JPH04501507A - ソラヌムツベロスムからの傷刺激ｄｎａ配列及びその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ソラヌム　ッペロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ　Ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　＋ジ ャガイモ）からの傷刺激ＤＮＡ及びその部分、これを傷又は病原体の攻撃を用い た高等植物における遺伝子産物の生産のために使用する方法、これを含有するＤ ＮＡ運搬ベクター類、及びこれを含有する植物体又は植物体部分に関するもので ある。

植物組織を機械的に損傷すると、形態的及び生理的変化が生じることが知られて いる。ここで、この損傷の後に、種々の酵素類、例えばジャガイモ塊茎中におけ るフェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びペルオキシダーゼ、にんじんの貯蔵 組織におけエクステンシン、ジャガイモの塊茎における脂肪酸合成酵素及びトマ トやジャガイモの葉におけるプロティナーゼ阻害剤の活性か増大する。これらの 酵素類のうちの幾つかにおいては、この活性の増大か、ｍＲＮＡの増加量と関連 している。最も良く理解されている傷誘導遺伝子の一つは、トマト類及びジャガ イモ類におけるプロテイナーゼ阻害剤である。損傷した葉の中では、この遺伝子 のためのｍＲＮＡが顕著に増加する。

植物中での傷誘導による遺伝子の発生は根本的な興味の対象である。なぜならこ の領域で活性となるプロモーターは、損傷の後にこれに対応する構造遺伝子を特 異的に活性化する能力があるからである。例えば、耐性のためにコードし、又は 抗性物質として有効な物質をコードし、又は傷の治ゆを促進する、他の遺伝子と 関係するこの種のプロモーターを、もし他の植物の遺伝物質中へと挿入すること ができれば、当然に大きな経済的興味の対象となる。

ここで、比較的高濃度の誘導ｍＲＮＡが、傷付けられた及び／又は微生物に攻撃 されたジャガイモ植物体中に特異的に存在していることを見出した。このｍＲＮ Ａは、分離して特徴付けることができる。これは、健康な、傷付いていない植物 には現われない。

従って、本発明は、その目的として、損傷及び／または病原性微生物への感染に よって刺激された、ソラヌム　ッペロスムからのＤＮＡ配列、及びその部分、特 にそのプロモータ一部分及びその構造遺伝子部分を有する。更に、本発明は、そ の目的として、損傷及び／又は病原性攻撃の後に高等植物中に遺伝子産物を形質 発現させるためにこれらのＤＮＡ配列を使用する方法を有する。

更に、本発明は、その目的として、上で定義したＤＮＡ配列が挿入されたＤＮＡ 運搬ベクターを有する。最後に、本発明は更なる目的として、こうしたＤＮＡ配 列を含有する植物体又は植物体材料を有する。

遺伝子のプロモーター領域又はその構造遺伝子における、遺伝子の「活性領域」 という表現は、遺伝子のプロモーター領域においては構造遺伝子の活性化のため に無条件に必要であり、かつ構造遺伝子においては、有効な又は活性の遺伝子の 発現のために無条件に必要なヌクレオチド配列に言及するものと理解するべきも のである。

「構造遺伝子」という表現は、ここで記載した系と相同の系におけるソラヌム　 ツベロスムからのＤＮＡ配列のみならず、他の源から、従って異種の系からの構 造遺伝子にも言及するものと理解されるべきものである。ここで記載した傷刺激 プロモーターと融合でき、ジャガイモや他の植物における各構造遺伝子の発現の ために使用できるような、ＣＡＴ−、ＮＰＴ−及びＧＵＳ−構造遺伝子を例示し うる。

この運搬ベクターは、最終的に細菌中へと導入可能ないかなる適当なりＮＡ分子 を備えてもよい。典型的には、これらは、本開示中に更に詳細に説明したような プラスミドであってよい。

この挿入技術は、本技術分野に習熟した者にとって公知である。

これらの運搬ベクターの取り込み及び放出のための細菌は、アブロバフタ−属、 特に根頭がんしゅ病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）及び毛根病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の細菌 によって構成されていてよい。

欧州特許出願公開公開（ＥＰ−Ａ）第１２２．７９１号は、内部に植物遺伝子が 挿入されたＴ−ＤＮＡを含有するＤＮＡ運搬ベクターについて記載する。この植 物遺伝子は、植物プロモーターと植物構造遺伝子とからなり、ここでこの植物プ ロモーターは、この植物構造遺伝子の５′−末端に接合し、この植物構造遺伝子 は、この植物プロモーターの後ろにその転写方向に位置する。欧州特許出願公開 （ＥＰ−Ａ）第１２２，７９１号は、ＤＮＡ運搬ベクター中に遺伝物質を挿入す るための方法及び工程についての詳細な説明を与えており、この文献をここで特 に参照する。

研究の示すところによれば、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）菌は、ジャガイモ 植物体（ソラヌム　ツベロスム）中に潜伏し、組織が傷付けられた後にのみ、ジ ャガイモの茎及び塊茎を優先的に攻撃しつる。これは、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ ）種のジャガイモ塊茎を円板状にスライスし、同時にアトロセプテイカ（ａｔｒ ｏｓｅｐｔｉｃａ）種のエルウィニア　力ロトヴオう（ＩＥｒｗｉｎｉａ　ｃａ ｒｏｔｏｖｏｒａ）で培養することによって、このジャガイモ塊茎中に誘導した 。予期されたように、これらの塊茎は、培養の１８時間後にはげしく解離した表 面を示した。このマセレーション下にある組織からｍＲＮＡを分離することは、 通常の方法によっては不可能であった。この理由は、多糖によりＲＮＡが高度に 汚染されていること、ＲＮＡの沈澱及び再溶解が乏しいこと、ＲＮＡの分解が高 レベルであること、ＲＮＡの収量が少ないこと及び労働と材料費とが相当のもの であることであった。しかし、既存の方法を変形し、新しく組み合わせることに よって、たとえ多糖を含む組織からでも、多量の劣化していないＲＮＡを、比較 的少ない材料費と消費時間とによって得ることかできる技術を発展させることか できたエルウィニアによって培養したグラノラ（ｇｒａｎｏｌａ）種のジャガイ モの傷を付けた塊茎からの洗浄ポリＡ“ＲＮＡを基として、ｃＤＮＡバンクを構 成した。分化コロニー　ハイブリッド形成技術を用い、４０００のｃＤＮＡクロ ーンを、非損傷及びエルウィニア損傷した塊茎からの放射線標識ＲＮＡによって ハイブリッド形成した。二種のクローンを同定し、ここでｗｕｎｌ及びｗｕｎ２ と名づけ、このうち相補的ｍＲＮＡを、種々の４倍体ジャガイモ種及び単数体種 ＡＭ　８０１５７９３の塊茎を傷付けることによって誘導した。

塊茎を機械的に損傷した後に３０分間の間蓄積したｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡを、こ うして損傷によって誘導された一次プロセスに供し、この一方ｗｕｍ２を損傷の 後３．５時間誘導した。損傷の２４時間後、双方のクローンは、むしろ一層高い ｍ−ＲＮＡ濃度を示した。この機械的損傷に加え、アトロセプテイカ（ａｔｒｏ ｓｅｐｔｉｃａ）種のエルウィニア　力ロトヴオラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏ ｔｏｖｏｒａ）によって塊茎を培養すると、その形質発現パターンには変化は見 られなかった。

また、塊茎についてこの形質発現研究の明らかにする所では、ｗｕｎ　ｌ−ｍＲ ＮＡ及びｗｕｎ２−　ｍＲＮＡは、エルウィニア特異的に誘導される遺伝子では なく、塊茎組織の破壊に至るすべてのプロセスによって刺激される遺伝子を示す 。

ｗｕｎ　ｌ−ｍＲＮＡは、傷付いたジャガイモ塊茎中に多量に蓄積する（傷付い ていないジャガイモ塊茎中におけるプロテイナーゼ阻害剤ＩＦ−ｍＲＮＡと匹敵 できる程度の量で：サンチェスーセラノ等（Ｓａｎｃｈｅｚ−３ｅｒｒａｎｏ　 ｅｔ　ａｌ）、ｒＭｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、Ｊ　２０３２．１５（１９ ８６）参照）；シかるに、傷付いていない塊茎中では、検出されなかった。これ は最初は損傷の後３０分に現れ、損傷の後４時間及び２４時間の間が最大であっ た。４８時間後でさえも、より少ない量で検出可能であった。

損傷の後のｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡ及びｗｕｎ　２−　ｍＲＮＡの蓄積は、塊茎に 限らず、種々の４倍体ジャガイモ植物の葉、茎及び根においてもまた、同程度の 反応速度及び強度をもって生ずる。

ｗｕｎ　２　、　ｍＲＮＡに対して、ｗｕｎ　！−ｍＲＮＡは、傷が存在しなく とも、親和性のフィトフトラ　インフェスタンス（ｐｈｙｔｏｐｈｒｏｒａ　１ ｎｆｅ−ｓｔａｎｓ）胞子を葉にスプレーする場合には、葉中に誘導される。

この結果の示すところでは、ｗｕｎ　１は機械的損傷を通じてだけではなく、（ 菌性の）病原体の存在を通してもまた誘導することができる。

塊茎を好気性条件下に傷つけたか（塊茎のスライスにｐ−緩衝液をスプレーし、 １８時間培養し、次いで空気に曝した）、又は嫌気性条件下に傷つけたか（塊茎 のスライスをｐ−緩衝液中に浸漬し、この酸素欠乏条件下に１８時間培養した。

）によって、このｗｕｎｌ−遺伝子の発現に相違があった。ｗｕｎ　１−　ｍＲ ＮＡ形質発現は、好気的に傷つけた塊茎における方が、これに対応する嫌気性条 件におけるよりも、顕著に高い。

