４６Ｈハイブリッドが、ＰＦＬＰ分析によっ て特定された。

患者ＨＶは、家族性無虹彩を持っており、これは、染色体１１および４１（４； 　１１）　（ｑ２２；　ｐ１３）に関わる細胞学的にバラン・マウスハイブリッ ドＲ１９５は、ｄｅｒ　（１１）染色体を含み、Ｈｖハイブリッド、Ｌ）ＩＶ− １＾５は、ｄｅｒ　（４）染色体を含む。ＷＡＧＲ患者、ＪＨ，ＭＨｌＮＷから 得たハイブリッドについては既に記載された。Ｇｌｘｔｅｒ、　ｅｌ　ｍｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ、３２１：８８２−８８７（１９８６）。ウィルムス腫瘍患者Ｄ Ｒから得たヒト・マウスハイブリッド１５．１４ハイブリツドは、１Ｉｐ１３− ｐ１２という介在欠失を持つが（７ａｒｌｅａｕ。

ｅｌ　ｍｌ、、Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｌ、、６７：４５５−４５６　（１９８６） 　）　、その特性は既に明らかにされている。この細胞系のゲノムＤＮＡは、Ｃ １＊ｕｄｉｎｅＩｎｎｉｅｎ　（ＩＮＳＥＲＭ　、パリ）によって恵与された。

細胞系株ＷｉＴ−１３は、古典的三相組織構造を有する段階１１１のウィルムス 腫瘍の異種間移植培養から得た。腫瘍は、その他の点では健康な２才の女児に散 発的に発生したものである。Ｌｅｖｉｓ、　ｅｊ　ｘｉ、。

高分子量ＤＮＡを、１１・１１ハイブリツドから調製した。このハイブリッドは 、チャイニーズ・ハムスター・ヒト体細胞ハイブリッドで、ヒト染色体１１の短 腕しか有していない。

Ｋｇｏ、ｓｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎ１１ｌ、　Ａｃｔｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ、　７３：　１９３−１９７（１９７６）。このＤＮＡを用いて、ベクターｐ ＪＢ８　（ｌｓｈ−Ｈｏｒｏｖｍ。

ｅｌ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｉ　、、　９：　２９８９−２９ ９８（１９８１））及びｐＷｅｌｓ中のコスミド・ライブラリーを、Ｅマ１ｎｌ とＬｈｌの方法に従って構築した。Ｅｖｉｎｓ、ｅｌ　ｘｌ、、１Ｊｅｊｈｏｄ ｔ　ｉｎ　Ｅｎｔｙａ、、１５２：６０４−６１０（１９８７１，ＤＮＡは制限 酵素Ｍｂｏ　Ｉで部分的に消化し、５−２５％Ｎ５ＣＩ勾配を用いて、３５から ４５ｋｂのフラグメントを分離した。このＤＮＡを、ベクターＤＮＡに連結させ 、ファージとしてパックしくＧｉｇｘｐｓｃｋ　Ｇｏｌｄ、　Ｓｔｒ＊ｊｘｇｅ ｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）、これを、大腸菌株１０４ＧまたはＤＨ５に 感染させた。コロニーは、ＬＢ−アンピシリン平板に低濃度（１５０ｍｍプレー ト当り１．０００から２．０００個）でプレートした。

Ｍｓｎｉ＊ｊｉｓ、ｅｊ　ｓｌ、、Ｍｏ１ｅｃｏｌｘｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　＾ 　Ｌｓｂｏｔｔｔｏｒ７　Ｍｓｎａｘｌ。

Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉＢ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌｓｂｏｒｉｌｏｒ７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　’ｆｉｘｒｂｏｒ、ＮＹ標準スクリーニング法を実行した。これは 、ＭＩｉａ口＄、ｅ【１１、、（１９８２１１ｂｉｄの概説した通りである。レ プリカ・フィルターを、ヒト陽性に関してスクリーニングした。そのために、放 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７：１３９８−１４０２（１９８０））または、Ｃｏ１ｔ 　ヒト反復を多く含むＤＮＡ（Ｓｂｉｈ、ｅｔ　ｓｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　２９： ｆ＋１６−６１９　（１９８２））　とハイブリダイゼーションをさせた。月− １１ライブラリーのコロニーの内約０．５−１％がヒト陽性であることが判明し た。コスミドＤＮＡを、これらヒト陽性コロニーの各々について行なった小規模 の培養から、Ｍｌｌ＋目１ｉｓらの方法にしたがって単離した。

Ｍｘｎｔｘｌｉｓ、ｅＩ！１．、（１９８２）　１ｂｉｄ　０コスミドのＥｃｏ ＲＩ制限パターンは、標準アガロース・ゲル電気泳動によって分析した。

コスミドのマツピング ヒト染色体ｌｉｐの定められたセグメントを持つＪ１細胞ハイブリッドの、省略 形マツピング・パネルを、１１ｐ１３におけるヒト・コスミドを速やかに特定す るために用いた。ヒト・コスミドのマツピングは、放射性標識したＤＮＡを、ヒ ト反復列からの信号をできるだけ抑えるために、完全に１本鎖にしたヒトの、Ｅ ｃｏ　Ｒ１消化ＤＮＡのナイロン（ｚ６１１ｂｉｎｄ、八ＭＦ−Ｃｕｎｏ）フィ ルターとハイブリダイズさせて、行なった。

