JPH04502814A - 新規な免疫診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な免疫診断法 柄杓に神経嚢虫症（ＮＣＣ）と呼ばれている重篤な神経症状を招来することがあ る。その嚢胞の頭蓋内存在部位によって、しばしば以下の臨床的表出が認められ る。

部位　臨床症状　後遺症 脳実質　てんかん 局在性病変（ＳＱＬ）　運動および感覚欠陥精神病 脳炎 髄　膜　慢性髄炎　水頭症 脳神経麻痺 運動および感覚欠陥 脳室ＳＱＬ ここに記載した臨床症状はすべて、多くの病因因子によって起こるものであり、 神経嚢虫症の診断には、神経系の結核菌感染症との鑑別診断が常に必要になる。

この疾患の診断は、頭蓋の放射線検査に基づいて行われる。

壊死石灰沈着嚢胞は頭蓋のＸ線写真に濃い放射線不透過性病変として認められ、 一方、生存嚢胞は、コンピューター断層撮影法（ＣＡＴ−３ＣＡＮ）で、淡いま たは濃い病変として認められる。最近、中枢神経系（ＣＮＳ）の磁気共鳴映像法 （ＭＲＩ）が生存嚢胞の可視化に応用されている。これらのいずれの造影操作に よっても、嚢胞の同定は大部分、嚢胞の大きさおよび周囲の宿主組織の反応に依 存する。

この疾患が流行している多くの開発途上国では、造影設備は容易に入手できるも のではなく、そのために別の、もっと簡単な診断方法の必要に迫られている。す なわち、神経嚢虫症を他の神経疾患から識別できる免疫診断試験がめられている 。現存する免疫試験の大部分は、同定される生物体の抗原に対する抗体の検出を 目的とするものである。しかも、多くの試験は疫学的調査に使用される血清診断 試験として開発され、これらの現存する試験は、神経嚢虫症に全く特異的な診断 のために設計されたものではなかった。

試験の特異性および感度は、大部分、試験に用いられる抗原に依存する。本発明 は、免疫診断に特異性と感度を付与するＣｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓ　ｃｅｌｌｕｌ ｏｓａｅの抗原の製造方法に関する。

抗原製造および免疫診断における従来技術Ｔ、５ｏＮｕＵａの幼虫の粗抽出液は 、嚢胞の全ホモジネート（１）、または嚢胞の固体部分すなわち嚢胞壁および頭 部または嚢胞壁単独のホモジネート（２）として製造された。場合によっては、 嚢胞液も抗原として使用された（３）。ホモジネートは通常、遠心分離に付され 、１５．０００〜２０．０００ｘ　ｑ、１５〜３０分間で、細胞層、核等が除去 された。全ホモジネートをアセトンで抽出し、大部分の脂質を除去して、補体結 合試験に使用された（４）。粗または全抗原は、多くの種類のイムノアッセイ、 たとえば受身血球凝集試験（５および３）、免疫電気泳動（１）および固相酵素 免疫測定法（ＥＬＩＳ＾、１．６および７）に使用された。

嚢胞の全ホモジネートを用いて、Ｋｕｈｎら（８）はＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ＾を実施し 、試験の感度は、その蛋白質中の一群の抗原によって決まると述べている。しか しながら、これらの抗原については精製もしていないし、それらの特異性も試験 していない。全ホモジネートは、ウェスタンブロッティングで可視化され、免疫 原として同定される蛋白質に加えて、抗原性脂質および炭水化物を含んでいる。

ＥＬＩＳ＾の総感受性に対する非蛋白性抗原の寄与は確認されなかった。フィブ ロネクチンの性質を示す抗原Ｂとして同定された単一の抗原がＥＬＩＳ＾に使用 されたが、感度は満足すべきものではなかった（９）。

寄生体の全ホモジネートには免疫診断の抗原としてはいくつかの欠点がある。（ ｉ）それは、他のＣＮＳ病原（下記参照）と免疫学的交差反応性を有する数種の エピトープを含有する。（ｔｉ）　いくつかの寄生蛎虫は交差反応性抗原をもつ ことが明らかにされている（１０）。開発途上国、たとえばインド、メキシコ、 ブラジル、中国、タイならびに中米およびアジアの諸国では、国民間の寄生虫の 侵襲は珍らしくないことが多く、かなりの数の国民に交差反応性抗原に対する血 清抗体が潜在している。このような個体が血液脳関門を破壊する疾患に冒されて いる場合、血清抗体は脳を髄液（Ｃ３Ｆ）中に入って置去症の診断を妨害し、偽 陽性の結果を与えることがある。