本発明に従って遺伝子の形質発現のためのプロモーターを使用するためには、検 出可能なｗｕｎ　１−　ｍＲＮＡ又はｗｕｎ　１−　ｍＲＮＡか新しい合成を通 して発生するか（転写調節）、又は傷つけた場合においてのみ構成的に形質発現 し、安定化するか（転写後調節）が重要である。

「ランオフ」転写試験により、ｗｕｎ　１及びｗｕｎ　２の双方に対して転写調 節を証明することかできた。これは、これらの遺伝子のプロモーターが、傷つけ た場合に新しい合成の原因となっていることを示す。

既知の技術を用い、４倍体のジャガイモ「グラノラ（ｇｒａｎｏ　１ａ）」から 、一連のｗｕｎｌ相同性ｃＤＮＡクローンを得、これらのうち幾つかをこれから 配列した。Ｍ１３ｍｐ　１９−ファージ中でｗｕｎｌ−２５Ａ２を双方向及び部 分エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化でクローニングすることにより、このヌクレオ チド配列を、ジデオキシ法に従って双方向て分析した。

第１図は、配列の決定に用いたクローンの相対的なサイズを示す。このクローン ｗｕｎｌ−２５Ａ２が、非対称のＸｈｏ　Ｉセクションの位置に対して、２４　 Ａ２　＊九！　ＰＩ３及び２５　Ａ２　Ｍ　ＰＩ３と呼ばれる位置の、Ｐ、、Ｉ 一部位で二方向でクローニングされた。

逐次エキソヌクレアーゼ１０消化を用い、異なるサイズの欠損クローンを得るこ とが可能であり、これらは、配列の決定用のクローン２５Ａ　２１Ｍ　Ｐ１９デ ルタ１〜３及び２５　Ａ　２Ｍ　Ｐ１９デルタ１〜４として得られた。

第２図は、ｃＤＮＡ−クローン−ｗｕｎｌ　−２５Ａ　２のヌクレオチド配列を 示す。選択的な転写解読枠には下線を引く。

このｃＤＮＡ−クローン−ｗｕｎｌ−２５Ａ　２のサイズは７１１　ｂｐ、であ る。この３−末端は、１４ｂｐのポリーＡテイルである（位置６９７〜７１１） 。この最も大きい転写解読枠は、１０５アミノ酸を越えて延びる（位置１２１〜 ４３８）。更に、５′位置では、位置２３で３つのアミノ酸をコードし、位置９ ５で８つのアミノ酸をコードする二つの短い転写解読枠がある（下線）。しかし 、ここで言及した最後の二つの転写解読枠は、１０５アミノ酸をコードするもの とは相違する。ゲノム配列データを参照すると（第６図）、ｌ。

５アミノ酸をコードする解読枠は、ｗｕｎｌ−タンパク質に関連している。ジョ ン（Ｊｏｓｈｉ）、ｒＮｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ　１５．６６４３　 。

（１９８７）によって報告されたように、ｗｕｎｌ−タンパク質の翻訳開始点Ｔ ＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡは、植物翻訳開始用の共通配列ＴＡＡＡＣＡＡＴＧ　Ｇ ＣＴに対し、僅かにしか適合しない。

単数体ジャガイモ系統ＡＭ　８０１５７９３におけるｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡをコ ードする遺伝子のゲノム組織の試験が示すところでは、この遺伝子は、僅かに限 られた数のコピーでしか得られない。　Ｈｉｎｄ［［Ｉ−、ＰｓｔＩ−及びＥｃ ｏＲＩ−消化された葉ＤＮＡに対する、放射能で標識したｗｕｎ　ｌ−ｃＤＮＡ のハイブリッド形成により「サザンプロットｊ分析において、一つの強いバンド と一つ又は二つの弱いバンドとの規定が得られる。ｗｕｎｌ−及びｗｕｎ２−　 ｃＤＮＡのこの［サザンプロット」分析の結果を、第３図に図示する。

この単数体ジャガイモ系統Ａ　Ｍ　８０１５７９３に対し、この「サザンプロッ ト」分析は、ｗｕｎｌ−及びｍｕｎ２−　ｍＲＮＡの発現の原因となる幾つかの 遺伝子のみを同定することができた。ここでは、活性の遺伝子を得て不活性な偽 遺伝子を得ない見込みは特に高い。

この単数体ジャガイモ系統の「サザンプロット」において僅かに一つの規定され たバンドが存在することは、ゲノム当りの遺伝子の数か限られていることを示す 。もしこれを、この単数体系統中のｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡの高くかつ優待異性の 形質発現及び転写制限と共に考慮するならば、高度に活性の遺伝子となりそうで ある。

ゲノムバンクを構成するため、ＡＭ　８０１５７９３からのＥｃｏＲＩ−消化Ｄ ＮＡ　１０マイクログラムをＥｃｏ　ＲＩ−消化ＥＭＢＬ４−アームに連結し、 Ｃ６００細菌含有培地上でコロニ形成した。統計的に考えてこのジャガイモのゲ ノムを代表する約５００．０００のプラークを得た。これらのプラークをニトロ セルロースへと転移させた後、放射能で標識したｗｕｎｌ−ｃＤＮＡを用いたプ ラークハイブリッド形成技術によって、ゲノムクローンｗｕｎｌ　−２２及びｗ ｕｎｌ　−８５の同定及び精製を可能とした。

ｗｕｎｌ　−２２及びｗｕｎｌ　−８５からの組換え体ＥＭＢＬ　４−ＤＮＡの 分離、及び放射性ｗｕｎｌ　−ｃＤＮＡによるその制限マツピングとハイブリッ ド形成とにより、次の有機体が得られた。

ｗｕｎｌ　−８５におけるｗｕｎ　１−　ｃＤＮＡ等価フラグメントは、４Ｋｂ のサイズを有する。これは、単数体ジャガイモからのＥｃｏＲＩ−消化ＤＮＡの フラグメントサイズ（ｗｕｎｌ　−ｃＤＮＡによってハイブリッド形成）と正確 に対応する。このｃＤＮＡ−クローンの５′領域における非対称のＸｈｏ　Ｉ部 位に基づいて、この４Ｋｂフラグメント中の遺伝子の配向を確定することかでき た。これに従うと、概略１ｋｂのサイズのプロモーター領域がｗｕｎｌ−遺伝子 の上流にあり、一方、概略２ｋｂのサイズの非相同部分か遺伝子から３′に位置 している。やはりｗｕｎｌ　−８５中に含有されている８Ｋｂの大きさのＥｃｏ Ｒ［フラグメントは、このｗｕｎｌ遺伝子を更に分析するためには使用できなか った。ＥｃｏＲＩによるジャガイモＤＮＡの全消化に基づくと、連結の間、共に 属しない二つのフラグメントはＥＭＢＬ　４−ベクター中へと挿入され、これら のフラグメントが互いに機能的に関連し合っていないらしい。

第４図は、ゲノムクローンｗｕｎｌ　−８５中におけるｗｕｎｌの配列を示す。

ゲノムクローンｗｕｎｌ−８５の４Ｋｂの大きさのＥｃｏＲＩフラグメント上に 位置するのは、１．ＯＫｂのｗｕｎ　１−プロモーター、０．８Ｋｂのｗｕｎ　 １遺伝子及び２．ＯＫｂの３′−末端である。

制限パターンにおいてはｗｕｎｌ　−８５とｗｕｎｌ−２２との間には相違が現 れないので、更なる分析のため、ｗｕｎｌ　−８５の４Ｋｂのフラグメントを、 ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ８中へと連結させた（第４図参照）。ｗｕｎｌプロモータ ー及びｗｕｎ　１遺伝子の配列を決定するため、これに続いてＭ２Ｓ　ｍｐ１８ のＥｃｏＲ［部位て４Ｋｂフラグメントを更に再クローニングした。その方向性 の決定を、非対称に配置されたＸｈｏ［部位で使用した対照消化によって実施し た。クローン８５　＊ｍｐｔｓ及び８５　ｍｐ１８は、共にフラグメントの方向 性を示す。Ｓｐｈ［及びＸｂａ　Ｉによるこれらのプラスミドの消化は、エキソ ヌクレアーゼＩＩＩの助けによって、クローン８５ｍｐ１８のｗｕｎｌ遺伝子の ３′末端、及びクローン８５＊ｍｐ１８のｗｕｎｌ遺伝子の５′末端を逐次消化 することを可能にした。

第５図は、クローンｗｕｎｌ　−８５の欠損分析の結果を図式的な形で示す。

異なるフラグメントサイズを有する、こうして得た欠損クローンを、配列の決定 のために使用した。一般に、ｗｕｎｌ遺伝子全体を双方向的に配列決定すること ができ、かつ、これに加えて、３′末端のうち約４００　ｂｐを単方向的に分析 することができた。

第６図は、ｗｕｎｌ−８５からのｗｕｎ　１プロモーターと遺伝子とのヌクレオ チド配列を示す。ＣＡＡＴ−ボックス、ＴＡＴＡ−ボックス及びボＩＪ−Ａ信号 を示し、また転写開始及び停止部位を矢印でマークする。ｗｕｎ　１遺伝子の正 確な転写開始部位を同定するため、８１−ヌクレアーゼ−マツピング法を採用し た。第７図は、ｗｕｎ　ｌ遺伝子のＳ１保護フラグメントのサイズの決定結果を 示す。Ｘｈｏ［部位から５′にあるｐＬｓＯＯＯ中の領域のｗｕｎ　１−ｍＲＮ Ａとのハイブリッド形成は、１６２〜１７９　ｂ　Ｉ）の長さのＤＮＡ−ＲＮＡ −ハイブリッド（ＴＯ）をもたらし、これは一本鎖の特異的Ｓｔ−ヌクレアーゼ から保護される。ここで、実際の転写開始部位は、Ｘｈｏｌセクションの配置か ら５′の１６２〜１９７　ｂｐにある（Ａ、Ｃ。