単一コピー配列の単離 単一コピー配列をコスミドから下記のようにサブクローンした。コスミドを、Ｓ ＊ｕ３Ａ　ｌで完全に消化し、生成したフラグメントを、プラスミドｐＵｃ１９ のＢｓｍ　ＩＩポリリンカ一部位にサブクローンした。挿入体を含むクローンを 、ニトロセルロース・フィルターにグリッド状に付着させ、単一コピー配列を持 つものを、反復の多い（Ｃｏ１１１ＤＮＡにたいするハイブリダイゼーシヨンの 欠如で特定した。さらに、ランダムな単一コピー・フラグメントを、低溶解度ア ガロースゲルスライスから分離した放射性標識を有する挿入体を、ヒトとλフア ージＤＮＡのニトロセルロースフィルターにハイブリダイズすることによってテ ストした。プローブ３７−１８９２．　３９−３ｐ４は、これらコスミドから特 定された単一コピー配列の中にあったものである。

ＤＮＡプローブの起源 ヒトコスミドＪ７−１８．　３８−３．　ＪＩＧ−１５は、Ｈ−１１／ｐＷｅ１ ５　ニアスミドライブラリ−から単離された。さらに４種のコスミド（Ｌｉ２Ｓ 。

Ｌｉ２Ｑ、Ｌ１５５−１．　ＬｉＯ２）が、ヒト　ｐＷｅ１５の全コスミドライ ブラリーから単離された（ＳｊｒｓｔＢｅｎｅ、ラホヤ（Ｌｓ　Ｊｏｌｌｙ）、 カリフォルニア州）。これには、プローブとして、ＷＴ３３　ｃＤＮＡの１．８ ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントを用いた。１１１１１３にたいする全ゴスミドの 位置決定は、体細胞マツピングによって証明された。ゲノム・プローブ３７−１ ８ｐ２．　１８−３ｐ４は、それぞれ、コスミドＪ７−１８、Ｊ８−３由来のｐ ｕｃｔ９における、０．５ｋｂ、１．３ｋｂ長の、単一コピーＥｃｏ　Ｒ１／旧 ｎｄｌｌｌフラグメントと特定された。ファージに１３は、Ｇａ５ｓ−Ｈｓｒｒ ｉｓ　ハイブリッド３＾のＢ＞ｍ旧完全消化物から構築したλダッシュ（Ｓｔｒ ｓｔｓｇｅｎｅ）ライブラリーから単離された。ＣＡＴプローブは、ｃＤＮ＾ク ローンｐＣ２４の０．６ｋｂＧｅａｅ１．、　３６：２４５　（１９８４）　、 　Ｆ　ＳＨＢプローブは、ｐｙｓｎ−ｔ、　４の２０５−２１２　（１９Ｂ７） 。

サザーン・プロット法 ゲノムＤＮＡの単離と消化、ＤＮＡのナイロン膜への移送、放射性標識プローブ のハイブリダイゼーシ確ン、フィルターの洗浄、オートラジオグラフィーは、Ｇ １５Ｉｅｒらの記述に従って行なった。Ｇｌ■ｅｒ、ｅｔ　Ｉｌ、、（１９８６ ）凹。ＤＮＡは、ランダムム・プライマー法にしたがって、３２Ｐ−ａｄＣＴＰ 　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ胎児腎臓、成人腎臓、前Ｂ細胞起源のヒトｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングした。Ｍｓｏｉ暑目１．ｅｌ　１１．、（１９８ ２）　１ｂｉｄ０各ライブラリーをスクリーニングするために、全数１０６個の ファージを、ＮＸＣ７Ｍアガロース・プレートにプレートし、各プレートにつき ２個のレプリカを、ニトロセルロース・フィルターで作成した。５ｃｈｌｅｉｃ ｂｅｒ及び５ｃｂｏｌｌ。このレプリカ・フィル液、中性化液、２ｘＳＣＣ（Ｉ ＸＳＣＣ−０，１５Ｍ　ＮｉＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で、それ ぞれ、５分間処理し、次に、真空オーブン中で、８０℃で、２時間乾燥させた。

レプリカ・フィルターは、保存しておいた単一コピー・プローブＪｌｌ−３ｐ４ または、ＷＴｃＤＮＡのサブフラグメントとハイブリダイズさせた。

ノーザン・プロット法 全ＲＮＡは、塩化リチウム／尿素法によって単離した。＾ａｎｒＢ、ｅｌ　ｔｌ 、、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、、１０７：３０３−３１４　（１９８０ ）　ｏ細胞を収穫し、ペレットにし、３Ｍ塩化リチウム／６Ｍ尿素に再懸濁し、 ４℃でホモジエネートした。ＲＮＡを沈澱させ、３Ｍ塩化リチウム／６Ｍ尿素で 洗浄し、沈澱させ、ＴＥ／ＳＤＳ中に再懸濁した。ＲＮＡは、フェノールクロロ ホルムで抽出しく２〜３Ｘ。