全ホモジネートの特異性の欠如に鑑み、種および組織特異的抗原、すなわち頭部 および嚢胞液由来の抗原を同定し、精製する試みが行われた。見掛けの分子量約 ２６．０００および約８．０００の２種のポリペプチドがＴａｅｎｉａプロット において反応し、他の嬬虫侵襲を有する患者の血清とは反応しなかった（１１） 。これらの抗原の感度または他の関連ＣＮＳ障害に関する特異性はまだ確証され ていない。嚢胞液の総蛋白質に対して産生させたモノクローナル抗体を用いて嚢 胞液から精製した抗原は、免疫診断にきわめて特異的であることは証明されたが 、ＮＣＣの検出に有用であるために要求される感度を欠いていた（１２）。

モノクローナル抗体を用いて精製した見掛けの分子量約ｇｏ、　ｏｏｏおよび約 ｉｏ、　ｏｏｏの頭部特異的蛋白質は、置去症の血清診断に１００％の感度を示 した。これらの抗原は条虫症と置去症の識別に有用であったと述べられている。

神経置去症と他の全身性置去症の識別におけるその有用性は試験されなかった（ １３）。

全ホモジネートを抗原として用いることの欠点は、発明者らの実験室で行われた 試験によってさらに説明することができた（１４）。この試験を以下に要約する 。

嚢胞をホモジナイズし、超音波処理した（８Ｘ３０秒パルス）。１％ＳＯ３中に 可溶化し、１％β−メルカプトエタノールにより１００℃で処理したホモジネー トを、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００カラム上でゲル濾過に付し、３つの分画 に分割した。

分画Ｉ：嚢胞抗原、分子量〉６６にダルトン分画■：嚢胞抗原、分子量：２５に 〜６６にダルトン分画■：嚢胞抗原、分子量：　１４に〜３５にダルトン（図１ ） 図１の説明ニゲル濾過で得られた３つのピーク分画を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上 で分析した。レーン１：第３のピーク、レーン２：第２のピーク、レーン３：第 １のピーク、レーン４：分子量マーカー（９４，６７，４３，３０，２０，１お よび１４、Ｉ　ＫＤａ）。３つの分画の分子量範囲は本文に示す。

置去抗原の上記３分画を用いたＥＬＩＳ＾は次の方法で実施した。

様々な神経疾患患者から無作為に集めた１５０例のＣ３Ｆを、これらの３種の分 画に対して試験した。抗原を、Ｄｙｎａｔｅｃｈの９６ウエルマイクロタイター プレート上に、５０ｆｆｌ關重炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中５　ｎ／貢Ａ’　（１ ０ｈｌ／ウエル）の濃度で一夜コーティングし、２％ＢＳ＾でクエンチングし、 Ｃ３Ｆをｌ／２５．１／１２５および１／６２５希釈で試験した。結合ヒトＩｇ Ｇは、ウサギ抗−ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ接合体（Ｓｉｇｍａ、１　：　１ ０００希釈）を用いて検出した。クロモーゲンとしてはオルトフェニレンジアミ ンを、基質としては０．３％Ｈ２Ｏ２を使用した。

これらの１５０例のサンプルの結果を表１にまとめる。

このデータから以下の結論が導かれた。

試験は、青虫症のすべてを認識するのに十分な感度を示したが、最大の偽陽性結 果が結核性髄膜炎の症例にみられた。したがって、この試験は、両疾患が流行し ている地域では有用でない。