Ｇ、　Ｔは、ＤＮＡフラグメントをサイジングするための配列配置である。

もし得られたうち最も長いフラグメントから始めるとすると、そのときは転写開 始は、ＸｈｏＩ位置から１７９　ｂｐ上流、即ち、配列ＡＣＣＡＴＡＣで始まる 。この配列は、ジョン等（Ｊｏｓｈｉ　ｅｔａｔ）　（１９８７）によって発見 された、共通配列又は転写開始ＣＴＡＡＴＣＡとその中心領域（ＣＡＴ）におい て充分一致する。

この転写開始の位置から、更に情報が得られる（第６図参照）。

（１）位置３３で、転写開始から解るように、ＴＡＴＡ−ボックス１２７〜１４ ２　（１９８０）に記載された、−６０及び−８０の間の領域内のＣＡＡＴボッ クスが、ｗｕｎｌプロモーター中の一５８位置（ＣＡＡＡＣＴ）に見出される。

（３）　ｗｕｎｌ遺伝子の５′−非翻訳領域が２１７　ｂｐのサイズを有し、従 って、比較的大きい。

（４）このｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡをコードした遺伝子は、　ｒノーザンプロット 」分析に基づけば７９４ｂｐのサイズであり、これはｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡのサ イズに非常に近く対応している。

（５）　ｗｕｎｌ遺伝子の９７ｂｐの５′非翻訳領域は、ｃＤＮＡ−クローン、 ｗｕｎｌ　−２５Ａ２中では失われる。

（６）　ｃＤＮＡ−クローン中で既に決定された転写解読枠は別として、ゲノム クローンの５′非翻訳領域中に他のものは見られない。

（７）　ｗｕｎｌ遺伝子はイントロンを含有しない。

第８図は、ｗｕｎ　１遺伝子中の重要領域の配列及び位置を示す。

ｗｕｎｌプロモーターは黒色でマークし、一方ｗｕｎ　１遺伝子はハツチングす る。重要な認識配列をボックスにする。ｍＲＮＡを波線によって示し、一方タン パク質コーディング領域をＸｅｓでマークする。各領域のサイズは、塩基対（ｂ ｌ））で与える。

第９図は、ｃＤＮＡ−クローンｗｕｎｌ　−２５Ａ２とゲノムクローンｗｕｎｌ −８５との間の配列比較を示す。２３６８ｂｐのゲノムクローンｗｕｎｌ　−５ を、７１１ｂｐのｃＤＮＡクローンｗｕｎｌ　−２５Ａ２と比較した。相同の塩 基対に垂直線で印をつける。失われたヌクレオチドをピリオドで示す。二つの矢 印は、ｃＤＮＡ−クローン中の二つの１Ｏ−ｂｐ力方向配列を示す。

比較分析の示すところでは、単数体ジャガイモＡＭ８０１５７９３のゲノムクロ ーンｗｕｎｌ　−８５の配列は、４倍体ジャガイモ「グラノラ（Ｇｒａｎｏｌａ ）　ＪのｃＤＮＡ−クローンｗｕｎｌ　−２５Ａ２の配列と９７％相同にものぼ る。また、１１の塩基対変化を同定し、このうち５つが翻訳領域中に位置してい た。この翻訳領域内で５つの塩基対のすべてが変化する結果、アミノ酸配列は変 化しなかった。この翻訳停止の下流に更に配列された４００のヌクレオチドは、 顕著な領域を示さない。

この遺伝子は１２０００　ドルトンのタンパク質をコードし、このサイズは、ハ イブリッドーリリースト翻訳（ＨＲＴ法）実験てほぼ測定できる。このｗｕｎｌ タンパク質のアミノ酸の組み合わせに対するコンピューター評価は、これか非常 に親水性のタンノくり質であることを示す。このアミノ酸配列を第２図及び第６ 図に示す。

ｗｕｎｌ−タンパク質のサイズ、その親水性、種々の組織におけるその傷誘導性 及びその病原体による誘導性は、このタンノ（り質かＰＲ−タンパク質に属して いるという事実に基づいて結論づけることができる。

ＲＲ−若しくは「病原生成に関連した（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔ ｅｄ）」タンパク質という名称は、なかでも、病原体の攻撃によって誘導可能で あり、またある場合には、キチナーゼ活性又はグルカナーゼ活性、即ち、菌類の 細胞壁を破壊しうる酵素活性を示す、各種の植物のタンパク質を含む。

トランスジェニックタバコ植物体のアブロバフタ−形質転換系を用い、ｍＲＮＡ レベルで形質発現を研究することができた。タバコ−ｍＲＮＡは、ＳＬヌクレア ーゼ−マツピングから集められつるように、ｗｕｎ　ｌと非常に弱くしか交差反 応せず、更にｗｕｎｌ相同性の５′末端を全く有していないからである。実際に は、多量の約５ｏｏｂｐの大きさのｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡをトランスジェニック タバコ植物体の傷ついた葉中に検出し、これは一方では活性ｗｕｎｌプロモータ ーを示し、他方では正確な転写開始点の使用を示す。

ｗｕｎ　１プロモーター、完全なｗｕｎｌ遺伝子、及び遺伝子（ｗｕｎｌ−ｗｕ ｎｌ）の３′領域２Ｋｂを含有する、ｐｔ、５ｏｏｏからの４Ｋｂのフラグメン トを、可動化ベクターｐＭＰＫ１１０中そのＥｃｏＲ１部位でクローニング（１ ）ＬＳＯＯＩ）　した。これは、種類かんしゆ病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＸＡｔ）形質転換に必要である。Ａｔ３８５０．、へ の転移の後、タバコ系続つイスコンシン３８（Ｗ２Ｂ）を、リーフディスク上こ のアブロバフタ−で形質転換した。カナマイシン選択の三週間程後に現れる小さ いカルスを、苗条誘導培地を用いて完全な植物（ＬＳＩ）に再生した。

カナマイシン上で成長する能力は別として、３８５０−で形質転換した植物体は ツバリンを合成する能力を有しており、この特性かこれらを形質転換していない 植物から区別する。（ザンブリスキー等：　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、 　ｒＥＭＢＯＪ、　Ｊ±１４７〜１５２（１９８５））。

ここでＬＳＩ植物体（４＝ＬＳＩ−４、６＝ＬＳＩ−６）と名付けた、ｗｕｎｌ −ｗｕｎ　１形質転換植物体は、高レベルのツバリンによって特徴付けられた。

対照的に、形質転換していない植物体中ではツバリンは検出されなかった。カナ マイシン耐性及びツバリン陽性のＬＳＩ植物体を温室へ移し、ＤＮＡ及びＲＮＡ 面上で分析した。

第１０図は、遷移的な形質発現及び安定な形質転換に基づく形質発現の研究に使 用したｗｕｎｌ−ｗｕｎｌ融合及びｗｕｎｌ　−ＣＡＴ融合の構成体を示す。

（１）プラスミドｐＬ≦００１の創成ニブラスミドｐＬｓＯＯｏで始め（第４図 参照）　、ｗｕｎｌプロモーター、ｗｕｎｌ遺伝子及び２Ｋｂの３′末端を含有 する４Ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＭＰＫ１１０のＥｃｏＲＩ部位内でク ローニングした（ｐＬＳｏｏｌ）。

（２）プラスミドｐＬｓＯ１１の創成：ｗｕｎｌプロモーター、及び１７９８Ｐ の５′非翻訳ｗｕｎ　１遺伝子領域を、ＸＨＯ［部位てＣＡＴ遺伝子含有３′末 端と共に融合させた（ｐＬＳｏｌｏ）。Ｐｓｔ　Ｉ（ｐＬｓＯｌｌ）を使用した ベクターｐＭＰＫ１１０中でサブクローニングによる利益は、このプラスミドか 、プロトプラスト中での遷移状態の研究に利用できること及び更にアブロバフタ −３８５０□中へのｗｕｎｌ　−ＣＡＴ構成体の転移に対する可動化プラスミド としてふるまいうることである。

トランスジェニックＬＳＩ　タバコ植物体及び形質転換していないＷ３８タバコ 植物体からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡの「サザンブロツト」分析の結果は、形質転 換していない植物体のＤＮＡ及び形質転換した植物体のＤＮＡの両者において、 ３２ｐ放射性標識ｗｕｎｌ　−ｃＤＮＡプローブの使用による陽性のハイブリッ ド形成であった。双方の場合において、強いバンドと弱いバンドとを確認した。

しかし、トランスジェニックＬＳＩの植物体においては、更に４Ｋｂの大きさの バンドがあり、そのサイズは、ｐｔ、５ｏｏｏからのＥｃｏＲＩ挿入体のサイズ に正確に対応していた。異なるＤＮＡ量を比較することによって、すべての試験 ＬＳＩ植物体において、ｗｕｎｌ　−ｗｕｎｌの２〜５の数のコピーが現れた。

幾つかのＬＳＩ植物においては、おそらく再配列ＤＮＡ又は非消化ＤＮＡに起因 する、高分子領域のバンドが更に見出された。

陽性ＬＳＩ植物のｗｕｎｌ　−ｗｕｎｌ　−ＤＮＡの機能分析が、ＲＮＡレベル で可能であった。傷ついた状態及び傷ついていない状態の、形質転換していない タバコ植物の双方において、ｗｕｎｌ　−ｃＤＮＡ−プローブとは弱い交差反応 しかなかった。更に、非翻訳タバコ植物体からの分離ＲＮＡについて（ｗｕｎ　 １遺伝子用に転写開始を決定するためのフラグメントに相同な）　ｗｕｎｌプロ モーター及び５′非翻訳領域を含有するｗｕｎ　１遺伝子の５′領域に対して相 同領域上で８１分析を用いて試験を実施した。これの示すところでは、傷ついて いない又は傷ついた、形質転換していないタバコ葉又は茎のいずれにおいても、 ｗｕｎｌ相同性の配列は存在しなかった。

