PT92950A

PT92950A - Processo para a obtencao de antigenes da "cysticercus cellulosas", de vacinas que os contem e metodo de imunodiagnostico que utiliza os referidos antigenes

Info

Publication number: PT92950A
Application number: PT92950A
Authority: PT
Inventors: Ravi B V Kumar; V Suryanarayana; V Ravi; A Chandramukhi
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1989-01-24
Filing date: 1990-01-24
Publication date: 1990-07-31
Also published as: EP0456686B1; GR900100011A; JPH04502814A; WO1990008958A1; DE69026076D1; GR1000403B; MX19155A; HUT56971A; OA09500A; EP0456686A1; CN1045184A; ATE135823T1; FI913530A0; BR9007047A; KR910700460A; SE8900243D0

Description

AKTIEBOLAGET ASTRA "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE ANTIGENES DA "CYSTICERCUS CELLU-LOSAE", DE VACINAS QUE OS CONTÊM E MÉTODO DE IMUNO-DIAGNÓSTICO QUE UTILIZA OS REFERIDOS ANTIGENES"

Antecedentes da Presente Invenção Âmbito da Presente Invenção A Cysticercus cellulosae, a forma larvar da tenia Taenia solium, pode infestar o cérebro humano conduzindo a graves sindromas neurológicos colectivamente descritos como Neurocisticercose (NCC). Dependendo da localização intra craniana do cisto, observam-se muitas vezes os seguintes quadros clínicos:

Localização _ __Sindroma_Clínico__ Sequelas________

Parenquima cerebral Epilepsia

Lesão que ocupa espaço Deficiência motora (SOL) ou sensorial

Psicose Encefalite

Hidrocefalite Paralisia dos nervos cranianos Deficiência motora e sensorial

Meninges Menigite crónica

Ventrículos

SOL

Hidrocefalia

Todos os sindromas clínicos aqui descritos podem ser causados por diversos factores etiológicos, sendo as infecçães do sistema nervoso pelo Mycobacterium tuberculosis o diagnóstico diferencial mais comum para a neurocisticercose. Faz-se o diagnóstico desta doença com base em exames radioló-gicos do crâneo. Os cistos mortos, calcificados, surgem como lesSes radioopacas densas, nos raios do crâneo, enquanto os ci£ tos vivos se apresentam como lesSes hipodensas ou hiperdensas na tomografia computarizada (CAT-SCAN' ). Recentemente, tem sido aplicada a imagem de ressonância magnética (MRl) do sistema nervoso central (SNC) para se visualizarem os cistos vivos. A identificação de um cisto em qualquer destes procedimen tos de visualização depende em grande parte das dimensões do cisto e da reacção do tecido hospedeiro circundante. Em muitos países em vias de desenvolvimento em que a doença prevalece, não existe um acesso fácil às facilidades de visualização sur ge a necessidade de um método alternativo mais fácil para o diagnóstico. Assim, é necessário um ensaio de imunodiagnóstico que seja susceptível de diferenciar a neurocisticercose de outras doenças neurológicas. A maioria dos ensaios imunológi-cos existentes visam a detecção de anticorpos contra antige-nes do organismo que se pretendem identificar. Para além disso, desenvolveram-se diversos ensaios tais como ensaios de sero-diagnóstico para se utilizarem em situações epidemiológicas para um diagnóstico muito específico da neurocisticercose. A especificidade e sensibilidade do ensaio depende em larga escala de antigene que se utilizar no ensaio. A presente invenção descreve um método para a preparação de anti^ genes de Cysticercus cellulosae que pode conferir especificidade e sensibilidade ao imunodiagnóstico. Técnica Anterior de Preparação do Antigene e Imunodiagnóstico

Preparam-se extractos brutos da larva da T. solium. como homogenatos completos do cisto, (l) ou como homo genatos das porçães sólidas do cisto, isto é, parO.de da vesícula e do escólex ou apenas parede-; da vesícula (2). Em deter minados casos, também se utilizou o fluido vesicular como um antigene (3). Submeteram-se, geralmente os homogenatos a uma contrifugação para remover os detritos celulares, núcleos, etc., a 15 000 - 20 000 x g. durante 15 a 30 minutos. Extraiu--se o homogenato completo com acetona para remover a maior par te dos lípidos e utilizou-se em complemento do ensaio de fixação (4). Utilizaram-se os extractos brutos ou totais em diversos tipos de imunoensaios tais como o ensaio de hemoglutinação passiva (5 e 3), imunoelectroforese (l) e o ensaio de imuno-absorção ligado a um enzima (ELISA) (l,6 e 7)·