結核性髄膜炎ＣＳＦの嚢胞抗原との反応は、結核菌抗原と嚢胞抗原の間の交差反 応性によることが明らかにされた。

１、　結核菌超音波処理物は青虫症陽性Ｃ３Ｆの嚢胞抗原への結合を阻害したが 、この反応を完全に消失させることはなかった。

２、　この阻害はマイコバクテリア抗原の濃度の上昇に応じて増大した。

３、　マイコバクテリア超音波処理物に対して産生されたウサギ抗血清は嚢胞抗 原と反応した。

以上の観察は、粗製抗原が実際、他のＣＮＳ病原体と交差反応するエピトープを 含むことを示した。

嚢尾虫は多細胞生物であり、単細胞動物とは異なり、マクロファージや顆粒球ま たは他の抗原提示細胞によって、禽食または処理を受けることがない。したがっ て、ヒト免疫系は寄生虫のすべての蛋白質で感作されることは稀で、とくにＣＮ Ｓのように免疫学的に特別扱いされた区画ではそれが著しい。それ故、これらの 寄生虫によって宿主の体液中に排泄もしくは分泌または流出される抗原（Ｅ−３ 抗原と命名）が免疫学的にきわめて重要になってくる。多くの寄生性嬬虫のＥ− ３抗原が、様々な生育段階の嬬虫をｉｎ　ｖｉｔｒｏで組織培養培地中に維持し 、生育培地から抗原を精製することによって得られた（１５）。有鉤置去もｉｎ 　ｖｉｔｒｏで血清および組織抽出液とともに維持された（１６）。これらの寄 生虫を短時間、ダルベツコの最小必須培地（ＤＩＩＥＭ）またはリン酸緩衝食塩 溶液（ＰＢＳ）中に保持し、これらの寄生虫をＩ４０アミノ酸で標識した所、こ れらは代謝的に活性であることが明らかにされた（１７）。

しかしながら、培地中には、わずかに無視できる程度の量の放射標識蛋白質しか 検出されなかった。これらの抗原の免疫診断への利用性は全く検討されなかった 。

て得られる。この寄生虫のＥ−３抗原は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける嚢胞代謝過程 の一部として嚢胞から出てくる抗原にきわめて類似するという前提に基づくもの である。すなわち、それらの抗原は、患者の体液たとえばＣ３Ｆおよび血清中の 抗体を検出するべく設計された免疫診断試験に特異性および感受性を付与するこ とができる。同一の抗原またはこれらの抗原の部分分解生成物を患者のＣＳＦ中 に見出すことができる。これが、抗原の検出に基づく免疫診断の設計の基盤とな る。Ｅ−３抗原に対するポリクローナル単一特異性またはモノクローナル抗体の 開発が可能であり、ついでこれが抗原検出試験等に使用できると理解される。こ れらの抗原の一部は宿主に対して保護免疫を付与できるので、これらの抗原は有 鉤置去による感染を中和するワクチンの開発に使用できる。

本発明は、長期間にわたって、血清を含まない細胞培養培地中に有鉤置去を維持 し、その培地中にこの寄生虫によって生成される抗原を、患者のＣ３ＦとＥ−３ 抗原の相互作用が関与するＮＣＣの免疫診断に使用する新規な方法を提供するも のである。ここでとくに強調されることは、他の型の全身性青虫症に妨害される ことな（、ＮＣＣの同定に抗原を用いることである。上述の新規な診断方法は人 の食用の豚の有鉤置去感染の診断にも有用である。

嚢胞の起源および維持： 嚢尾虫に感染している豚筋肉は屠殺場から得られる。

豚筋肉をエタノールで拭いて表面上の夾雑物を除去する。

嚢胞を、嚢胞壁を破裂させないように無傷で切り取り（破裂した嚢胞は捨てる） 、ペニシリンＧ　１０００単位／ＩＩｌ、ゲンタマイシン４０Ｈ／ｍｌおよびア ンホテリシンＢ５＋ｎ／ＩＩｌを含有する食塩水中に入れる。嚢胞を上述の抗生 物質を含む滅菌食塩水で完全に洗浄する。これらをついで血清を含まない培地Ｒ Ｐｉｌｌ　１６４０またはアール塩もしくはバンク塩を含むイーグル最少必須培 地（ＭＥＭ）で洗浄する。

嚢胞を、ペニシリンＧ　１０００単位／ｍｌおよびゲンタマイシ：／　４０ｕｑ ／ｍｅを含むＲＰＭＩ　１６４０まタハイークルＩＩＥＭ培地に３７℃、５％Ｃ ０２と共に入れる。