ＲＮＡレベルで研究した３０のツバリン陽性ＬＳＩ植物体の外、「ノーザンプロ ット」実験により、ＷＵ口ｌとハイブリッド形成した５ｏｏｂｐの大きさのｍＲ ＮＡを高レベルで有する５つの植物体を検出した。後者の３１分析により、傷つ いたジャガイモ葉からのフラグメントにサイズにおいて対応する、二つの同等の 大きさのＤＮＡフラグメントの証拠がもたらされた。これは、ｗｕｎｌ相同性の ｍＲＮＡとなる証拠である。幾つかの指標は、ｗｕｎ　１相同性ｍＲＮＡが形質 発現して大規模なＴＭＶ攻撃を中和するという考えを支持するものであった。

本発明の一つの目標は、所望の特性を有する融合タンパク質を形質発現させる能 力を持つ遺伝子を構成し、分離することである。このためには、ｗｕｎ　１プロ モーターだけが３′融合構造遺伝子の形質発現の原因となる必要かあり、常にそ うであるとは限らない（例えば、ブロティナーゼ阻害剤■）。

ｗｕｎｌプロモーター及び１７８ｂｌ）の５′非翻訳遺伝子からなる転写融合体 は、種々の標識マーカー遺伝子（ｗｕｎｌ−ＣＡＴ、　ｗｕｎｌ　−ＮＰＴ、　 ｗｕｎｌ−ＧＵＳ）と融合した。この証明は、放射性又は螢光定量法によって可 能であった。ＧＵＳは、β−グルクロニダーゼを示す名称である（ジェファーソ ン等：　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　ｒＰｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８３．８４４７〜８４５１（１９８７））。

ｗｕｎｌ　−ＣＡＴ構成体を、ジャガイモプロトプラストにおける遷移形質発現 について試験した。この方法により、数日内でプロモーター活性の分析か可能と なった。このため、この構成体を含有する高度に精製したプラスミドＤＮＡを既 知の方法によってプロトプラスト中へと転移させ、そこに安定条件で残留させ、 転写及び翻訳させることができる。形質発現のために必要なのは、プロモーター が機能性であり、この方法で取り扱ったプロトプラスト中に誘導因子が存在する ことである。

これらの試験において、１７９ｂｐの５′非翻訳領域を含む、ｗｕｎｌプロモー ターは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）と 転写融合させた。このｗｕｎｌ　−ＣＡＴ融合体の構成を第１０図に示す。

Ｈｉｎｃ２　／ＸｈｏＩを用いてＩ）ＲＴＩＯＩ　−ＣＡＴプラスミドの３５３ プロモーターを除去し、この代わりに、１７９ｂｐの５′非翻訳領域と共に１． ＯＫｂサイズのｗｕｎ　１プロモーターを、満たされたＥｃｏＲ１部位及びＸｈ ｏ［を用いて挿入した。このキメラ遺伝子ｗｕｎｌ　−ＣＡＴを、ベクターｐＭ ＰＫ１１０のＰｓｔ１部位中へと挿入することができた（ｐＬＳｏｌｌ）。

多量の内因性ｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡを、遷移形質発現実験用のジャガイモ細胞懸 濁液中で検出し、これから由来するプロトプラスト中でも同様であった。結論と しては、細胞の液体培養は、特にブロトプラスティング工程は、細胞中に高い応 力を作り出し、このことは、ジャガイモ塊茎におけるプロセスと相同的に、ｗｕ ｎ　１−　ｍＲＮＡの収量か大きいことによって示される。

ｗｕｎｌ　−ＣＡＴ構成体の遷移分析のために、変種ダチョウ（Ｄａｔｕｒａ） （ＤＩ２）のジャガイモ茎の懸濁培養液から１．０００．０００のプロトプラス トを分離し、次いでＣａ１ｌ□／ＰＥＧ法を使用し、２０マイクログラムのｐＬ ｓＯｌ　１−　ＤＮＡを加えて形質転換した。

ｐＬｓＯｌｌ　−ＤＮＡで形質転換したこうしたプロトプラストをＣＡＴ分析す ると、高いＣＡＴ活性が示された。ＣＡＭＶ−３５Ｓ　−ＣＡＴ構成体（カリフ ラワーモザイクウィルス（ＣＡＭＶ）からの３５３プロモーター）（１）ＲＴＩ ＯＩ　−ＣＡＴ）を用いた並行的な試験で、はぼ同様のＣＡＴ活性か示され、こ の一方ＤＮＡを添加しない対照試験では、ＣＡＴ活性は検出されなかった。これ か意味するのは、遷移的なジャガイモプロトプラスト系においては、ｗｕｎｌプ ロモーターの活性か３５３プロモーターの活性に匹敵し、従って非常に高いもの として分類しなければならないことである。現在に至るまで、ＣＡＭＶプロモー ターは、植物体における既知の最も強力なプロモーターで在りつづけている。

既に遷移系で用いた、プラスミドｐＬｓＯ１１（ｗｕｎｌ　−ＣＡＴ）を、Ａｔ ３８５０□の形質転換のために更に使用した。リーフディスク感染法を用いてタ バコ種サムスン（Ｓａｍｓｕｍ）ＮＮ（ＳＮＮ）を形質転換するために、３８５ ０．、、：　：　ｐＬｓＯ１１アグロバクターを使用し、こうして得たカルスを 植物体（ＬＳ２）にまで再生した。

タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）に対して耐性のあるこの特殊なタバコ種を使 用することによって、Ｔλ（■によるｗｕｎｌの（疑わしい）誘導性を排除しな ければならない。ツバリン陽性でカナマイシン耐性であるＬＳ２植物体において 、ＤＮＡレベルとＣＡＴ活性の存在について試験を行った。ｗｕｎｌ　−ＣＡＴ 形質転換された植物体からのＰＳｔｌの消化ＤＮＡは、ＣＡＴ　−ｃＤＮＡとハ イブリッド形成した２、　２Ｋｂのサイズのフラグメントを示す。これは、ｗｕ ｎｌ　−ＣＡＴの予期されたフラグメントサイズと正確に一致する。形質転換し ていない植物中ではハイブリッド形成を検出出来なかった。ＤＮＡ量を比較する ことによって、すべての陽性の植物体中に単数体ゲノム当り２〜４個のコピーを 見出した。

ＬＳ２植物体の機能分析を、温室の植物体中及び無菌培養下に成長したＦ１世代 の植物体中におけるＣＡＴ活性の測定と共に続行した。温室中で育てたＬＳ２植 物体は、それらの傷つけていない葉において、形質転換していないタバコ葉の背 景活性と比較して、僅かなＣＡＴ活性の増加を示した。傷つけた葉においては、 傷つけていない葉に比較して約４倍高いＣＡＴ活性を記録した。

しかし、この損傷条件に対して過剰の煮つめたジャガイモ塊茎抽出物を加えると 、傷つけていない状態よりも６倍の高さまで増大した。この作用は、抽出に先立 つ塊茎の状態からは独立であった（傷つけていない又は傷つけた塊茎を、地面か ら新しく又は貯蔵庫から採取した）。各抽出物は同じ誘導作用を有しており、抽 出物中に誘導体か恒久的に存在していることを示していた。

トランスジェニックタバコ植物体中のｗｕｎｌ　−ＣＡＴの誘導性が比較的に低 い原因は、傷つけていない葉の活性において理解されるべきものである。温室に よって決定される可能な原因を排除するため、ＬＳ２植物体の種子を刈り入れ、 次いで無菌条件下に発芽させた。カナマイシン耐性の植物体の若い葉において、 非損傷条件では非常に弱いＣＡＴ活性を測定できたが、これは形質転換していな い葉のＣＡＴ活性から大きく異なってはいない。

傷つけた葉においては、ＣＡＴ活性が少なくとも４０の係数だけ上昇する。損傷 条件に対して均一なジャガイモ塊茎から煮詰めた抽出物を加えると、ＣＡＴの蓄 積量か６０倍高くなる。

更に、銘記すべきことに、植物体の年齢が増加すると、葉の中のｗｕｎｌプロモ ーターの活性がますます高くなり、このためその強度がトランスジェニックＣＡ ＭＶ　−ＣＡＴ植物体の強度に等しくなった。ここに、老化もｗｕｎ　１を誘導 する能力を持つ可能性かある。

遷移系の助けによって、この植物体種子においてｗｕｎ　１プロモーターが活性 であり、相応に有用であることを決定するために更に試験を行った。明らかとな ったところでは、このプロモーターは、ジャガイモプロトプラスト、タバコプロ トプラスト及びパセリプロトプラスト中において活性であるだけでなく、その相 同系における活性と同様に米プロトプラスト中で高い形質発現を示した。

第１１図は、ｗｕｎｌ　−ＮＰＴＩＩ構成体の創成を示す。プラスミドｐＬＳＯ ＯＩから初め、ｗｕｎｌプロモーターを、ＮＰＴ−２遺伝子（ネオマイシンホス ホトランスフェラーゼ−２）のＥｃｏＲＩ　−ＸｈｏＩ−プラントで１７９ｂｐ の５′非翻訳領域を含みクローニングする。遷移実験における取り扱いを向上さ せるために、このｗｕｎｌ　−ＮＰＴ−２融合体を、高コピープラスミド（ｐＬ ｓＯ２０）中で再クローニングした。