Utilizando o homogenato completo do cisto,

Kuhn e outros (8), descreveram um ELISA e atribuíram a sensibilidade do fcnsaio a um grupo de antigenes entre as proteínas. Estes anti-genes não foram purificados nem ensaiados quanto à sua especificidade. 0 homogenato completo contém lípidos e hidratos de carbono para além das proteínas que se visualizaram e identifá. carara como imunogénicas no ensaio da mancha Western* Não se ve rificou o contributo dos antigenes não proteicos para a sensibilidade total do ELISA. 0 único antigene que se identificou como o antigene B > que apresentava as propriedades da fibr£ - h - nectina foi utilizada no ELISA mas a sensibilidade não era satisfatória (9)· 0 homogenato total do parasita apresenta diver sas desvantagens como antigene no imunodiagnóstico.(i) Contém diversos epítopes que possuem reacção imunológica cruzada com outros elementos patogénicos do SNC (ver adiante)i (ii) Demonstrou--se que diversos parasitas helmintas partilham os antigenes de reacção cruzada (10. Nos paises em vias de desenvolvimento tais como a índia, o México, o Brasil, a China, a Tailândia e países da América Central e Ásia, em que as infecções parasita rias entre as populaçães são muitas vezes, bastante comuns, um considerável número de indivíduos é portador de anticorpos séi ricos para os antigenes de reactividade cruzada. Quando estes indivíduos são afectados por doenças que ultrapassam a barreira sanguínea cerebral, os anticorpos séricos podem penetrar no fluido cerebrospinal (FCE) e interferirno diagnóstico da cisti-cercose proporcionando falsos resultados positivos.

Tendo em vista a falta de especificidade dos homogenatos completos, efectuaram-se tentativas para identificar e purificar as espécies e os antigenes específicos dos tecidos, ou seja, antigene «derivados do escólex e do fluido vesá. cular. Identificaram-se dois polipéptidos de pesos moleculares aparentes de cercada 26,000 e de cerca de 8.000 como antigenes específicos da espécie Taenia solium. Estes antigenes reagiram num ensaio de imunomancha com soro obtido a partir de pacientes infectados com Taenia solium mas não com soros de pacientes com outras infecçães helminticas (ii). Não foi já verificada a sensiblidade destes antigenes ou a especifi- cidade no que respeita a outras perturbações relacionadas com o SNC. Um antigene purificado a partir de fluido vesicular utilizando um anticorpo monoclonal contra proteínas completas do fluido vesicular revelou-se muito específico em imunodiagnóstico mas carecia da sensibilidade requerida para ser utilizável na detecção de NCC (12). As proteínas especí ficas do escólex de peso molecular aparente de cerca de 80.000 e de cerca de 10.000, purificadas utilizando anticorpos mono-clonais conferiram uma sensibilidade de χΟΟ % aos serodiagnós^ ticos de cisticercose. Reivindicou-se que estes antigenes eram úteis para fazer a diferenciação entre a teniase e cistjl cercose. Não se ensaiou a sua utilidade para fazer a distinção entre a neurocisticercose e outras cisticercoses sistémicas (l3)· A desvantagem de se utilizar o homogenato com pleto como antigene pode ilustrar-se posteriormente mediante um estudo levado a efeito no laboratório dos inventores (l4): resume-se a seguir este estudo:

Homogeneizaram-se os cistos e submeteram-se a ultra-sons (8 x 30 impulsos por segundo). Submeteram-se os cistos homogenatos solubilizados em SDS a 1 $ e tratados com 1 ήο de J^-mercaptoetanol, a 100°C, a uma filtração através de gel numa coluna '‘Sephacryl S-300, para serem separados em três fracçães:

Fracção I : antigenes do cisto de peso molecular > 66 K Daltons

Pracção II : antigenes do cisto de peso molecu- ^ lar compreendido entre 25 è 66 K Daltons

Fracção III : antigenes do cisto de peso molecular compreendido entre l4 e 35 K Daltons - 6 - (Fig. l)

Legenda da Pig. Is Analizaram-se três frac-çSes de pico obtidas por filtração através de gel sobre SDS--PAGE a 10 $>, Pista ls terceiro pico; Pista 2: segundo pico; Pista 3’ primeiro pico; Pista 4: marcadores de Mr (94, 67, 43, 30, 20,1 e 14,1 KDa). Indica-se no texto os intervalores de Mr e das três fracçSes.