Ｅ−３抗原の収集： 培地は最初の２４〜６０時間は少なくとも２回交換して捨てて、宿主成分を完全 に確実に除去する。培地を最初の４８時間に２回置換するのが適当である。つい で、培地を、嚢胞が膨出を始めるまで、一定間隔で収集する。実際上の理由から 、培地は２４時間毎に収集するのが適当である。

嚢胞の生存度は倒立顕微鏡下に観察できる嚢胞壁の収縮によってモニタリングさ れる。膨出は６日目以降から観察される。培地の収集後、直ちに１０４．０００ 　Ｘ　９で６０分間遠心分離して、不溶性の細胞層および膜夾雑物があれば除去 する。上澄液にパラメチルスルホニルフルオリド（２１Ｍ）、パラクロロ水銀ベ ンゾエート（０，０６％）および硫酸アンモニウムを飽和９０％まで加え、溶液 のｐ■を７〜７．４に維持する。４℃で沈殿させ、ついで沈殿を１５．０００× ９．４℃で３０分間遠心分離して収集する。沈殿を５０＋ａＭリン酸ナトリウム 緩衝液ｐＨ７，４に溶解し、同一の緩衝液に対し、数回交換を行って、４８時間 外延的に透析する。

別法として、膜分画は本技術分野における他の既知方法たとえば膜濾過で除去す ることもできる。同様に、抗原は他の方法、たとえば限外濾過で単離することも できる。溶液のＵＶスペクトルは２７８〜２８０ｎ閣に最大吸収を示す。

５ｃｈａｆｆｎｅｒ　＆　ｆｅｉｓｓｍａｎ（１８）の操作で評価した蛋白質は 、嚢胞を寄生虫濃度１５嚢胞／ｌＩｌに維持した場合、２５〜３５＋ｎ蛋白質／ 嚢胞／２４時間である。

この蛋白質を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（５Ｏ３− ＰＡＧＥ）後、クーマツシーブルーＲ染色した結果を図２に示す。

図２の説明＝７．５〜１５％勾配５Ｏ５−ＰＡＧＥ上で分析したＥ−３蛋白質の クーマツシーブルー染色、レーン１：高分子分子量マーカー（１１６，９７，４ ，６６，４５および２９　ＫＤａ）　、レーン２および３：２個の独立したプレ バレージョンにおける硫酸アンモニウム沈殿Ｅ−３蛋白質、レーン４：低分子分 子量マーカー（９４，６７，４３，３０，２０，１および１４．４ＫＤａ）。

認められた主要な蛋白質バンドは、見掛けの分子量約９７０００．６６０００． ５００００．３８０００．２８０００ダルトンのものと、見掛けの分子量が１０ ０００〜１４０００ダルトンの範囲の、分割されない蛋白質混合物であった。

Ｅ−３蛋白質の新たな合成の証明： 培地中での最初の４８時間後の嚢胞を、！１１８−メチオニン４０μＣｉ／嚢胞 を含有するメチオニン欠乏培地に移した。嚢胞と培地に様々な時点で採取した。

嚢胞を嚢胞壁とＨ＃に切り分はホモジナイズした。ホモジネートを１２％５ＤＳ −ＰＡＧＥ上で分析し、フルオログラフィーに付した。

培地はアセトンで沈殿させて１２％５Ｏ３−ＰＡＧＥ上で分析し、フルオログラ フィーに付した。５ｓＳ−メチオニンの能動取り込みは、嚢胞壁および頭部蛋白 質の両者に認められた。

４８時間までに数種の蛋白質が培地中に出現した（図３）。

図３の説明：３５Ｓ−メチオニンで櫟識された排泄／分泌蛋白質のオートラジオ グラム。３個の嚢胞をそれぞれ４ＱｇＣｉの３５３−メチオニンを含有する培地 １ａｌ中で別個に４８時間インキュベートした。培地を集めて超遠心に付し、上 澄液をアセトンで沈殿させた。各レーンは単一の嚢胞からの蛋白質を示している 。

図３から明らかなように、数種の蛋白質が、寄生虫の代謝活性の一部として合成 され、培地中に排泄／分泌さ嚢胞を、血清を含まない培地中ｉｎ　ｖｉｔｒｏで 維持すると代謝回転の一部として、蛋白質抗原が、排泄もしくは分泌過程のいず れかによって、培地中に出現する。頭部の膨出前に集めたこれらの抗原は、幼生 期の抗原である。