エタノールで沈澱させ、凍結乾燥し、再懸濁、定量後、−２０℃で保存した。１ ０−２０ＰｇのＲＮＡを、１％アガロース３７％ホルムアルデヒドＲＮＡゲル上 を移動させ、Ｇｅｎ６５ｃｒｅｅ　Ｐｌｕｌ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌｘｎｄ　Ｂｉｏ ｌｘｂｓ）膜上にプロットした。フィルターを、５０％ホルムアミド、５　ｘ　 Ｄｅｎｂｓ＋ｄｔｓ液、０．５％ＳＤＳ　Ｃドデシル硫酸ナトリウム）、１０９ ６硫酸デキストラン、０．１％ピクリン酸塩及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮ Ａの溶液中で、４２℃で２４時間、プレハイブリダイズ及びハイブリダイズした 。プロットは、保存ゲノム・プローブ３ｇ−３１４，ｃＤＮＡ２−１　（１，５ ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ／Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメント）　、ｃＤＮＡ２−１の０．５ｋ ｂ　Ｓ。

３ＩＩサブクローン、または、ｃＤＮＡ　ＷＴ３３の１．　８ｋｂ　Ｉ！ｃｏＲ Ｉフラグメントとハイブリダイズさせた。１８−３６時間のハイブリダイゼーシ ジン後、プロットは、２ｘｓｓｃ、ｏ、ｔ％ＳＤＳで３０分間室温で２度洗い、 １ｘｓｓｃ、　０．１％ＳＯＳで、３０分間５５−６０℃で１回から２回洗浄し た。

ＤＮＡ塩基配列の決定 ＤＮＡ塩基配列決定は、２重鎖ＤＮＡの鋳型を用いるチェーン停止法によって行 なった。Ｓａｇｅｒ、ｅｔ　ｓｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎｅｔ、Ａｃｔｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳ＾、　７４：５４６３−５４６７　（１９７７）　、　ＷＴ３３　ｃＤＮ Ａの制限フラグメントをｐＵｃ１９またはＢＩｗｅｓｃ＋ｉｐｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｌｌｕｄ　Ｂｉｏｌｓｂｓ）でサブクローンした。Ｂｌｏｅｓｃｒｉｐｌ用の直 接配列決定用プライマーは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ■ｄ　Ｂｉｏｌｓｂｔから入手し た。このｃＤＮＡに相当する、別のオリゴヌクレオチド・プライマー（Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ　Ｇｃ＋＋ｅ目ＣＳ。

Ｈｍｎｌｓマ１１ｅ、アリシナ州）も、このｃＤＮ＾配列決定に用いた。

さらに、他のｃＤＮＡ（ＷＴ２．　ＷＴ４．　ＷＴ２２）の領域についても、配 列を確認した。配列決定反応物は、６％、８％ポリアクリルアミド・ゲルで電気 泳動し、乾燥し、オートラジオグラフィーで調べた。Ｆｉｓｔ−Ｐアルゴリズム を用いた。Ｌｉｐｓ＋ｘｎ、ｅＩｓｌ、。

５ｅｔｅｎｃｅ　、２２７：１４３５−１４４１　（１９８５）　。ｃＤＮＡ　 Ｗ７３３　（７）予測アミノ酸配列を、国立生物医学研究所（Ｎａｌｉｏｎｓｌ 　Ｂｉｏｍｅｄｉｃｘｌ　Ｒｅｔｅｘｒｃｈ　Ｆｏｗｎｄｓｔｉｏｎ　）の蛋白 同定リソース（ｌｔｏｔｅｉａ　Ｉｄｅｎｌｉｌｅｃ＊目ｏｎ　Ｒｅｇｏ＊ｒｃ ｅ　）　（ＮＢＲＦ／ＦＩＲデータ・ベース）に保存されている蛋白配列と比較 した。

コスミド・ライブラリーは、ハイブリッド細胞系、Ｊｌ、−１１から構築した。

この系においては、染色体１１の短腕が、チャイニーズ・ハムスターをバックグ ラウンドとして、他のヒトゲノムから分離されていた。Ｋｓｏ、ｅｌ　ｘｉ、、 （１９７６）　１ｂｉｄ０　ヒトＤＮＡ配列を含む、全数１１９個のコスミド・ クローンが単離された。そのいずれも染色体１１の短腕にマツプされた。ＷＡＧ Ｒ領域内のクローンを特定するために、ヒト染色体１１ｐの各種フラグメントを 含む体細胞ハイブリッドのマツピング・パネルを用いた。Ｇｌｇｓｅｒ、ｅｌ　 ｇｌ、、（１９８９）　１ｂｉｄ。３個のコスミド、　ＪＴ−１８、ＪＨ−３， ＪＩＧ−１５が、ウィルムス腫瘍遺伝子を含む領域にもっとも近接していること が明らかになった。コスミドＪ−８，ＪＩＯ−１５の制限マツプは、かなりの重 複を示した。したがって、単一コピー配列（ＪＴ−１８ｐ２．　ＪＨ−３ｐ４　 ）をサブクローンし、それぞれ、コスミドＪ７−１８．　ＪＨ−３から特定した 。