Efectuou-se o ELISA utilizando as três fac-çSes anteriores de antigenes cisticercais, do seguinte modo:

Ensaiaram-se 150 CSFíà recolhidos de modo alea tório em diversos pacientes com perturbaçSes neurológicas e ensaiaram-se contra estas três fracçSes, Cobriram-se com os antigenes 96 placas de microtitulação de 96 tubos de Dyna-tech a concentraçSes de 5 JUg/ml (100 /xl/tubo) em tampão de hidrogenocarbonato 50 mM, a pH 9,6, durante a noite, diluiu--se com BSA â 2 $ e ensaiaram-se os CSF^S para diluições de l/25, l/l25 e 1/625. A IgG humana que se ligou foi revelada mediante a utilização de anti-IgG humana desenvolvida no coelho conjugada com peroxidade (Sigma, diluição de 1:1000. Utilizou-se Ortofenileno-diamina como cromogéneo (4 mg/10 ml) e Η^Ο^ a 0,3 $ como substrato. O Quadro 1 resume os resultados destas 150 amostras 7 /

Quadro 0 + CM CM ca vo 1 1 1 «d H O) H 0 H 3 + u + CM H CM 1 | 1 1 £ + + + CM ' ca 1 1 1 1 + 1 Pt- m m • i 1 + 0 + CM CA H Pt 1 1 1 Ktí 01 H 0 H 3 + u + Pt Pt Pt 1 1 1 1 £ + + 1 1 H Pt Pf 1 1 1 + 1 0 + 1 Pt CA ca | 1 1 Kti o> 0 3 H + b + VO 1Λ ca 1 1 1 1 £ Φ + Ό 0 • (0 vo H pt O b- O CM 0 (β H CM CM ca CA 0 cd 1 •tí cd cd φ u <·-** 0 > CQ ô P •rl 0 0 A a a 6D b b m 0 ft Φ 0 <d È-1 H ε H 0 Ό 0 o O •rl «3 (d <d Φ •rl 0 « P ί> w b c -P 1 H » 0 0 3 Φ cd cd '0 u H P 0 « 0 Φ 3 ft 3 H -P cd cd •rl Ό (0 eo «3 8 0 d •rl 0 3 3 •rl Η 0 3 o Φ •H *rl 'Φ 10 3 3 •rl 0 ® ft 3 ε δ cd b b P P E to Ό 3 0 0 & •rl <D 3 Φ 3 b Φ •rl φ Φ > CO ÍO O -P Λ 3 b 0 cd Φ cd 10 Φ Φ 0 Φ Ό Φ Φ Ό Φ b O CQ 3 P b a p cd P P 3 P 3 co cd + 3 + P + P Φ C Ή 3 •Η ·Η •rl P 3 H (0 •rl η H 0 0 ω o φ M &DH 3 ft Φ O 0. 3 •H CG 3 3 S 3 Φ 3 3 P P 3 3 φ <H +> 1 •rl ft cd P P P O CO P 0 <φ Η Φ tfl f-t c ε p 3 3 3 0 H ε ε •rl O •η <! Φ 0 H Φ Φ Φ E ε s 3 φ 0. 3 0 0 a o < a ε a ® ε fr· P (X) H • 0 H CM ca Pt ca VO l> CG a η +++ CSFs + ve até uma diluição de 1/625; ++ CSFs +ve até uma diluição de apenas l/l25 + CSFs +ve até uma diluição de apenas l/25. A abaorvência média a 490 nm das categoria 2,3 e h é 3-5 vezes inferior a da categoria 1. - 8

.% A partir destes dados tiraram-se as seguintes conclusões:

Apesar de o teste ser suficientemente sensível para reconhecer todos os casos de neurocisticercose, o máximo de falsos resultados positivos correspondem aos casos de menin gite tuberculosa. No entanto, o ensaio não tem utilidade se existirem ambas as doenças.

Demonstrou-se que a reacção de CSFs da meningite tuberculosa com antigenes do cisto se devia à reactividade cru zada entre os antigenes microbacterianos e os antigenes do cisto. 1. 0 Micobacterium tubérculosis tratado com ultra-sons inibiu a ligação de CSBs de cisticercose positiva aos antigenes do cisto mas não aboliu totalmente a reacção. y 2. Esta inibição aumentou com concentrações acrescidas de antigenes micobacterianos. 3. 0 anti-soro do coelho utilizado contra o micôbacterium tratado por ultra-sons reagiu com os antigenes do cisto.

As observações anteriores ilustram que os antigenes brutos contêm efectivamente epitopes que reagem de modo cruzado com outros patogéneos do SNC.