これらの抗原、それらの製造方法、ＮＣＣの診断および可能性の予知への使用、 ならびに有鉤置去の感染に対するワクチンの製造を意図したそれらの使用が請求 される。

ここに述べた診断方法はまた、人の食用の豚の嚢尾虫症の診断にも使用できる。

たとえば、ポリエチレングリコールによる連結、他の蛋白質もしくは二官能性試 薬との架橋、またはプロテアーゼによる消化のような修飾形態も包含される。本 発明はまた、診断すべき患者からのＣ３Ｆを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで維持された有 鉤置去の（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した見掛けの分子量が約９６．０００もしく は６６、０００もしくは５０．０００もしくは３８、０００ダルトンである）排 泄もしくは分泌抗原の少なくとも１種またはそれらの抗原の混合物と相互作用さ せることからなる活動型ヒトＮＣＣの診断方法に関する。

実施例： 実施例１および２は、様々な神経疾患を有する患者のＣ３Ｆ中の抗嚢尾虫抗体を 検出するためのＥＬＴＳＡ系における、これらの抗原の利用に関する。実施例３ および４は、患者Ｃ３Ｆを用いた免疫沈殿に際しての分子量による、さらに重要 な抗原の同定に関するものである。

実施例　１： 開示の項の記載に従って収集した排泄／分泌蛋白質を、Ｄｙｎａｔｅｃｈの剛性 ９６ウエルマイクロタイタープレート上に、５Ｊ９蛋白質／薦１　（１００βｌ ／ウエル）の濃度で、−夜、室温においてコーティングさせる。プレートの残っ た蛋白質結合部位は、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）を用いてクエ ンチングした。０，０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳＴ ）中にＣ３Ｆを１／２５、ｉ　／　１２５および１／６２５に希釈し、３７℃で ２時間インキュベートした。インキュベーンコン後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗 浄した。ＰＢＳＴ中１＝１０００に希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダー ゼ接合体を１００μｌ／ウエルの容量で使用し、３７℃で２時間インキュベート し、ついでウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。結合した接合体は、クロモーゲン としてオルトフェニレンジアミン（４ｍｙ／　１（１＋／）および基質として■ ２０２を用いて２０分間発色させた。５０ｔｒｌの４Ｎ　ｌ（、ＳＯ２を加えて 反応を停止させ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ７００ＥＬＩＳ＾リーダーにより４９ ０ｒｖの吸収を測定した。Ｃ３Ｆ　］／１００希釈における０、１０を越える吸 収値は陽性とみなした。

表２に結果を示す。

上表は、この抗原が粗抗原より優れていて、免疫学的反応に対して特異性を有す ることを示している。

実施例　２ この実施例は、排泄−分泌抗原の診断的価値の二重盲検試験を記載する。試験を 実施する研究者の偏見を除去する試験計画になっている。

診断が確認されている様々な神経疾患の患者から得られた３７例のＣ３Ｆサンプ ルに、発明者以外の中立の監視者が１から３７までの一連番号を付した。サンプ ルの一部を取り３セツトを作成した。発明者の二個所の独立した実験室にＣ５Ｆ サンプルを送り、各実験室で２名、すなわち計４名の試験者が独立に、実施例１ に詳述したＥＬＴＳ＾を実施した。４名の全試験者が結果を表にし、その結果を 中立の監視者に連絡した。４名の全試験者の結果は一致していた。これを表３に 示す。

神経青虫症　３３ を髄麻酔（正常対照）８０ 術後髄膜炎（培養で証明）５０ 日本脳炎　７０ 化膿性髄膜炎（肺炎球菌）３０ クリプトコックス髄膜炎（培養で証明）１０結核性髄膜炎（培養で証明）２０ 胸髄圧迫　２０ 頭蓋を椎接合部異常　１０ 椎間板脱出　１０ 運動神経疾患　１０ 失調性ニユーロパシー　１０ 片麻痺　１０ 仮球性軽症麻痺　１０ 上述の結果は、排泄−分泌抗原が、患者のＣ３Ｆ中の抗体を検出するために設計 された診断試験に１００％の感度と１００％の特異的を付与できることを示して いる。