１１、ｐ１３内における、これら単一コピーＤＮＡ配列の微細な位置については 、一連の体細胞ハイブリッドにたいするハイブリダイゼーションによって決定し た。このハイブリッドは、ＷＡＧＲ領域内部に特定の間隔を示す転座、欠失を有 する患者から得たものである。サブクローンＪ７−１８ｐ２．１ｇ−３ｐ４は、 無虹彩患者ＤＧから得たハイブリッド細胞からのＤＮＡとハイブリダイズさせた 。この患者は、バンド１１ｐ１３を分断する、細胞学的にはバランスした１１　 、２２転座を持っている。この転座は、この家系において、無虹彩とともに、数 世代受は継がれており、Ｍｏｏｒｅ。

ｅｌ　Ｉｆ、、（１９８６）　１ｂｉｄ、断点での小分子量の欠失と関連する。

Ｄｉｙｉｓ、ｅｔ　１１．、　（１９８８ｂ）　１ｂｉｄ、；　Ｇｅ５ｓｌｅｒ 、ｒｌ　ｇｌ、、　（１９８９ｂ）皿。プローブＪ７−１８ｐ２．　ＪＨ−３ｐ ４と相同的なヒトＤＮＡ配列は、細胞系Ｒ１９−２Ｃ，Ｒ１９−３８には存在し ないことが判明した。その細胞系は、派生的（ｄｅｒ）　（２２１染色体しか含 んでいなかった。

上記の結果と、この患者から得た線維芽細胞ＤＮＡ中の正常遺伝子量を考え合わ せると、ＪＴ−１８ｐ２．　ＪＨ−３ｐ４は、染色体１１のＤＧ転座断点の動原 体側にあることになる。同様の結果が、もう−人、先のとは無関係の患者（ＨＶ ）で、やはりｌ　１．　ｐ　Ｉ　３転座（表）を持つものからのハイブリッド細 胞についても得られた。

したがって、両コスミドは、ＡＮ２にたいして動原体側に、ウィルムス腫瘍遺伝 子座近傍にマツプされた。

患者ハイブリッドによる１１ｐ１３プローブのマツピング染色体１１　プローブ 表現型　患者ハイブリッド　内容　ＪＴ−１８ｐ１２３８−３ｐ４　ｃＤＮＡ無 虹彩　ＤＧ　Ｒ１９−２Ｃｄｅｒ　（２２）ＨＶ　Ｒ１９５ｄｅｒ［）　ＮＤ　 ＋　＋１（Ｖ　ＬＨＶ−１＾５　ｄｅｒ（４）泌尿器　ＢＹ　）１２−３　Ｎ１ （１１）　＋　＋　＋糸欠陥　ＢＷ　Ｇ２−５　ｄｅｒ　（１１）ＢＹ　Ａ２− ５　ｄｅｒ（２）　＋　＋　＋ＷＡＧＲＪＨＣ／ｈ　ｄｅｌ　（ｌｉｐ１４、１ −ｐＨ，２） ＮＷ　Ｆ３　ｄｅｌ（１１ｐ１３）　−−−ＭＪ　Ａ９　ｄｅｌ（１１ｐ１３） 　−−−ＷＴ　ＤＲ１５，１４ｄｅｌ（１１）Ｐ１３−ｐ１２）　”’　−（体 質性）　＋ ＷＴ　ＷｉＴ−１３Ｄ２　＆　Ｒ８７ｄｅｌ（１１）Ｐ△Ｓ）＋　−−（散発性 ）　ＷｉＴ−１３Ｒ９１ｔｅｌ　（１１）　＋１△Ｌ）−−−第２の患者（ＢＷ ）から得た体細胞ハイブリッドからのＤＮＡに、３７−１８ｐ２をハイブリダイ ズしたものを、３７−１８ｐ２及びＪ８−３ｐ４とハイブリダイズさせた。この 患者は、泌尿器に多発性欠陥（ボッター症候群）と、ｌ（２；１１）　（ｐＨ； ｐＨ）転座を持っていた（ＧＭ４６１３．　ヒト突然変位細胞保存施設、Ｃ＊ｍ ｄｅ＋＋、　ニュー　Ｅｌ−り州）。この転座の断点は、泌尿生殖異常の遺伝的 決定要素と思われる部位に特定された。Ｐｏｒｌｅｕｓ、　ｔｊ　ｓｌ、、（１ ９８７）凹。両プローブは、ｄｅｌ（２）染色体を含む細胞系Ａ２−５にはハイ ブリダイズするが、ｄｅｒ（１１）染色体を含む細胞系Ｇ２−５とはハイブリダ イズしない。したがって、両者は共に、無虹彩転座とボッター転座の両断点間に ある。この間隔は、ウイルムス腫瘍遺伝子を含んでいるのだから、この所見から 、ＪＴ−１８ｐ２．　Ｊ８−３ｐ４は、ウィルムス腫瘍遺伝子座の近傍、または 、その内部にあることは明かである。