Os cisticercos são organismos multicelulares que não podemeer fagocitados e processados pelos macrófagos ou granulócitos ou outros antigenes que apresentam células diferentes dos microrganismos celulares. Deste modo, o sistema i - 9 f ν' imunológico humano raramente se encontra sensibilizado para todas as proteínas dos parasitas sobretudo num compartimento imunologicamente privilegiado tal como o SNC. Assim, os anti-genes segregados ou excretados ou lançados por estes parasitas nos fluidos orgânicos do hospedeiro (designados como antigenes E - S) são muito importantes sob o ponto de vista imunológico. Obtiveram-se os antigenes E-S de muitos parasitas helmintas mantendo diversos estádios de desenvolvimento dos helmintas in vitro num meibf de cultura de tecidos e purificando os antigenes a partir do meio de crescimento (15)· Também se man tiveram os cysticercus cellulosae in vitro com soro e ex-tractos de tecidos (l6). Conservando estes parasitas por perÍ£ dos curtos em meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) ou solu ção salina de tampão de fosfato (PBS) e impulsionando estes parasitas com aminoácidos C, demonstrou-se que estes eram meta-bolicamente activos (l7). No entanto, apenas se detectaram, no meio, quantidades desprezáveis de proteínas marcadas radio-activamente. Nunca se ensaiou a utilidade destes antigenes em imunodiagnóstico.

Pormenores da Descoberta ou Invenção A presente invenção baseia-se na permissa de que os antigenes E-S de cisticercus cellulosae obtidos por manutenção dos parasitas in vitro pode estar estreitamente ligada aos antigenes que saem dos cistos como uma parte dos processos metabólicos do cisto in vivo. Deste modo, podem conferir especificidade e sensibilidade aos ensaios de imunodiagnójS tico concebidos para detectar anticorpos nos fluidos orgânicos de pacientes tais como CSF e soro. Podem encontrar-se os mesmos antigenes ou alguns produtos degradados destes antige-nes nos CSFs dos pacientes. Isto seria a base para a concepção de imunodiagnósticos com base na detecção de antigenes. Pensa-se que é possível desenvolver anticorpos policlonais não específicos ou monoclonais contra os antigenes E-S, os quais se poderiam, depois, utilizar num tal ensaio de detecção. Como alguns destes antigenes podem conferir protecção imunitária ao hospedeiro, podem utilizar-se estes antigenes para se desenvolverem vacinas para neutralizar as infestãç5es por cisticercus cellulosae.

De acordo com a presente invenção, descreve-se um novo método de manutenção de cisticercus cellulosae em meio de cultura de células isento de soro por períodos dilata dos, e a utilização dos antigenes elaborados pelo parasita no meio, para imunodiagnóstico de NCC envolvendo a interacção de CSF de pacientes com antigenes E-S. Aqui, deve· assinalar-se a utilizaçáo de antigenes na identificação de NCC sem qualquer interferência de outras formas de cisticercose sistémica. 0 novo método de diagnóstico descrito pode também ser útil no diagnóstico da infestação de cysticercus cellulosae em por cos destinados a ser consumidos por seres humanos*

Fonte e Conservação de Cistos:

Obtiveram-se os músculos de porcos infectados com cisticercos, no matadouro. Limparam-se os contaminantes da superfície dos músculos dos porcos com etanol. Extrairam--se os cistos intactos sem ruptura da parede vesicular (se se romper o cisto é descartado) e colocaram-se em solução salina contendo Penicilina G 1000 unidades/ml, Gentamicina 4o ^ugs/ml e Amfotericina B 5,/igs/ml, Lavaram-se os cistos cuidadosamente com solução salina esterilizada contendo antibióticos como os anteriormente mencionados. Lavaram-se depois com meio RPMI 1640 isento de soro ou meio essencial mínimo de Eagles (MEM) com sais de Earles ou sais de Hank. Colocaram-se os ci£ tos em MEM RPMI 1640 ou de Eagles contendo Penicilina G 1000 unidades/ml e Gentamicina 40^wg/ml a 37°C com 5 $ de CO^.

Recolha do antigene E-S:

Muda-se e, põe-se de parte, o meio, pelo menos duas vezes, durante as primeiras 24-60 horas para assegurar a remoção completa dos componentes do hospedeiro. Pode substituir -se o meio, de modo adequado, duas vezes durante as primeiras 48 horas. A partir daí, recolhe-se o meio intervaladamente, até os cistos iniciarem a evaginação. De modo adequado, por razões de ordem prática, recolhe-se o meio de 24 em 24 horas. Determina-se a viabilidade dos cistos pelas contracções da parede vesi. cular que se podem observar num microscópio invertido. Observa--se a evaginação do 62 dia em diante. Centrifuga-se, logo após a recolha do meio a 104000 x g, durante 60 minutos para se remo verem os detritos insolúveis e os contaminantes de membrana. Adicionou-se ao sobrenadante fluoreto da para-metilsulfonilo (2 mM) para-clorobenzoato de mercúrio (θ,θ6 $) e sulfato de amónio a uma saturação de 90 $, mantendo o pH da solução a 7--7,4. Efectua-se a precipitação a 4°C e, recolhe-se, suhse-quentemente, por centrifugação a 15.000 x g, durante 30 minutos a 4°C. Dissolve-se o precipitado em tampão de fosfato de - 12 /