ｗｕｎｌ　−ＮＰＴ２構成体を使用し、タバコ及びパセリプロトプラスト中てＮ ＰＴ−２活性を見出した。興味深いことに、ｗｕｎｌ依存性のＮＰＴ−２活性も また米プロトプラスト中で検出され（オリザ　サテイバ　ジャポニカ　Ｃ，Ｖ、 　タイペイ）、この活性はその強度においてジャガイモプロトプラストにおける ｗｕｎｌ　−ＮＰＴ２活性に匹敵した。米プロトプラストにおけるｗｕｎｌ　− ＮＰＴ２及びＮＯ３−ＮＰＴ２（１）ＧＶＩ　１０３）の類似の遷移形質発現も 同様に、類似の高い値を示した。この関係において、ジャガイモプロトプラスト 中の遷移形質発現がＣＡＭＶ−３５Ｓ−ＣＡＴと同様に再び示された。一般的に 言えば、これらの研究か示しところでは、ｗｕｎｌプロモーターは、相同系及び 異種系の双方において、少なくとも幾分かは、非常に高い活性を持つことかでき る。パセリプロトプラストにおいても、タバコプロトプラストにおいても、米プ ロトプラストにおいても、ｗｕｎｌとハイブリッド形成したｍＲＮＡを見出すこ とはできなかった。従って、ｗｕｎｌプロモーターを刺激するある因子が、すべ ての試験植物体試料中で同じように得られると推測する他はない。

一般的に言えば、傷誘導の後に続く融合遺伝子を多量に形質発現できるようにす るためのすべての重要なりＮＡ領領域、ｗｕｎｌの５′領域で得られる。

更に、多様な遷移系（ジャガイモ、パセ１ハタバコ、米）及び安定な形質転換し たタバコにおけるｗｕｎｌ　−ＣＡＴ及びｗｕｎｌ　−ＮＰＴ２の機能により、 類似の分子的背景の仮定か導かれる。

上記した本発明の枠組みの中で、実験が更に明らかにしたところでは、この発明 のｗｕｎ　ｌプロモーターを他のプロモーター又は促進要素と融合させることが 有利でありうる。

例えば、ｗｕｎ　１プロモーターを、種類がんしゅ病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ− ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　ＴＲ−ＤＮＡの既知のＴＲプロモーター と融合させる。

種類かんしゆ病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　 ＴＲ−ＤＮＡからのこのＴＲプロモーターの分離は、ジエイ、ヴエルテン及びジ エイ、シエール（Ｊ、　Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄ　Ｊ、　５ｃｈｅｌｌ）の仕事で ある［高等植物体の遺伝子形質転換に使用する選択的遺伝子発現ベクター　：　 ５ｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｕｓｅ 　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎ−ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｇｈｅ ｒ　Ｐｌａｎｔｓ）（ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　１３　：　６９ ８１〜６９９７に発表）から知られている。この文献から、このプロモーターが マンノピンシンターゼの形質発現の原因であり、かつ次の特性を示すことも知ら れている。

（１）これは双方向的に活性であり、即ち、もし構造遺伝子が両側で融合すれば 、同じ調節方法と強度とで両方がリードオフできる。この関係では、次の文献を 参照しなければならない：ラングリッジ、ダブリュー、エイチアアール（Ｌａｎ ｇｒｉｄｇｅ。

Ｗ、　Ｈ，Ｒ，）　、　フィッッジェラルド、ケイ、ジエイ（Ｆｉｔｚｇｅｒａ ｌｄ。

Ｋ、　Ｊ、　）　、：２ンツ、シー（Ｋｏｎｃｚ、　Ｃ，）、シエール、ジエイ （Ｓｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　）及びスザレー、エイ、エイ（Ｓｚａｌａｙ、　Ａ、 　Ａ、）（１９８９）、ｒ根頭がんしゅ病菌マンノピンシンターゼ遺伝子の双方 向プロモーターは植物成長ホルモンによって調節される：　Ｄｕａｌ　ｐｒｏｍ ｏｔｅｒ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｍａ ｎｎｏｐｉｎｅＳｙｎｔｈａｓｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂ ｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈａｒｍｏｎｅｓ　Ｊ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８６　：３２１９〜３２２３）。

このＴＲプロモーターの方向性は１′及び２′として決定された。

（２）トランスジェニック植物体においては、ＴＲプロモーターを傷によって誘 導できる。マーカー遺伝子ベーターガラクトシダーゼ（ベーターｇａｌ）とのＴ Ｒ２’の融合は、傷つけていない植物体におけるよりも傷つけたトランスジェニ ックタバコ植物体において、一層高いベーターｇａｌ活性をもたらした。

（３）　ＴＲ２’プロモーターの活性は、まず葉脈中で、従って葉の導管系中に 見出される。２．及び３．用に欠配を参照しなければならない：ティーリ、ティ ー、エイチ（Ｔｅｅｒｉ、　Ｔ、　Ｈ，）　＋　レフヴアスライホ、エイチ（Ｌ ｅｈｖａｓｌａｉｂｏ、　Ｈ，）　、　フランク、エム（Ｆｒａｎｃｋ、　Ｍ、 ）、ユーオティラ、ジエイ（Ｕｏｔｉｌａ、　Ｊ、）、　ヘイノ、ピー（Ｈｅｉ ｎｏ、　Ｐ、）　ｔパルヴア、イー、ティー（Ｐａｌｖａ、　Ｅ。

Ｔ、）、ヴアン　モンタギュー、エム（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、　）及 びヘレラー　エストレラ、エル（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、　Ｌ、） （１９８９）。

［１ａＣＺへの遺伝子融合が、トランスジェニック植物体におけるキメラ遺伝子 の新しい形質発現パターンを明らかにする：Ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ｔｏ　 １ａｃＺ　ｒｅｖｅａｌ　ｎｅｗ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　 ｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ ｓＪ　ＥＭＢＯ８：　３４３〜３５０゜ （４）　ＴＲＩ　’プロモーターの特性は、今日に至るまで、非常に集中的に研 究されたとはいえない。しかし、知られているところでは、ＴＲＩ　’プロモー ターはＴＲ２’プロモーターよりも約４〜７倍弱いが、これを別とすれば、これ らのプロモーターは双方共に類似の特性を有する。

ｗｕｎ　ｌプロモーターの定性的及び定量的な最適化を目指す研究の枠組内にお いて、ＴＲプロモーターをｗｕｎｌプロモーターと、方向性ＴＲＩ　’　−ｗｕ ｎｌで特異的に融合させた（第１２図）。

プロモーター活性の証拠として、標識遺伝子ＧｔＪＳ　（ベーターグルコロニダ ーゼ）を使用した（ＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ）。種類がんしゅ病菌（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）形質転換系を使用し、こ の構成体をタバコ中へと形質転換し、分析した。次の特性により、このタバコ植 物体かｗｕｎｌ−ＧＬＩＳ　）ランスジェニックタバコ植物体から区別される。

１０組織特異性が変化した。

ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ　Ｉ−ランスジェニックタバコにおいては、ＧＵＳ活性が主 として葉及び茎の表皮の中に見出された。ＴＲＩ　’　−ＧＵＳトランスジェニ ックタバコにおいて、このＧＵＳ活性が主として導管系内に局在化した。従って 、化学的な必要性に従って、遺伝子産物を組織の異なる場所に向けられる可能性 がある。これに対して、ＴＲＩ’　−ｗｕｎｌ−ＧＵＳ　トランスジェニックタ バコ植物体の傷誘導性は、ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ　トランスジェニックタバコ植物 体の傷誘導性に匹敵する。

２、一般に、トランスジェニックタバコの葉及びタバコの茎におけるＴＲＩ’　 −ｗｕｎｌプロモーターの活性は、ｗｕｎ　１プロモーターの活性よりも約１０ 倍高い。従って、このＴＲ１’　−ｗｕｎｌプロモーターは、植物体における遺 伝子形質発現のために得られる最も強いプロモーターの中に入る。

３．トランスジェニック双子葉植物体中のプロモーター活性が若干の問題を最近 提供している一方、現在に至るまで、単子葉植物体中で十分に活性であるプロモ ーターは僅かしかなかった（商業的に重要な穀類の植物体はこれに属する）。米 プロトプラストにおける遷移発現の研究（これらは、非常に入手か困難なトラン スジェニック米植物体における研究の替わりとなるものである）の示すところで は、ＴＲＩ　’　−ｗｕｎｌプロモーターは、ｗｕｎｌプロモーターよりも概略 ３０倍も高い活性を有する。これはより一層注目すべきことである。なぜなら、 双子葉植物体中で非常に強力な３５Ｓプロモーターでさえも、ここではＴＲ１’ 　−ｗｕｎｌプロモーターよりも３０倍も弱いからである。

従って、ｗｕｎｌプロモーターは、本発明に従って、例えば、ＴＲＩ’プロモー ターとの融合によって、次の特性のなかで変更又は最適化することができる。

（ａ）トランスジェニックタバコの葉又は茎の表皮中のｗｕｎｌプロモーターの 特異的な活性は、ＴＲＩ’プロモーターと融合させることによって、導管系を標 的とすることができる。

（ｂ）傷によって誘導されるためのｗｕｎｌプロモーターの容量は、融合によっ て変化しない。

（ｃ）トランスジェニックタバコの葉及び茎においては、ＴＲＩ’−ｗｕｎｌプ ロモーターが、ｗｕｎ　１プロモーター単独よりも約１０倍強い。

（ｄ）双子葉植物体（米）の替わりとしての遷移実験では、ＴＲ１’−ｗｕｎｌ プロモーターが、ｗｕｎｌプロモーターよりも概略３０倍強い。

本発明に従って、例えば、ｗｕｎ　１プロモーターをＣａｍＶ　−３５Ｓプロモ ーターの促進要素と融合させることによってｗｕｎｌプロモーターの形質発現を 増大させることができる。従って、例えば、ＣａｍＶ　−３５３プロモーターの 促進要素をｗｕｎｌプロモーターの５′末端で融合させると、トランスジェニッ クタバコ及びジャガイモにおいてｗｕｎｌプロモーターの活性の増大がもたらさ れる。