ＷＡＧＲおよびウィルムス腫瘍患者（表）の染色体１１の欠失の分析から、これ らプローブの、ウイルムス腫瘍遺伝子にたいする位置をより厳密に知ることがで きた。ＪＴ−１８ｐ２．　Ｊ８−３ｐ４のいずれも、テストした３個の体質性Ｗ ＡＧＲ欠失（患者ＪＨ，ＭＪ。

ＮＷ）においては、ヘミ接合的に欠けていた。これは、ウイルムス腫瘍遺伝子座 のごく近傍にある、こ゛れらのＤＮＡ配列の位置と一致した。

ウィルムス腫瘍遺伝子座にたいする、３７−１８ｐ２．　１ｇ−３ｐ４の相対的 位置を、二人のウィルムス腫瘍患者由来の細胞系から得た、ＤＮＡにハイブリダ イズさせることにより、さらに研究した。

患者ＤＲは、１１ｐ１２−ｐ１３という体質性欠失を持つ患者であり、Ｃｏｕｉ ｌｌｉｎ、ｔｔｓｌ、、（１９８８）　１ｂｉｄ、この欠失部は、ウイルムス腫 瘍とＡＮ２部位（表）の間で終結している。ＪＴ−１８ｐ２は、患者ＤＲの欠失 染色体１１にあるのに、３ｇ−３１１４は無い。カタラーゼは、ＤＲに欠けてい るのだから、ＪＴ−１８ｐ２は、Ｊ８−３１１４にたいして末端小粒側にあるに 違いない。この二つのプローブ間の距離は、３４０ｋｂ未満である。ＤＲデータ から、次のことが判明する。患者ＷｉＴ−１３のウイルムス腫瘍を含むにちがい ない領域の末端側境界は、無芯のＤＮＡセグメント０１１５８７のホモ接合性欠 失から明かなように、腫瘍組織の重複する１１ｐ１３欠失を担ッテイることが以 前示されている（Ｌｅｗｉｓ、ｅｊ　ｓｌ、、（１９８Ｂ）ｉｂｉｄ）。ＪＴ− １８ｐ２はこの染色体にあり、１Ｂ−３９４は無いのであつのプローブの間に断 点を持っているのに違いない。１Ｂ−３ｐ４は、ΔＬ　（大）欠失染色体にも欠 けていることが判明したので、ＷｉＴ−１３において、ホモ接合的に欠失してい る。ウイルムス腫瘍遺伝子座の位置の中心側の限界は、ＷｉＴ−１３の△Ｌ欠失 の終点である。したがって、１ｇ−３ｐ４が、ＷｉＴ−１３において、ホモ接合 的に欠失している所見から、これは、ウイルムス腫瘍遺伝子座を含む１１ｐ１３ 領域にマツプされる。その間隔は、パルス式フィールド・ゲル電気泳動による分 析では、３４５ｋｂ以下である。上記所見をまとめたマツプを第２図に示す。

ｃＤＮＡクローンの単離 Ｊ８−３９４のマツプ位置から、このプローブが、ウイルムス腫瘍遺伝子座の近 傍にあるか、その内部にあることは明かであった。

二つの観察所見から、１ｇ−３ｐ４は、転写単位の一部を含むことが示唆された 。第一に、ハムスターおよびマウスＤＮＡゲノム配列にたいする強い、異種間ハ イブリダイゼーションが、１Ｂ−３ｐ４を有する体細胞ハイブリッドに観察され た（第１Ａ、１８図）。

異種間保存が、発現されたＤＮＡ配列に伴うことがしばしばある。第二に、１８ −３ｐ４は、ヒヒ腎臓及び膵臓から単離されたＲＮＡとのハイブリダイゼーショ ンを示した。１Ｂ−３１１４を、ヒト胎児腎臓（ＨＥ　Ｋ）細胞から得たｃＤＮ ＾ＤＮＡラリーのスクリーニングにプローブとして用いた。ノーザン・プロット 法の結果に基づいて、ヒト成人腎臓、ヒト前Ｂ細胞ライブラリーもスクリーニン グした。４つのｃＤＮ＾ＤＮＡンについて、二つはＨＥＫ由来のものであり（Ｗ Ｔ４．　ＷＴ２）　、一つはヒト成人腎臓から（ＷＴ２２）、一つは前Ｂ細胞か ら（ＷＴ３３）であるが、詳細に調べた。もう一つ、独立に単離した、保存ゲノ ムＤＮＡクローン、λに１３を用いて、五つ目の相同性ｃＤＮＡクローン（ＷＴ １３）もＨＥＫライブラリーから単離した。単離したもののうち、もつとも長い ｃＤＮ＾ＤＮＡン、ＷＴ３３は、長さが、２３１３塩基対である（第３図、４図 ）。ＷＴ３３　ｃＤＮＡは、５’　、３’　いずれの方向にももっとも長く延び ている。他の４つのｃＤＮＡは、ＤＮＡ配列の共通の内部領域を分かち持ってい る。その長さは、約１０００から１２００塩基対である。