実施例　３ 本発明の記載に従って得られた排泄／分泌抗原を、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を用いてＩ 　２ＳＪで標識した。標識蛋白質を、既知の神経青虫症、結核性髄膜炎および他 の各種神経障害からのＣ３Ｆとインキュベートした。免疫複合体をウサギ抗ヒト ＩｇＧ、キャリヤーヒトＩｇＧで沈殿させ、全溶液を２．５％ポリエチレングリ コールとした。沈殿を７．５％〜１５％の勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、こ れをオートラジオグラフィーに付した（図４）。

図４の説明、＋２５１標識排泄／分泌蛋白質の患者Ｃ３Ｆとの免疫沈殿のオート ラジオグラム。■＝３希釈Ｃ３Ｆ（３ｈＩ）をＥ−３蛋白質（３Ｘ　１０ｃｐｍ ）とインキュベートし、本文中に記載したようにして免疫複合体を沈殿させた。

レーン１：対照、Ｃ３Ｆなし：レーン２．３および４：神経青虫症のＣ３Ｆ　、 レーン５：結核性髄膜炎；レーン６．７および８：他の神経障害。

見掛けの分子量約９７ｋＤａ、　６６ｋＤａ、　５０ｋＤａおよび３３ｋＤａの 蛋白質が明らかに免疫沈殿中に取り込まれた。

実施例　４ ３５８−メチオニン含有メチオニン欠乏培地中ｉｎ　ｖｉｔｒ。

で嚢胞を維持することによって５ｓ３−メチオニンで標識したＥ−３蛋白質を、 実施例２に記載したようにしてＣＳＦ抗体で免疫沈殿させた。免疫沈殿の５Ｏ３ −Ｐ＾６Ｅのフルオログラフィーを図５に示す。

図５の説明：各種神経障害患者のＣ３Ｆで免疫沈殿した３５Ｓ−標識Ｅ−３蛋白 質のオートラジオグラム。レーン９および５はＮＣＣ患者のＣ３Ｆからの免疫沈 殿である。例３の場合と同様、９７．６６および５ＱｋＤａ蛋白質がこの場合も 免疫沈殿される。

見掛けの分子１１９７０００の抗原の特性：■１部分核酸配列 有鉤置去の全ポリＡ＋ＲＮ＾から、ラムダｇｔ、１１　ｃＤＮＡライブラリーを 構築した（１９）。マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓ−ｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏ ｎｉ）から精製したパラミオシンに対して産生させた過免疫ウサギ血清を用いて 、約２．５ｋｂのｃＤＮＡクローンを同定し、単離した。二重鎖ＤＮＡ配列決定 （２０）により、以下の配列が得られた。

］、ＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＸＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＡＣＡＴＡＴＧ ＴＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＣＴ ＡＧＣ＾＾ＧＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧＴＣＡＣ ２、ＴＧＡＧＴＡＣＧＴＣＸＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＡＧ ＴＴＣＴＧＴＣＧＴＸＧＡＴＣＡＣＴＡＡＣＴＴ＾ＡＴＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧ ＸＡＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＴＡＴ ■１部分アミノ酸配列 見掛けの分子量９７０００の抗原を、Ｅ−３抗原の電気泳動を行ったクーマツシ ープルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから電気溶出した（２１）。電気溶 出された蛋白質を溶媒沈殿させてＳＤＳを除去した。ついで蛋白質をＴＰＣＫ処 理ト処理トリマノンした。トリプシンベブチドを、溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦ＾ ）で平衡化したＲＰ３００　（Ｃ８）カラム（０４６Ｘ　２５ｃｍ＋）上におい て分離した。このペプチドを０〜６５％の溶媒Ｂ　（０，０８５％ＴＦＡ含有７ ０％アセトニトリル）の直線勾配により４０分で溶出した。ペプチド含有分画を 真空中で蒸発乾固した。これらのペプチドを配列決定に使用した。