第１２図は、クローンｗｕｎｌ−ＧＵＳ、　ＴＲＩ’−ＧＵＳ及びＴＲＩ’−ｗ ｕｎｌ　−ＧＵＳの組織を示す。

第１３図は、傷つけた及び傷つけていないトランスジェニックタバコの葉のノー ザンプロット分析を示す。トランスジェニックタバコ植物体ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ 、　ＴＲＩ’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ　Ｎｒ、５及びＮｒ、　１１及び３５Ｓ− ＧＵＳの傷つけていない葉（ＮＷ）及び傷つけた葉（Ｗ）をＲＮＡの分離のため に使用した。それぞれの場合において、５０マイクログラムの全ＲＮＡを、１． ２％ホルムアルデヒドゲルを用いてゲル電気泳動法によって分離し、次いでナイ ロン膜へと移し、次いで放射線で標識したＧＵＳ−ＤＮＡプローブとハイブリッ ド形成させ、オートラジオグラム上て可視化した。（Ａ）２日間の長さの照射を 示す。（Ｂ）６時間の長さの照射を示す。

下記の実施例は本発明を明らかにするためのものである。

細菌用の培養培地： 細菌の成長のために使用した培地は、マニアティス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ 　ａｔ、）、ｒ分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ ｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ’ａｌ）Ｊ　（コールド　ス プリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリング、ハーバ−、ニューヨーク （１９８２））からのデータに基づいて設定した。

植物体培地： ここで使用する培地は、ムラシゲ及びスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄ　Ｓ ｋｏｏｇ）　ｒＰｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎ、Ｊ　１５，４７３〜４９７（１９ ６２ＸＭＳ）によって与えられた培地から由来した。

３ＭＳ：ＭＳ＋３９６シヨ糖 ３　ＭＳＣ：　ＭＳ＋　３９６シヨ糖、５００マイクログラム／ｍｌのクラフオ ラン（Ｃｌａｆｏｒａｍ） ＭＳＣＩＯ：　ＭＳ＋　２９６シヨ糖、　５００　フィクログラム／　ｍｌのク ラロファラン（Ｃｌａｒｏｆａｍ）、　０．２　ｖイクログラム／ｍｌのＮＡＡ 、　１　フィクログラム／ｍｌのＢＡＰ１００マイクログラム／ｍｌのカナマイ シンスルフェートＭＳＣ１５：ＭＳ＋２％シヨ糖、　５００　マイクログラム／ ｍｌのクラフォラン（Ｃｌａｆｏｒａｍ）、　１００　ｖイクログラム／ｍｌの カナマイシンスルフェート ＭＳＩ５　：　ＭＳ＋２％シヨ糖、１００マイクログラム／ｍｌのカナマイシン スルフェート 固体培地として、８ｇ／ｌのバクトー寒天を加えた。

系統及びベクター 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）系統： Ｂλ（Ｒ７１−１８：　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、　ｔｈｉ、　５ｕｐＥ　：　 Ｆ　’　（ｌａｃｉ　＠・ｚｄｅｌｔａ　Ｒ１５、ｐｒｏＡ”　Ｂ”　）　（メ ッシング等：　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４．３６４２〜２６４６（ １９７７））Ｃ６００：　＝ＣＲ３４（マ＝アティス等：　Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、　１９８２）ＧＪ２３　：　ＡＢ１１５７（Ｒ６４ｄｒｄｌｌＸｐ ＧＪ２８）　（ヴアン　ホード等：　ＶａｎＨａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭ ＢＯＪ、　２．４１１〜４１８．　（１９８３））アブロバフタ−（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉａ）系統：　Ｃ５Ｃ５８ＣＩｐＧＶ３８５０Ｋザンブプラスミド： 　ｐＵＣ８（ヴイエイラ及びメッシング：　Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓ　ｓ ｉｎｇ、ｒ遺伝子（Ｇｅｎｅｓ）　Ｊ　１９．２５９〜２６８（１９８２））ｐ ＭＰＫｌ　１０　（エックス等：　Ｅｃｋｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｒＭｏｌ、　Ｇ ｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、Ｊ　２０５．　１４〜２２（１９８６））ｐＲＴｌｏｌ　−ｃａｔ （Ｐｒｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｒ植物細胞報告：　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐ ｏｒｔｓ　Ｊ　、印刷中（１９８８））ｐＧＶ１１０３　（ヘイン等：　Ｈａｉ ｎ　ｅｔ　ａｔ、、　ｒＭｏｌ、　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、」１９９．　１６６〜１６８．　（１９８５））ファージ：ＥＭＢ Ｌ４　（フライシャラフ等：　Ｆｒ１ｓｃｈａｕｆ　ｅｔ　ａｌ、。

ｒＪ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ　１７０．　８２７〜８４２　（１９８３））Ｍ １３ｍｐ１８　（ヤニッシューペロン等：　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅｔ 　ａｔ、、ｒ遺伝子（Ｇｅｎｅ）Ｊ　３３．１０３〜１１９．　（１９８５）） ＭＩ３ｍｐ１９　（ヤニッシューペロン等：　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅ ｔ　ａｌ、、（１９８５）） 植物体： ソラヌム　ツベロスム （Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ＡＭ　８０１５７９３　（単数体） ベロリナ（Ｂｅｒｏｌｉｎａ）　（４倍体）ダチュラ（ＤａｔｕｒａＸＤ１２） グラノラ（Ｇｒａｎｏｌａ） ニコチニア　タバクム　ライスコンシン（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ　ｔａｂａｃｕｍ 　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）３８（Ｗ３８）サムスン（Ｓａｍｓｕｍ）ＮＮ（ＳＮＮ ）オリザ　サテイバ　ジャポニカ （Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）ｃ、ｖ、　タイペイ制限分析 、プラスミド分離、プラスミドＤＮＡのミニプレバレージョン、細菌の形質転換 等のような、すべての分子生物学的な標準法は、特に指示しない限りは、マニア ティス等（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、Ｘ１９８２）によって記述されたよう にして実施した。

植物組織の損傷 ジャガイモの塊茎材料を厚さ３ｍｍのスライス状に切断し、リン酸溶液（２０ｍ Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７，０，クロラムフェニコール（５０マイクログラム／ ｍｌ）を含む）中、１８時間２８℃で光のない状態で培養した。葉材料、茎材料 及び根材料を小片に切断し、これと同じ条件下で培養した。培養を完結させた後 、この材料を、直接に加工するか又は−７０°Ｃで貯蔵した。

傷つけていない植物組織 葉材料、茎材料、根材料及び塊茎材料を、生きた植物から除去した直後に加工す るか、又は液体窒素中で凍結して一７０℃で貯蔵した。

ジャガイモ塊茎の好気性損傷 「損傷」項のもとで記載したように処理し、ここで培養の間、塊茎のスライスを リン酸緩衝液で少したけ濡らした。この培養の後、ジャガイモの表面をブローし た。

ジャガイモ塊茎の嫌気性損傷 「損傷」項のもとて記載したように処理し、ここで培養の間、ジャガイモの塊茎 をリン酸緩衝液中に充分に浸漬した。この培養の後、これらの塊茎の表面は明る い黄色であった。

病原体に攻撃されたジャガイモの葉におけるｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡの発現ダチュ ラ（Ｄａｔｕｒａ）種の葉を葉茎て切除し、水中に茎と共に静置した。次いて、 これらの葉に、フィトフトラ（ｐｈｙｔｏｐｈｔｒａ）の胞子を含有する懸濁液 をスプレーした。異なった時間で、与えられた葉の完全なＲＮＡを分離し、「ノ ーザンスロットプロット分析」を用いて試験することかできた。三つの異なった 材料を使用した。

−水、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）和合性のフィトフトラ　インフェスタンス（ｐ ｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓ）種Ｐｉｔの胞子を含有している −　水、ダチュラ不和合性のフィトフトラ　インフェスタンス種Ｐｉ４の胞子を 有する −　水、胞子を添加しない（対照例） 葉を水及び不和合性ソイ１ヘフトラ種の胞子で処理した２時間後、ｗｕｎｌハイ ブリッド形成の強度をデンシトメトリー評価すると、ｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡの量 に４倍の上昇か示された。この４時間目から８時間目にかけて、この量はほぼ同 じに留まったが、この後３００時間目かけて１．５〜２倍の値へと向かって緩徐 に下降した。

胞子のない水を用いた場合（対照例）は、ｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡに対してこれと 同じ発見率か見られた。

水と和合性のフィトフトラ胞子を用いた同様の試験においては、攻撃の後２時間 でｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡに４倍の上昇が見られ、この係数はｌＯ０時間目かけて ほんの僅かしか減少しなかった。遅くとも！６６時間目らは、この係数は対照値 の約６倍にまで上昇し、次いて３０時間後に係数９に達するまで絶えず上昇した 。

ジャガイモ抽出液の添加を伴う損傷 ジャガイモ塊茎を、緩衝液を添加せずに４°Ｃで均一化し、次いで５Ｓ３４０− ター中１０．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。

この残留物質を１０分間蒸煮し、次いで再び遠心分離した。この透明の上澄液を 、ｐＨ７，０の２０ｍＭリン酸緩衝液に１＝１０の割合で添加し、次いで試験す べき組織を通常の条件下に培養した。

ジャガイモ及びタバコ植物体の諸器官からのＲＮＡの分離を、ロジエマン等（Ｌ ｏｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、）が（ｒＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　。

１６３：１６〜２０（１９８７））に記載したようにして実施した。

ポリＡ”ＲＮＡの選択的濃縮を、ｍＡＰペーパーを用いて行った（ウニルナ−等 ：　Ｗｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ分析生物化学：　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｌ、５％ホルムアルデヒド−アガロース−ゲル上でＲＮＡを電気泳動法によって 分離した。（リーラツバ等：　Ｌｅｈｒａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

１４６、　（１９８２））に記載されているように、次いてＲＮＡをニトロセル ロースへと移し、２２ｐ放射性標識ｃＤＮＡと固定及びハイブリッド形成し、成 長及び照射した。

（１９８１）の方法に従って、ジャガイモの葉から核ＤＮＡを得、ラムダファー ジＥＭＢＬ　Ｊ中でクローニング方法のために使用した。形質転換された組織か らのＤＮＡを分離し、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ＳＤＳ及びプロテ ィナーゼＫを用いて、精製した（ワッセネガ−：　Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、論 文、ケルン（１９８８））。