ＷＴ３３　ｃＤＮＡの配列分析 ＷＴ３３　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、予測されるアミノ酸配列を得 た。ＷＴ３３　の配列から、３４５アミノ酸から成る、連続オープンリーディン グフレームが明らかにされた。このフレームは、ヌクレオチド１から１０３５に わたっている。ＷＴ３３ｃＤＮ＾を図式的に表わしたものを第３図に示す。この オーブンリーディングフレームは、　ＷＴ３３のコード・セグメントの大部分を 占めているが、イニシエーターであるメチオニン・コドンを含んではいない。プ ライマー拡張実験から、さらに２００ｂｐが、ＷＴ３３に対応するｍＲＮ人の５ °末端にあることが明らかにされた。すなわち、ＷＴ３３に対応する遺伝子座の 転写パターンである。これらのｃＤＮＡに対応する遺伝子座の転写パターンは多 少複雑である。ＲＮＡ　ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用した実験では、 ｍＲＮ人のコード領域の５′セグメントのｍＲＮＡ配列に変動のあることが明ら かにされた。このことから、各種組織タイプの間に、別々のスプライシングパタ ーンのあることが示唆された。

特に興味あるのは、ヌクレオチド６７０から１００２が、４個の相接する「ジン ク・フィンガー」領域をコードしていることである。ジンク・フィンガー・モチ ーフが最初に記載されたのは、ゼノブス（Ｘｅｎｏｐａｓ１丁Ｆ−１１１人にお いてであり、５Ｓ遺伝子の内部コントロール領域のＤＮＡに結合している。Ｍｉ ｌｌｅｒ、ｅｔジンクフィンガー領域を含むことが報告された。Ｋｌｏｇ、ｒ璽 Ｉ＋、。

ＴｌＢ５．　！２：４６４（１９８７）；Ｅｖｘｎｓ、　ｅｌ　＊１．、　Ｃｅ 具、　５２：ｉ３　（１９８８１゜ジンク・フィンガー配列モチーフは、２９か ら３０個のアミノ酸）ｔｌｋ　リ返り単位カラ成す（ｖ／Ｆ−ｘ−Ｃ−１２，− Ｃ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ、−ｔ−Ｘ　−Ｈ−Ｘ　−Ｔｌ−Ｘ　式中、Ｘはアミノ酸であ れば何でもよ２　３−４　６−７゜ い）、このアミノ酸は、一対のシスティンとヒスチジン間に亜鉛原子をキレート する領域の中に折たたまれる。Ｄｉｓｋｎｎ、ｅｔすべて、ジンク・フィンガー 共通配列に一致する。ジンク・フィンガー間＋７）Ｈ／Ｃ結合は、丁ＧＥ−Ｒ／ に−Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ｘなルアミノ酸配列に代表されるが、Ｓｕｂ、　ｅｌ　ｉｌ、 、Ｃｅ１ｌ、　４７：１０２５−１０３２　（１９８６）、これも、ＷＴ３３に ついて得られたアミノ酸配列に保存されていた。

ウィルムス腫瘍遺伝子産物の細菌発現 グルタチオン　Ｓ−トランスフエラーゼーウイルムス腫瘍融合蛋白を、ウィルム スのｃＤＮＡのフラグメントを、細菌発現ベクターｐＧＥ！−３１（Ｐｂａｒｍ ｉｃｉｘｌに挿入して、生成した。プラスミドＷＴ３３を、Ｂｌｌ　Ｈｌ　で消 化し、Ｋｌｅｎｏｖでプラントにし、つぎに、Ｐｓｒ　ＩＩで制限処理した。生 成したフラグメントを、停止コドンを含むＤＮＡリンカ−（ＭｃＧｉｌｔ大学、 生化学部）に結合させ、ｐＧＥＸ−３１のプラント処理したＢｌｌ　Ｈ１部位に サブクローンした。生成したプラスミド、ｐＧＥＸ／ｈ　Ｗ、　丁、　を大腸菌 株１１８４２に導入した。このプラスミドは、ウィルムス腫瘍蛋白の９７−２９ ５アミノ酸（番号は、第３図を参照）を含む融合蛋白を発現することができる。

融合蛋白の増殖誘発と分離は、メーカーの説明書にしたがって実行した。発現は 、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

ウィルムス腫瘍蛋白の９５−２９５アミノ酸を含むグルタチオン　ｓ−ｈランス フェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）ウイルムス腫瘍融合蛋白（ＧＳＴ−ＷＴ）をコードす るプラスミドが生成された。第９図は、このプラスミドが、〜５０　ｋＤｘの蛋 白を発現できることを示している。ｐＧＥＸと標識されたレーン１と３は、ベク ターによって発現される融合蛋白のＧ３７部分の発現を示している。この蛋白は 、溶解性に富み、グルタチオン・セファロース（ｐｈ＊ｒｉｘｃｉ＊　＄１７− ０７５６−０１　）に効率的に結合する。（レーン１と４は、上清であり、レー ン２と５は、ペレットであり、レーン３と６は、グルタチオンアフィニテイであ る）矢印は、約５０　ｋＤｘの融合蛋白の発現を示す。Ｇ３７部分だけの場合と 対照的に、ＧＳＴ−ＷＴ蛋白は、不溶性で、グルタチオン・セファロース・アフ イニティ・クロマトグラフィーでは精製されない。レーン３．６参照のこと。