sódio 50 mM, a pH 7»^ e dializa-se extensivamente contra o nres mo tampão com diversas mudanças durante 48 horas. De um modo alternativo, podem remover-se os fragmentos de membrana, de acordo com outros métodos conhecidos na especialidade, tal como a filtração por membrana. De idêntico modo, podem isolar -se os antigenes por outros métodos tais como a ultrafiltração. 0 espectro UV da solução apresenta uma absorção máxima a 278--280 nm. A proteína calculada de acordo com o procedimento de Schaffner e Weissmann (l8) proporciona 25-35/*g proteína/ /cisto/24 horas, quando os cistos são conservados a uma densi^ dade parasitária de 15 cistos/lO ml.

Proporciona-se a electroforese efectuada em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) destas proteinas corada com azul de Coomassie R, na Fig. 2.

Legenda da Fig. 2; proteinas E-S coradas com azul de coomassie, analisadas numa SDS-PAGE de gradiente 7,5--15 Pista lí Indicadores de alto Mr (ll6; 97,4; 66; 45 e 29 KDa; Pistas 2 e 3? proteinas E-S precipitadas com sulfato de amónio, de duas preparaçães independentes. Pista 4s indicadores de baixo Mr (94; 67? 43; 30? 20,1 e 14,4 KDa).

As principais bandas de proteínas observadas tinham um peso molecular aparente de cerca de 97.000, 66.000, 50.000, 38.000, 28.000 e uma mistura irresolúvel de proteí nas de peso molecular·aparente no intervalo compreendido entre 10.000 e 14.000 daltons. Também se observaram diversas bandas menores

Evidência da nova síntese das proteínas B-S:

Transferiram-se os cistos, após as primeiras 48 horas no meio, para?meio com deficiência de metionina, conten-do 40 yu Ci de "'S-metionina/cisto. Tomaram-se o meio e os cis tos em diversos instantes. Efectuou-se o corte dos cistos no interior da parede vesicular e do escólex e homogeneizaram-se. Analisaram-se os homogenatos por SDS-PAGE a 12$ e submeteram--se a fluorografia. Precipitou-se o meio com acetona e, anali zou-se por SDS-PAGE a 12$ e submeteu-se a fluorografia. Exij3 o e tiu uma incorporação activa de "^S-metionina nas proteínas da parede vesicular e do escólex. Em 48 horas surgiram no meio diversas proteínas. (Fig. 3)

Legenda da Fig. 3s Auto-radiograma de proteínas de seereção/excreção marcadas radicoactivamente com "^S- -metionina; incubaram-se 3 cistos, separadamente, em 1 ml de 35 meio, contendo cada um deles 40 yuci de ''^S-metionina, durante 48 horas. Recolheu-se o meio, submeteu-se a ultracentrifugação e precipitou-se o sobrenadante com acetona* Cada uma das pistas representa a proteína de um único cisto.

Tal como se pode observar na Fig, 3» algumas pro teínas foram activamente sintetizadas e excretadas/segregadas no meio como uma parte da actividade metabólica do parasita.

Resumo da Presente Invençãoi

Quando se conservam os cistos in vitro. em meios isentos de soro, como uma parte do ciclo metabólico, surgem no _ 14 .% meio alguns antigenes de proteínas quer,um processo de excreção quer de secreção. Estes antigenes recolhidos antes da evaginação do escólex representam antigenes dos estádios lar vares. Reivindicam-se os antigenes, o método para a sua preparação e a sua utilização em diagnóstico e, possivelmente prognóstico de NCC, bem como a sua utilização na produção de vacinas contra a infestação de cisticercus cellulosae. Tam bem se pode utilizar o método de diagnóstico aqui descrito, para diagnosticar cisticercose em porcinos que se destinem a ser consumidos por seres humanos.

Uma tal forma modificada podia ser, por exemplo, a ligação ou a ligação recticular de polietilenoglicol com outras proteínas ou reagentes bifuncionais ou a digestão com proteases. A presente invenção também diz respeito a um método para o diagnóstico da NCC humana activa que compreende a interacçao de CSF de um ser humano a ser diagnosticada com, pelo menos, um antigene excretado ou segregado por cisticercus cellulosae conservada in vitro. tendo um peso molecular aparente, em conformidade com o determinado por SDS-PAGE, de cerca de 97*000 ou de 66.000 ou de 50.000 ou de 38.000 daltons ou uma mistura dos referidos antigenes.