「サザンプロットノ分析 ０．８〜１．２９６のアガロースゲル上でＤＮＡを電気泳動によって分離し、ニ トロセルロースへと移し、固定しくサザン、「Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ　９８．５０３〜５１７（１９７５））、ヴイルミッツ アー等（１９８２）によって記載されたようにしてハイブリッド形成及び洗二つ の調節型（転写及び翻訳調節）を比較的正確に識別する方法は、ｒランオフ」法 である。この方法では、傷つけた及び傷つけていない塊茎から細胞核を分離し、 これから新しく合成したｍＲＮＡを放射線パルスで標識し、各クローンの一本鎖 ＤＮＡとハイブリッド形成させる。傷つけていないクローンからの細胞核におい ては、ｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡは生産されなかった。対照的に、傷つけた塊茎の細 胞核においては、この物質が多量に生産された。

ジャガイモの塊茎からの細胞核の分離、及びこれに続く試験管内での転写を、ヴ イルミッツアー等（Ｗｉｌ１ｍｉｔｚｅｒ′ｅｔ　ａｌ、。

ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊル１９（１９８１）に従って実施した。

この方法によって得た放射線標識ＲＮＡ転写産物を、双方向性Ｍ１３　ｃＤＮＡ クローンによってハイブリッド形成した。

タンパク質分離及び分析 ジャガイモ塊茎からのタンパク質の分離、及びその１次元及び２次元ゲル電気泳 動による分離は、マイヤー等（Ｍａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）。

［植物細胞報告（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）Ｊ　６．７７〜８１ ．　（１９８７）に記載された。

実施例２ ｃＤＮＡクローンｗｕｎｌ　−２５Ａ２の５ｏｏｂｐのフラグメントとｃＤＮＡ クローンｗｕｎ２−２９ＣＩ２の７００ｂｐフラグメントとを、Ｐｓｔｒ部位を 用いてＭ１３ｍｐ１８中でクローニングした。このλ（１３クローン中にオケる 挿入の方向性は、相補性分析によって決定した（メッシング：　Ｍｅｓｓｉｎｇ 、　ｒ植物の遺伝子工学：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　 Ｐｌａｎｔｓ　Ｊ　（１９８３）、プレナムプレス、ニューヨーク、　１９８３ ）　、コーディング鎖を含有するこのＭ１３クローンの同定は、傷つけたジャガ イモ塊茎からの放射性標識ポリＡ”ＲＮＡとの陽性のハイブリッド形成から得ら れた。

Ｍ１３ファージからの一本鎖ＤＮＡの分離（これらかコーディング鎖を含有する ）、このＤＮＡのニトロセルロース上への固定、ジャガイモ塊茎ＲＮＡとのハイ ブリッド形成、及び選択されたＲＮＡの洗浄及びリリースは、マニアティス等（ Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）（１９８２）によって記述された。ジャガイ モ塊茎から分離した選択ＲＮＡ及びポリＡ”ＲＮＡを、２６Ｓ−メチオニンの存 在下に、ウサギ網状赤血球溶菌液中で翻訳した（ペルハム及びジャクソン：Ｐｅ ｌｈａｍ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌ　６ ７、２４７（１９７６）　。

ポリアクリルアミドゲル上での１次元及び２次元電気泳動による分離を、マイヤ ー等（八１ａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｘ１９８７）に従って実施した。

ゲノムＤＮＡの分離： ベッドプルツク（ＢｅｄｂｒｏｏｋＸ１９８１）の方法に従い、半数体系統ＡＭ ８０１５７９３の分離した葉ＤＮＡを、ゲノムジャガイモＤＮＡとして使用した 。

このＤＮＡはＥｃｏＲＩによって充分に消化した。

ファージＤＮＡの分離： ＥＭＢＬ４−ＤＮＡをＥｃｏＲＩで３つのフラグメントに切断し、ここでゲル電 気泳動による分離及びこれに続くフラグメント分離の後に、中間フラグメントの 二つのベクターアームを分離することかできた。更に、商業的に入手可能な精製 ＥＭＢＬ４−アームも使用した（アメルシャム：　Ａｍｅｒｓｈａｍ）　。

連結及びローディング： 次いでＥＭＢＬ４−アームをＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡと連結させた後、この 連結された、高分子ＤＮＡを試験管内でファージヘッドへとロードした（ホーン 及びムレイ：　Ｈｏｈｎ　ａｎｄ　Ｍｕｒｒａｙ、　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｊ　、　７４．３２５９〜６３　（１９７７）） 　：　（ホーン：　Ｈｏｈｎ、ｒＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、４６８．２９９〜３ ０９　（１９７９））　、このローディング物質は、アメルシャム（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）社の「試験管内ラムダパッケージングキット：　Ｌａｍｂｄａ　ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｉｎｇ　ｋｉｔＪに由来する。このゲノムバンクを、プ レート（２５Ｘ２５ｃｍ）当り２５．０００プラークの濃度で平板培養した。

プラークハイブリッド形成： ｃＤＮＡ相同性ラムダクローンの検出は、ベントン及びディビス（Ｂｅｎｔｏｎ 　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ）の［サイエンスＪ　１９６．１８０（１９７７）に従い 、放射線標識ｃＤＮＡを用いてプラークハイブリッド形成することで得られた。

陽性ハイブリッド形成したプラークを分離し、再び試験した。

組み換え体ファージのＤＮＡ調製 ２０ｍ１の０６００溶菌した細菌培養物をクロロホルムと混合し、次いて遠心分 離することによって、無菌の上澄液を得た。１０．００Ｏｒｐｍで４時間遠心分 離することによって、この上澄液からのファージの沈澱を実施した。５００マイ クロリツトルのファージ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣ１，ｐＨ８，０，１０ｍ ＭのＭｇＣｌ　２　）中でファージ沈澱物を除去し、デオキシリボヌクレアーゼ （ＤＮａｓｅ）及びリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理した。繰り返しフェ ノールを加えてＤＮＡを抽出した後、ファージＤＮＡをＥｔＯＨて沈澱させ、７ ０％ＥｔＯＨて洗浄し、ＴＥ中で除去した。

試験すべきフラグメントを、ヘニコフ等（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、）「 遺伝子（Ｇｅｎｅ）Ｊ　２８．３５１〜３５９（１９８４）に従って、Ｍ１３ｍ ｐ１９中で双方向でクローニングした。エキソヌクレアーゼ３は５′突出末端を 消化する。一方、３′突出末端は残るので、分析すべきＤＮＡ２０マイクログラ ムを二つの制限酵素によって消化し、５′末端と３′末端とを創り出した。この ５′末端をフラグメントに向けて配置したので、フラグメントのエキソヌクレア ーゼ消化か生じた。この反応の停止を繰り返すことにより、２００ｂｐの一層小 さいフラグメントを分離することが可能であり、このうち付着末端が、続く８１ 処理によって連結可能な平滑末端に変化した。最終的に、これに続いてこのＤＮ Ａを８Ｍ８７１１８細胞中で形質転換し、次いでその一本鎖ＤＮＡを分離した。

配列の決定 一本鎖ＤＮＡの配列の決定を、サンが−等（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）ｒＰ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　７４．５４６３．　 （１９７７）の鎖遮断法（ｃｈａｉｎ　１ｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ ｄ）に従って実施した。６９６及び８９６配列ゲル上で、この反応物質の分離を 行った（アレツルシュ及びド　マイヤー、ジエイ：　Ａｎｓｏｒｇｅ　ａｎｄ　 ｄｅ　Ｍａｙｅｒ、　Ｊ、。

ｒｃｈｒｏｍａｔａｇｒ、　ｊ　２０２．４５〜５３（１９８Ｑ））　：　（ア ソソルジュ及びバーカー、ジエイ：Ａｎｓｏｒｇｅ　ａｎｄ　Ｂａｒｋｅｒ、　 Ｊ、、ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ。

ｗｕｎｌ　−２５Ａ２のクローニング及び配列の決定クローンｗｕｎｌ　−２５ Ａ２の約７１１ｂｐのサイズの挿入物を、そのＰｓｔ（部位てＭ１３ｍｐ　１９ ベクター中でクローン化した。この挿入物の方向性を、非対称Ｘｈｏ　［部位を 用いて分析した。この挿入物の方向性と異なっている、クローン２５Ａ２−４− 　ｍｐ１９及び２５Ａ　−５−ｍｐ１９を、ＫＰｎＩ／Ｘｂａｌによって消化し 、これによりフラグメントの双方向性エキソヌクレアーゼ３消化を可能とした。

続くエキソヌクレアーゼ反応の停止によって、異なるサイズの欠損クローンを得 ることができた。これらの欠損クローンは、サンガー等（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、Ｘ１９７７）の方法に従って、配列決定用の精製された一方鎖ＤＮＡとし て働く。

転写開始部位を決定するための８１ヌクレアーゼマツピングの原理か基づいてい る考え方は、ｗｕｎｌ遺伝子の５′領域からの一本鎖ＤＮＡがｗｕｎｌ　−ｍＲ ＮＡとハイブリッド形成することで、ただこれらの領域のみか、一本鎖特異性ヌ クレアーゼＳ１による破壊に対して保護され、その相同性に基づいて、二本鎖を 形成しうるということである。保護されるＤＮＡフラグメントのサイズは配列決 定ゲル上で測定することができ、従って転写性をトレースバックできる。