等価対象物 本技術分野に熟練している人々であれば、はんの通例の実験法を用いるだけで、 ここに記載した発明の特定の実施態様について、たくさんの等価的対象物を理解 し、確かめることができるであろう。そのような等価的対象物は、本発明の範囲 内に含まれるものとする。

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Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト染色体１１バンドｐ１３のウィルムス腫瘍遺伝子座のヌクレオチドから 本質的に成る単離ＤＮＡ。
2. ２．サイズが約５０ｋｂである請求項１の単離ＤＮＡ。
3. ３．第３図のヌクレオチド配列の全部または一部を有する請求項１の単離ＤＮＡ 。
4. ４．単離したウィルムス腫瘍ＤＮＡ、またはその一部。
5. ５．ジンク・フィンガーを含むポリペプチドをコードする請求項４の単離ＤＮＡ 。
6. ６．ヌクレオチド配列が、第３図に示したヌクレオチド配列の全てまたはその一 部、または、実質的に相同なヌクレオチド配列である、ｌｌｐ１３ウィルムス腫 瘍遺伝子を含む単離ＤＮＡまたはその一部。
7. ７．約３ｋｂの分子量を有し、請求項１の単離ＤＮＡに結合する単離ｍＲＮＡ。
8. ８．請求項１のＤＮＡの全部、または、一部によってコードされるポリペプチド 。
9. ９．第３図に示したアミノ酸配列の少なくとも一部、または、実質的に相同なア ミノ酸配列から本質的に成る単離ポリペプチド。
10. １０．ウィルムス腫瘍ＤＮＡによってコードされるポリペプチドにたいして特異 的な抗体。
11. １１．請求項１０の抗体によって検出可能な実質的に純粋な蛋白。
12. １２．第３図のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドにたいして 特異的な抗体。
13. １３．ａ）細胞中に存在するＤＮＡを、相補性ＤＮＡとハイプリダイゼーション できるようにし、 ｂ）手順ａで形成されたＤＮＡを、ヒト染色体１１バンド１３のウィルムス腫瘍 遺伝子座の全部または一部にたいして相補的なヌクレオチド配列であるＤＮＡプ ローブと、相補的ヌクレオチド配列のハイプリダイゼーションが起こるのに適当 な条件下で接触させ、 ｃ）細胞中に存在するＤＮＡの、ＤＮＡプローブとのハイプリダイゼーションを 検出する（細胞中に存在するＤＮＡの、ＤＮＡプローブとのハイプリダイゼーシ ョンは、ウィルムス腫瘍ＤＮＡの存在を示す。） ことから成る細胞中のウィルムス腫瘍ＤＮＡの検出法。
14. １４．ＤＮＡプローブが検出可能なように標識されている請求項１３の方法。
15. １５．ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列が、第３図のヌクレオチド配列の全部 または一部である請求項１４の方法。
16. １６．ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列が、ジンク・フィンガーを含むポリペ プチドをコードする部分である請求項１５の方法。
17. １７．ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列が、第５図に示したＷＴ３３ジンク・ フィンガーの一つを含むペプチドをコードするヌクレオチド配列に対応する請求 項１４の方法。
18. １８．ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列が、プロリン／グルタミン富裕領域を コードするヌクレオチド配列の一部である請求項１４の方法。
19. １９．プロリン／グルタミン富裕領域が第４図に示したものである請求項１８の 方法。
20. ２０．ヒトから得た細胞または生物性液体を、ａ）細胞または液体を、ウィルム ス腫瘍ＤＮＡ、ウィルムス腫瘍ｍＲＮＡ、または、ウィルムス腫瘍遺伝子産物と 結合することができる少なくとも１個のプローブに接触させ、そして、ｂ）結合 が起こったかどうかを決める ことによって、変化のないウィルムス腫瘍遺伝子または遺伝子産物の有無につい てテストすることから成るヒトにおけるウィルムス腫瘍遺伝子の変化の検出法。
21. ２１．ヒトから得た細胞または生物性液体中の、ウィルムス腫瘍遺伝子産物の存 在を検出ないし定量するイムノアッセイであって、 ａ）細胞または液体を、ウィルムス腫瘍遺伝子産物に結合することのできる、少 なくとも１種の第１モノクロナール抗体と反応させ、 ｂ）手順（ａ）の産物を、第１抗体の結合するエピトープとは別のエピトープで 、ウィルムス腫瘍遺伝子と結合することができる、少なくとも１種の、検出でき るように標識された第２モノクロナール抗体と反応させ、 ｃ）手順（ｂ）の産物を検出または定量することから成る該イムノアッセイ。
22. ２２．免疫反応性フラグメントを用いる請求項２１のアッセイ。