Exemplos:

Os Exemplos 1 e 2 referem-se a utilização destes antigenes num sistema ELISA, para detecção de anticorpos anti-cisticercos no ©SF de pacientes com várias perturbações neurológicas. Os Exemplos 3 ® referem-se à identificação posterior de importantes antigenes de acordo com o seu peso 15 molecular em imunoprecipitação utilizando CSE de pacientes. EXEMPLO lí

Cobriram-se placas de microtitulação rígidas da Dynatech de 96 cavidades com proteínas de excreção ou de secreção numa concentração de 5 J^S de proteína/ml (lOO ^ul/eavi-dade) durante a noite,a temperatura ambiente. Destruiram-se os sítios de ligação de proteína restante, das placas, utili zando albumina de soro de bovino (BSA) a 2$ em PBS. Diluíram -se os CSPs a l/25, 1/125 e 1/625 em solução salina de tam pão fosfato contendo 0,05 Í° de Tween-20 (PBST) e, incubaram--se durante 2 horas a 37°C. Após a incubação, lavaram-se os recipientes 3 vezes com PBST. Utilizou-se a anti-XgG humana desenvolvida no coelho conjugada com peroxidase diluída de 1:1.000 em PBST num volume de 100 ^ul/cavidade e incubou-se durante 2 horas a 37°C, após o que se lavaram três vezes as cavidades com PBST. Os conjugados que se ligaram, revelaram--se em 20 minutos utilizando ortofenileno-diamina como cromo géneo (¾ mg/lO ml) e H^O^ com substrato. Interrompeu-se a reacção com 50 jil de HgSO^ ^ e determinou-se a absorvância a 490 nm num leitor ELISA Mr 700 Dynatech. Considerou-se posi tivo qualquer valor de absorvância superior a 0,10 a uma diluição de CSF de l/lOO. 0 Quadro 2 contém os resultados.

Diagnóstico No. de Amostras Positivo Cisticercose Provas Post-mortem 2 1 Prova cirúrgica 2 2 Clinicamente suspeitos Encefalite Japonesa 7 6 ELISA de captura de IgM+ve 30 0 Meningite tuberculosa comprovada por cultura 25 0 cirurgicamente comprovada Meningite tuberculosa 71 2 (Ag+ve ou anticorpo+ve) Absorvância =0,15 a ^90nm 0 Quadro anterior indica que este antigeno é superior ao antigeneo bruto e que confere especificidade à reacção imunológica. EXEMPLO 2

Este Exemplo refere-se a um estudo de ligação dupla do valor diagnóstico de antigenes excretados/segregados, nos quais a concepção do ensaio elimina a influência do investigador que efectua o ensaio. 37 amostras de CSF obtido em pacientes com várias perturbações neurológicas com diagnóstico confirmado, proporcionaram números em série de 1 a 37 de acordo com obser vador isento que não era um dos inventores. Efectuaram-se - 17 - - 17 -

três conjuntos de alíquotas das amostras. Dois laboratórios, que nada tinham a ver com os inventores receberam as amostras de CSF e duas pessoas de cada laboratório, isto é, um total de quatro pessoas levou a efeito o ELISA, de modo independente, de acordo com o descrito pormenorizadamente no Exemplo 1, Os quatro investigadores tabelaram os resultados e comunicaram--nos ao observador isento. Os resultados dos quatro investi^ gadores foram idênticos e, apresentam-se no Quadro 3.

Quadro 3

Diagnóstico No. de Positivos Neurocisticercose 3 3 Insensibilidade espinal (controlo normal) 8 0 Meningite Post-operativa (comprovado em cultura) 5 0 Encefalite Japonesa 7 0 Meningite piogénica (Pneumoeócita) 3 0 Meningite criptocóccica (comprovado por cultura) 1 0 Meningite Tuberculosa (comprovada por cultura) 2 0 Compressão do Cordão Toráxico 2 0 Anomalia da Junção Crânio-Vertebral 1 0 Prolapso do disco Intervertebral 1 0 - 18

Quadro 3 (Continuação)

Diagnóstico No. de Positivos Doença dos neurónios motores 1 0 Neuropatia Atáxica 1 0 Hemiplegia 1 0 Paralisia Pseudobulhar 1 0

Os resultados anteriores indicam que os anti-genes de excreção ou de secreção podem conferir 100 $ de sensibilidade e 100 $ de especificidade a um ensaio de diagnóstico concebido para detectar anticorpos nos CSFs dos pacientes. EXEMPLO 3 125

Marcaram-se com -I os antigenes excretados ou segregados obtidos de acordo com o descrito para a presente invenção, utilizando o método do lodogéneo. Incubaram-se as proteínas marcadas com CSFs de neurocisticercoses, meningite tuberculosa e diversas outras perturbações neurológicas conhecidas. Diminuíram-se os complexos imunológicos com anti-IgG humana desenvolvida no coelho e ajustado a totalidade da solução para 2,5 $ de polietilenoglicol. Analisaram-se os precipitados numa SDS-PAGE de gradiente de 7»5 $-15$ que se submeteu a auto-radiografia.