表　４ ＶＫＬＤＳＡＫ　Ｔ　１４ ＡＴＱＴＥＶＷＲＴ　１９ ＶＹＳＴＳＴＫ　Ｔ　１６ ＹＡＦＬ−ＡＳＶＴ−３ＲＴ　２１ ＳＬＬＤＦＲ３ＴＲＴ　１１ 参考文献 １、Ｅｓｐｉｎｏｚａ、　Ｂ、ら：　（１９８２）、Ａ、　Ｆｌｉｓｓｅｒら編 、Ｃｙｓｔｉ−ｃｅｒｃｏｓｉｓ　Ｐｒｅｓｅｎｔ　５ｔａｔｅ　ｏｆ　ｋｎｏ ｗｌｅｄｇｅ　ａｎｄ　ｐｅｒｓｐｃｃ−ｔｉｖｅｓ　１６３−１７０＾ｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ０２、Ｒｏｓａｓ、　Ｎ、ら　（１ ９８６）＾ｒｃｈ、　Ｎｅｕｒｏｌ、、　４３．３５３−３５６゜ ３、Ｌａｒｒａｉｄｅ、　Ｃ，ら：　（１，９８６）八ｍ、Ｊ、　Ｔｒｏｐ、　 Ｍｅｄ、　Ｉｌｙｇ、。

５、Ｐｏｖｅｌ、Ｉ、　Ｓ、Ｊ、ら：　（１９６６）、＾ｎｎ、　Ｔｒｏｐ、　 Ｍｅｄ、　Ｐａｒａ−ｓｉｔｏｌ　６０．１５２−１５８゜ ５、Ｄｉｖａｎ、＾、Ｒ０ら：　（１９８２）＾ｍｒ、　Ｊ、　Ｔｒｏ、　Ｍｅ ｄ、　ｒｌｙｇ。

３１、３６４−３６９゜ ？、Ｅｓｔｒａｄａ、　Ｊ、Ｅ、　＆　Ｋｕｈｎ、　ＲｏＥ、　：　（１９８５ ）　Ｊ、　ｏｆ　Ｎｅｕ−ｒ＋ｏ１．５ｃｉｅｎｃｅｓ　７１．３９−４８゜８ 、Ｋｕｈｎ、　ＲｏＥ、ら：　ＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．７４０，４５ ６．（１９８８）。

９、Ｅｓｐｉｎｏｚａ、　Ｂ、ら：　（１９３５）、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｊｃ ｒｏｂｉｏｌ、　２４゜５３６−５４１゜ １０．Ｅｓｐｉｎｏｚａ、Ｂ、＆　Ｆｌｉｓｓｅｒ、＾、：　（１９８７）、＾ ｒｃｈ。

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３８、　２９９〜３０３゜ １２、　Ｋｉｎ、　Ｓ、１．ら：　（１９８６）、　Ｋｏｒｅａｎ　Ｊ、　Ｐａ ｒａｓｉｔｏｌ、　２４゜１４５−１５８゜ １３、　Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ、　Ｅ、ら：（１９８７）、　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｌ １ｎ、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、２５．　１１８１−１１８５゜１４、５ｕｒｙ ａｎａｒａｙａｎａ、　Ｖ、ら：　（１９８７）、　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ。

５ＶＩＩ＾−５，３７ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｎｅｕｒｏｌｏ−ｇｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｉａ、Ｈｙｄ ｅｒａｂａｄ０１５、Ｌｉｇｈｔｏｗｅｒｓ、Ｍｌ、＆　Ｒｉｃｋａｒｄ、Ｍ、 Ｄ、　；　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ（１９８８）、四、５１２３−３１６６゜ １６、Ｊ、５ｏｔｅｌｏら：Ｊ、Ａｍ、菖ｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、（１９８６）、２ ５６゜８９３゜ １７、Ｄｉａｚ　Ｄｅ　Ｌｅａｎ、Ｌ、ら：　（１９８２）、＾、Ｆｌｉｓｓｅ ｒら編、Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｏｓｉｓ　Ｐｒｅｓｅｎｔ　５ｔａｔｅ　ｏｆ　ｋ ｎｏｗｌｅｄｇｅ　ａｎｄ　ｐｅ−ｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、４６５−４７５．Ａ ｃａｄｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ０１８．５ｃｈａｆｆｎｅｒ 、？、＆　ｆｅｉｓｓｍａｎｎ、Ｃ，；　（１９７３）、＾ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、５６．　５０２−５１４゜１９、ｌ１ｕｙｎｈ、Ｔ、　Ｖ、　、Ｙｏｕｎ ｇ、Ｒ，＾、＆　Ｄａｖｉｓ　Ｒｊ、：　（１９８５）。

ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ−Ｉ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａ ｃｈ、Ｇｌｏｖｅｒ。

０９Ｍ、編、　ｐｐ、４９−７８　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ０２０、Ｉｎｎ１ｓ、Ｍ、Ａ、、Ｍｙａｍｂｏ、Ｋ、Ｂ、、Ｇｅ１ｆａｎｄ、 Ｄ、ｎ、＆Ｂｒｏｗ、Ｉｆ、Ａ、Ｄ、　＋（１９８８）、Ｐｒａｃ、Ｎａｔ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳ八へ、９４３６−９４４０゜ ２１、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｍ、Ｗ、、＆　Ｌｕｊａｎ、Ｅ、　：Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　１ｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 、　５ｈｉｖｌｅｙ、　Ｊ、Ｅ、編。

（１９８６）　ｐｐ、８９．　Ｈｕｍａｎａ　ＰｒｅｓｓｏＦｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　２ −南　−−−一−哨−＃／’％　ず−１豹−− ゝ＼〜 Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、５ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年７月２３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）有鉤嚢虫の排泄／分泌（Ｅ−Ｓ）抗原の、神経嚢虫症の免疫診断における使 用。 ２）見掛けの分子量約９７，０００、６６，０００ね、５０，０００および３８ ，０００の抗原を使用する請求項１記載の使用。 ３）見掛けの分子量約６６，０００および３８，０００の抗原を使用する請求項 １記載の使用。 ４）イムノアッセイが、ＣＳＦおよび血清のような患者体液中の抗体を検出する ように設計される請求項１〜３のいずれかに記載の使用。 ５）イムノアッセイが、ＣＳＦおよび血清のような患者体液中の抗原を検出する ように設計される請求項１〜３のいずれかに記載の使用。 ６）請求項２および３に定義された抗原の製造にｉｎｖｉｔｒｏで維持された有 鉤嚢虫を用いる方法。 ７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した見掛けの分子量が約９７，０００または６６， ０００または５０，０００または３８，０００ダルトンの、有鉤嚢虫によって排 泄／分泌される抗原。 ８）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した見掛けの分子量が約９７，０００または５０， ０００の糖蛋白質である請求項７記載の抗原。 ９）部分アミノ酸配列、バリン−グルタミン酸一チロシン−スレオニン−システ イン−スレオニン（ＶＥＹＴＣＴ）を有する見掛けの分子量約３８，０００の蛋 白質である請求項７記載の抗原。 １０）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した見掛けの分子量が約９７，０００または６６ ，０００または５０，０００または３８，０００の、有鉤嚢虫による分泌または 排泄によって得られる抗原。 １１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した見掛けの分子量が約９７，０００または約５ ０，０００の糖蛋白質である、有鉤嚢虫による分泌または排泄によって得られる 抗原。 １２）部分アミノ酸配列、バリン−グルタミン酸一チロシン−スレオニン−シス テイン−スレオニン（ＶＥＹＴＣＴ）を有する、有鉤嚢虫による分泌または排泄 によって得られる抗原。 １３）有鉤嚢虫の感染に対するワクチンの製造における請求項７〜１２のいずれ かに記載の抗原の使用。 １４）請求項７〜９に定義した抗原を得る方法において、ａ．感染ブタ筋肉から の無傷の、障害を受けていない嚢尾虫を、抗生物質を含む無血清細胞培養生育培 地中に維持し、 ｂ．維持の最初の２４〜６０時間におけるすべての抗原を、培地の反復置換によ って除去し、 ｃ．以後、膨出時まで適当な間隔で培地を収集し、ｄ．膜分画を除去し、ついで ｅ．抗原を単離する 工程からなる方法。 １５）活動型ヒトＮＣＣの診断方法において、診断すべき患者からのＣＳＦを、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定された見掛けの分子量約９７，０００もしくは６６，０ ００もしくは５０，０００もしくは３８，０００ダルトンのｉｎ　ｖｉｔｒｏ培 養有鉤嚢虫の排泄もしくは分泌抗原の少なくとも１種またはこれらの抗原の混合 物と相互作用させる方法。