23. ２３．検出可能な標識が、放射性同位元素、酸素、蛍光性、化学発光性及び電気 化学的物置から成る群から選ばれる請求項２１のアッセイ。
24. ２４．第２の抗体が、ビオチンと結合している請求項２１のアッセイ。
25. ２５．ヒト細胞中の、癌または前癌状態の有無を調べるアッセイ法であって、 ａ）ヒトから、あらかじめ定めた細胞または液体サンプルを取り、 ｂ）ヒトウィルムス腫瘍遺伝子または遺伝子産物にたいするプロープを、あらか じめ定めた細胞または液体サンプルに加え、ｃ）このプローブから、あらかじめ 定めた細胞サンプルの中のウィルムス腫瘍遺伝子の機能部分に変化または欠失が あるかどうかを決める（ウィルムス腫瘍遺伝子または遺伝子産物の変化または欠 失は、癌または前癌状態を示す。）ことから成る該アッセイ法。
26. ２６．プローブがヌクレオチド・プローブである請求項２５の方法。
27. ２７．プローブが、欠失があるかどうかを決めるのに使用される請求項２５の方 法。
28. ２８．プローブが、ウィルムス腫瘍遺伝子を含む染色体における欠失に関するプ ローブである請求項２５の方法。
29. ２９．プローブが、第３図で示したウィルムス腫瘍遺伝子からの少なくとも２０ 個のヌクレオチドに対応する請求項２８の方法。
30. ３０．欠失があるかどうかを決める方法が、ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む 請求項２９の方法。
31. ３１．プローブが抗体プローブである請求項２５の方法。
32. ３２．治療的に有効な量のウィルムス遺伝子産物を、疾患細胞に加えることから 成る、ウィルムス腫瘍遺伝子の変化または欠失で引き起こされた癌または前癌状 態の治療法。
33. ３３．治療的に有効な量のウィルムス遺伝子産物を、機能的ウィルムス腫瘍遺伝 子を含むレトロウイルスベクターを用いる遺伝子移送技術によって、疾患細胞に 加える請求項３２の方法。
34. ３４．ａ）機能的なヒトウィルムス腫瘍遺伝子、または、その機能的なフラグメ ントに対応する、ウィルムス腫瘍サプレッサー活性を持つ蛋白を発現させるのに 十分な数のヌクレオチド（当該ベクターは、ヒト全染色体を含まない。）及び、 ｂ）このヌクレオチドセグメントの上流にあるプロモーターを含むヌクレオチド セグメントを含むベクター。
35. ３５．ヌクレオチドセグメントが、第３図に示した配列と実質的に対応する請求 項３４のベクター。
36. ３６．プロモーターがウィルス性プロモーターであり、ベクターが、エンハンサ ーとポリアデニル化配列も含んでいる請求項３４のベクター。
37. ３７．ａ）細胞中に存在するＤＮＡを、相補性ＤＮＡとハイプリダイゼーション できるようにし、 ｂ）手順（ａ）で形成されたＤＮＡを、ヒト染色体１１バンド１３のウィルムス 腫瘍部位の全部または一部にたいして相補的なヌクレオチド配列である、検出可 能なように標識されたＤＮＡプローブと、生じる相補的ヌクレオチド配列のハイ プリダイゼーションと、ウィルムス腫瘍ＤＮＡ／検出可能標識ＤＮＡプロープ複 合体の形成に適切な条件下で接触させ、ｃ）ウィルムス腫瘍ＤＮＡ／検出可能標 識ＤＮＡプローブ複合体の量を測定する ことから成る細胞中のウィルムス腫瘍ＤＮＡの定量法。
38. ３８．第３図のヌクレオチド配列、または、その一部と対応する請求項３７の方 法で用いるＤＮＡプローブ。
39. ３９．第３図のヌクレオチド配列、または、その一部から本質的に成る請求項３ ７の方法で用いるＤＮＡプローブ。
40. ４０．個体から得たサンプル中の、ウィルムス腫瘍遺伝子がコードするポリペプ チドの検出法であって、ａ）サンプルを、第３図のアミノ酸配列の全部または一 部を有するポリペプチドにたいして特異的な、少なくとも１種の抗体と、ウィル ムス腫瘍遺伝子がコードするポリペプチドと抗体の結合、及び、ウィルムス腫瘍 遺伝子コードポリペプチド／抗体複合体の形成に、適切な条件下で混合させ、ｂ ）ウィルムス腫瘍遺伝子コードポリペプチド／抗体複合体を検出する ことから成る該検出法。
41. ４１．さらに、ウィルムス腫瘍遺伝子コードポリペプチド／抗体複合体を、上記 複合体中に存在する、検出可能に標識された抗体の量を測定することによって定 量することを含む請求項４０の方法。
42. ４２．ａ）ウィルムス腫瘍ＤＮＡの全部または一部にたいして相補的なヌクレオ チド配列であるＤＮＡプローブ、及び、ｂ）容器 を含む、細胞中のウィルムス腫瘍ＤＮＡを検出するためのキット。
43. ４３．ａ）第３図のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドにたい して特異的な単離抗体、及び、ｂ）容器 を含む、細胞中の、ウィルムス腫瘍遺伝子がコードするポリペプチドを検出する ためのキット。
44. ４４．モノクロナール抗体である請求項１０の抗体。
45. ４５．モノクロナール抗体である請求項１２の抗体。