Fig. k 19 -

Legenda da Fig. 4. Auto-radiograma de protejí nas segregadas/excretadas, marcadas com e imunoprecipita das com CSFs de pacientes. Incubou-se CSF (30 yul) em dilui-ç5es de 1:3 com proteínas E-S (3 x 10 cpm) e precipitaram-se os complexos imunológicos, tal como estipulado no texto. Pista 1: Controlo-sem CSF; Pistas 2, 3 e 4, CSF de neurocisticer- cose; Pista 5* Meningite Tuberculosa; Pistas 6, 7 e 8; outras perturbaçSes neurológicas.

As proteínas de peso molecular aparente de cerca de 97 KDa, 66KDa, 50 KDa e 38 KDa diminuiram significativamente na imunoprecipitação. EXEMPLO 4:

Imunoprecipitaram-se as proteínas E-S marca- 35 das com S-metionina, por conservação dos cistos in vitro em

O C meio com deficiência de metionina, contendo j:?S-metionina com anticorpos CSF, conforme mencionado no Exemplo 2. A fluorogra-fia da SDS-PAGE dos imunoprecipitados apresenta-se na

Fig. 5.

Legenda da Fig. 5í Autoradiograma de protex 35 nas E-S marcadas com S, imunoprecipitadas com CSFs de pacientes com várias perturbaçSes neurológicas. As pistas 9 e 5 representam os imunoprecipitados de CSFs de NCC dos pacientes.

Tal como no Exemplo 3, também aqui se precipitaram proteínas de 97, 66 e 50 KDa. - 20 . ( / CARACTERIZAÇÃO DO ANTIGENE DE PESO MOLECULAR APARENTE DE 97000 I. Sequência Parcial de Ácido Nucleico:

Construiu-se uma biblioteca de cADN lambda gt 11 (19)» a partir de poli-A completa de Cysticercus cellulosae. Utilizando soro de coelho Hiper-imunizado contra para-miosina purificada a partir do Schistosoma mansoni. identificou-se e isolou-se um clone de cADN de cerca de 2,5 kg. A sequência do ADN de cordão duplo (20), proporcionou a sequência que se segues

1. TCTCAAGCAGXACGTCACACTGACAGTACATATGTACACTGACTCTGCTT CACATATTATATTAGTTACTAGCAAGCACACACACGTCGAC

2. TGAGTACGTCXTGTAGTCTGTCGTATGTGTGTAGTTCTGTCGTXGATCAG TAACTTAATATTAGAGTCAGXAGGT CAGTGTCATGTCATGTCATGTAT II. Sequências de aminoácidos parciais

Eleetroeluiu-se o antigene de peso molecular aparente de 97.000, a partir de géis de poliacrilamida SDS corados com azul de Coomassie nos quais se havia efectuado a electroforese dos antigenes E-S (2l). Precipitou-se a proteína electroeluída, com dissolvente, para remover SDS. Depois, efectuou-se a digestão da proteína com TPCK tratado com trip-sina. Separaram-se os pétidos trípticos numa coluna (0,46 x x 25 cm) RP300 (C8) equilibrada com dissolvente A (TFA a 1 $ em água). Eluiram-se os péptidos com um gradiente linear de dissolvente B (acetonitrilo a 70 contendo TFA a 0,085 $) de 0 a 65 $, em 4o minutos. Evaporaram-se as fracções que con tinham péptidos até à secura sob vazio. Utilizaram-se estes - 21 / péptidos para sequênciação. QUADRO 4:

Sequência de arainoácidos de alguns péptidos trípticos derivados do antigene de peso molecular aparente de 97000

Peptido

Sequência de Aminoácidos --- VKLDSAK Tl4 ATQTEVWR T 19 VYSTSTK T 16 YAFL-ASVT-SR T21 SLLDFRSTR Til _ J.2

Referencias citadas; 1. Espinosa, B. et, al,(1982) in A.Flisser et al (ed) Cysti-cercosis Present state of knowledge and perspectives, New York, Academic Pihesís,:‘1Ó3-170. 2. Rosas, N. et. al· Arch. Neurol., ^3, (1986), 353-356. 3. Larralde, C. et. al. in Am. J. Trop. Med. Hyg.. 35. (1986) 965-97¾. 4. Neito, D., Neurology 6. (1956), 725-738. 5. Powell, S.J. et. al., Ann, Trop, Med. Parasitol. 60, (1966), 152-158. 6. Diwan, A.R. et.al., Amr. J. Tro. Med. Hvg. 31» (1982), 364-369. 7. Estrada, J.E., e Kuhn, R.E., J. of Neurol. Sciences, li, (1985), 39-¾8. 8. Kuhn, R.E. et, al., patente de invenção norte-americana No. k,7^^56 (1988). 9. Espinosa, B. et.al., J. Clin. Microbiol.. 2k, (1986), 536-5^. 10. Espinosa, B. e Flisser, A, Arch. Investigative Medicine. 17» (1987), 299-312. 11. Gottestein, B. et.al., Trop. Med. Parsit.. 38. (1987), 299 - 303. 12. Kim, S.I. et.al., Korean J. Parasitol«2*f. (1986), 1^5--158. 13. Nascimento, E. et. al., J. of Clin. Microbiol.. 2£, (1987) , 1181-1185.

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Claims

RE I VI NDICAÇÕES 1.- Processo para a obtenção de um antigene excretado/segre gado por cysticercus cellulosae, o qual possui um peso molecular aparente de cerca de 97 000 ou 66 000 ou 50 000 ou 38 000 daltons tal como calculado por SDS-PAGE, caracterizado pelo facto: a) de se manter intactos e não danificados os cisticercos provenientes de músculo de porco infestado numa preparação in vitro num meio de desenvolvimento de cultura celular isento de soro e contendo antibióticos. b) de se remover todos os antigenes nas primeiras 24-60 horas de manutenção por substituição repetida do meio, c) de se recolher subsequentemente o meio a intervalos de tempo até à evaginação. d) de se remover quaisquer fragmentos de membrana, e e) de se isolar os antigenes.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o antigene obtido ser uma glicoproteína com o peso molecular aparente de cerca de 97 000 ou 50 000 daltons tal como calculado por SDS-PAGE.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a proteína de peso molecular aparente de cerca de 38 000 daltons ser constituída por uma sequência de aminoãcidos parcial de valina-ãcido glutâmico-tirosina-treonina-cisteína-treo-nina (VEYTCT).
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o antigene ser obtenível por secreção ou excreção de cysticercus cellulosae e possuir um peso molecular aparente de cerca de 97 000 ou 66 000 ou 50 000 ou 38 000 daltons tal como calculado por SDS-PAGE.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o antigene ser obtenível por secreção ou excreção de cysticercus cellulosae de ser uma glicoproteína com um peso molecular aparente de cerca de 97 000 ou cerca de 50 000 daltons tal como calculado por SDS-PAGE.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o antigene ser obtenível por secreção ou excreção -26; •Γ

de cysticercus cellulosae e de ser constituído por uma sequência de aminoãcidos parcial de valina-ãcido glutâmico-tirosina-treo-nina-cisteína-treonina, (VEYTCT).
7.- Processo para a preparação de uma vacina contra a infestação de cysticercus cellulosae/ caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um antigene obtido de acor do com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 e 6, com agen tes auxiliares de formulação apropriados.
8,- Método de inunodiagnõstico de neurocisticercose, caracte rizado pelo facto de se utilizar antigenes excretõrios/secretõrios (E-S) de cysticercus cellulosae obtidos·pelo processo de acordo com a reivindicação 1.
9. - Método de acordo com a reivindicação 8f caracterizado pelo facto de se utilizar antigenes com pesos moleculares aparentes de cerca de 97 000, 66 000, 50000 e 38 000 daltons.
10. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se utilizar antigenes com pesos moleculares aparentes de 66 000 e 38 000 daltons.
11.- Método de acordo com qualquer das reivindicações 8,9, e 10 caracterizado pelo facto de o imunoensaio ser concebido para /· -27-

detectar anticorpos em fluidos do corpo de pacientes, tais como fluido cerebrospinal (CSF) e soro.
12, - Método de acordo com qualquer das reivindicações 8,9 e 10, caracterizado pelo facto de o imunoensaio ser concebido para detectar antigenes em fluidos do corpo de pacientes, tais como fluido cerebrospinal (CSF) e soro..
13. - Método de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar a manutenção in vitro de cysticercus cellulosae para a preparação de antigenes como definido nas reivindicações 9 e 10.
14.- Método para o dignõstico de neurocisticercose (NCC) humana activa, caracterizado pelo facto: de se 'fazer interactuar fluido cerebrospinal (CSF)-de um ser humano a ser diagnosticado com pelo menos ura antigene excretado ou segregado de cysticercus cellulosae cultivado in vitro possuindo um peso molecular aparente, tal como determinado por SDS-PAGE, de 97 000 ou 66 000 ou 50k000 ou 38 000 daltons aproximadamente ou uma mistura dos referidos antigenes, Lisboa, 24 de Janeiro de 1990 /· : OFicíal da PropFsdade IndwsHal