この転写開始点の測定を、パーク及びシャープ（Ｂｅｒｋ　ａｎｄＳｈａｒｐ） 、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　７５．１２７ ４（１９８７）に従って実施した。このため、１．２Ｋｂのフラグメントを、Ｅ ｃｏＲＩ及びＸｈｏ　Ｉと共にプラスミドｐＬｓＯＯＯから分離し、ホスファタ ーゼで脱リン酸化した。最終的に、これに続いて５′ＯＨ末端を、ポリヌクレオ チドキナーゼ及びｙ−”Ｐ　−ＡＴＰの組み合わせによって放射線標識した。こ のＤＮＡフラグメントを変性させた後、これらを５０マイクログラムの全ＲＮＡ とハイブリッド形成させた（ハイブリッド形成緩衝液：８０％ホルムアミド、０ ．４ｍＭ　ＮａＣ１゜４０ｍＭＰ　ｌＰＥ５．１）Ｈ６，４及びｌ　ｍＭ　ＥＤ ＴＡ）。この条件では、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに比較してＲＮＡ−ＤＮＡ ハイブリッドが優先する（ケージ−及びデビッドソン：　Ｃａ５ｅｙ　ａｎｄ　 Ｄａｖｉｄｓｏｎ、ｒＮｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　４．１５３９〜１５５２（１９７７））　、このハイ ブリッド形成温度は、８０°Ｃ付近から始め、終夜で４０°Ｃまで低下させた。

続（Ｓｌヌクレアーゼ消化（１２０Ｕ／ｍｌ）によって不対鎖を除去した。

予期されたように、ｗｕｎ　１遺伝子の５′非翻訳領域に位置する放射性標識Ｘ ｈａ　１部位は、そのｍＲＮＡへの相同性によって保護された。最終的に、Ｓｔ 保護ＤＮＡ鎖を配列決定ゲル上で電気泳動によって分離し、これによって既知の ＤＮＡフラグメントの配列をサイズマーカーとして働かせた。

ジャガイモプロトプラストにおける遷移形質発現２０マイクログラムの量の高度 に精製した（ＣｓＣ１勾配）プラスミドＤＮＡを、ＰＥＧ／ＣａＣｌ２で処理し たジャガイモプロトプラスト中て形質転換させた（Ｌｉｐｐｈａｒｄｅ、論文、 ケルン（１９８８））　、このプロトプラス１−を、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ） 種のジャガイモ茎懸濁液培養物から分離した。

米プロトプラストにおける遷移形質発現２０マイクログラムの高度に精製した（ ＣｓＣ１勾配）プラスミドＤＮＡを、レルツ等（Ｌｏｒｚ　ｅｔ　ａｔ、）、　 ｒＭｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、Ｊ　１９９゜１７８〜１８２（１９８５） による方法の変形によって形質転換した。ポリエチレングリコールの濃度及び浸 透圧を変更した。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中でクローニングされたＤＮＡを、ヴアンホート等（ Ｖａｎ　Ｈａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｘ１９８３）か記述した方法に従って、ヘル パー鎖ＧＪ２３を用いてアブロバフタ一種３８５０□中へと転移させた。

アブロバフタ−のＤＮＡ分析： このＤＮＡのアブロバフタ−中への転移のモニタリングを、ムレイ及びトンプソ ン（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、　ｒＮｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒ ｅｓ、Ｊ−ＤＮＡを分離することによって実施した。このＤＮＡの制限消化、ニ トロセルロースへの転移、これと対応する放射性プローブとのハイブリッド形成 は、ＤＮＡのアブロバフタ−への転移が成功であることを示す。

アブロバフタ−の成長： 感染に必要なアブロバフタ−３８５０，，を、選択的抗生物質培地（ザンブリス キー等：　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３）中で成長させ、遠 心分離によって沈澱させ、ＹＥＢ培地中で抗生物質なしに洗浄した。更に沈澱さ せ、ＹＥＢ培地中で再懸濁させた後、この細菌を感染用に使用できる。

リーフディスク感染： タバコ系統ＳＮＮ及びＷ２Ｂの無菌の葉をリーフディスク感染に使用した。約１ ｃｍのサイズの葉片を、０．１９６Ｈｇ　Ｃ１２，０，１９６ＳＤＳ中で１０分 間培養することによって無菌化し、次いで無菌水中で３回洗浄した。これに続い て、上記したようなアブロバフタ−懸濁液中に浸漬し、次いて３ＭＳ培地に移し た。１６時間は明所における２日間の培養の後に、約２５°Ｃ〜２７°Ｃで、こ れらの葉片を液体３ＭＳ培地中で数回洗浄し、３Ｍ５Ｃ培地へと移した。４〜６ 週間後、現れてきた苗条を分離し、２　ＭＳＣ培地上で培養した。

形質転換が成功であったことの更なる証明として、ツバリン試験を実施した。

形質転換した植物体の分析 ツバリンシンターゼ活性の証明： 形質転換した植物体の葉におけるツバリンシンターゼ活性の検出を、オッテン及 びシルペルー）　（Ｏｔｔｅｎ　ａｎｄ　５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）。

ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ＡｃｔａＪ　５２７．４９７（１９７ ８）に従って実施した。

ＮＰＴ−２活性の証明： 形質転換した植物体におけるＮ　Ｐ　Ｔ　−２活性を、レイス等（Ｒｅｉｓｓに 従って確認した。

ＣＡＴ活性の証明： クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を、ヴエ ルテン及びシェール（Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ）、　ｒＮｕ方法に 従って測定した。

実施例９ ＴＲプロモーターとの融合によるｗｕｎｌプロモーターの最適化（ＴＲＩ　’　 ｗｕｎｌ） 使用した培地としては、実施例１〜８を参照しなければならアブロバフタ一種： 　ＧＶ３１０１ｐｍｐ９０ＲＫ　（コンツ、シー及びシェル、ジェイ：　Ｋｏｎ ｅｚ、　Ｃ，ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、ｒＴＬ−ＤＮＡ遺伝子５のプロモ ーターが、新しい型のアブロバフタ−バイナリ−ベクターによって運はれるキメ ラ遺伝子の組織特異性形質発現を制御する：　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｎ　ｏｆ 　ＴＬ−ＤＮＡ　ｇｅｎｅ　５　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ−３ ｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｇｅｎｅｓ 　ｃａｒｒｉｅｄ　ｂｙ　ａ　ｎｏｖｅｌｔｙｐｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｅｒ（１９８６）、　ｒＭｏｌ、　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｔ、　２０４　：　３８３〜３９６）。

プラスミド：ｐＰＣＶ７２０　（従って、コンツ博士：叶、　Ｋｏｎｃｚによる まだ公開されていないプラスミド、　ＭＰＩ　ｆ、　Ｚｕｃｈｔｕｎｇｓｆｏｒ ｓｃｈｕｎｇ。

ケルン） ３５Ｓ　−ＧｔｌＳ　＝ｐＲＴ９９−ＧＵＳ　（テープファー、アール、シェー ル。

ジェイ、及びシュタインビッヒ、エイチ、エイチ：　Ｔｏｐｆｅｒ、　Ｒ。

、　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　ａｎｄ　５ｔｅｉｎｂｉβ、　Ｈ，Ｈ，、ｒ植物細 胞における遷移遺伝子形質発現及び直接遺伝子転移のための可動性クローニング ベクター：　Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　 ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　 ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　Ｊ　（１ｗｕｎ ｌ−ＧＵＳ　（ジーベルツ、ビー、ロジエマン、ジエイ、ヴイルミッツァ−、エ ル、シエール、ジェイ：　５ｉｅｂｅｒｔｚ、　Ｂ、、　Ｌｏｇｅｍａｎｎ、　 Ｊ、、　Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、　Ｌ、、　５ｃｈｅ１１．　Ｊ、　ｒ　トラン スジェニックタバコ植物体における傷誘導プロモーターｗｕｎ　１のシス分析及 びその形質発現の組織化学的局在化：　Ｃ１ｓ−ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｗｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｗｕｎｌ　ｉｎ　ｔ ｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓａｎｄ　ｈｉｓｔｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　１ｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｊ　ｒ植物細胞：　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＪ　、印刷中（１９８９）Ｔ Ｒ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ（Ｏジエマン等：　Ｌｏｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、印刷中）ＴＲＩ’　−ＧＵＳ（ロジエマン等：　Ｌｏｇｅｍａｎｎ　ｅｔ 　ａｌ、、印刷中）植物体： ニコチアナ　タバクム　ライスコンシン３８　（Ｗ３８）方法 例えば、制限分析、プラスミド分離、プラスミドＤＮＡのミニプレバレージョン 、細菌の形質転換等のような、すべての分子生物学的な標準方法を、特に別に指 示しない限りは、マニアティス等Ｑ！ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｘ１９８２ ）が記述したように実施した。

実施例１〜８に記載したようにして、傷ついた及び傷ついていない植物組織を得 た。

ＲＮＡ分離、「ノーザンプロット」分析、ＤＮＡ分離、米プロトプラストにおけ る遷移形質発現、「サザンプロット」分析及びアブロバフタ−のＤＮＡ分析に関 し、実施例１〜８も参照するこヴアン　ホード、イー、ジュース、エイチ、マエ ス、エム。

ワレン、ジー、ヴアン　モンタギュー、エム、シエール、ジエイ（Ｖａｎ　Ｈｏ ｕｔｅ、　Ｅ、、　Ｊｏｏｓ、　Ｈ，Ｍａｅｓ、　Ｍ、　Ｗａｒｒｅｎ、　Ｇ、 、　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、、　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、）　ｒｐＢＲ３ ２２内でクローニングされた制限フラグメントの遺伝子間転移及び交換組み換え ：種類がんしゅ病菌のＴｉプラスミドの逆転した遺伝学のための新しい戦略：Ｉ ｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｃｏ ｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｃ ｌｏｎｅｄ　ｉｎ　ｐＢＲ３２２：　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏ ｒｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ 　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｊ　ｒＥＭＢＯＪ、 、Ｊ　２　：　４１１〜４１８に記載された方法に従って、大腸菌（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）でクローニングされたＤＮＡをアブロバフタ一種ＧＶ３１０１ｐｍｐ　９ ０ＲＫ中へと転移させた。

タバコの形質転換 アブロバフタ−の培養 所望のプラスミドを含有するアブロバフタ−ＧＶ３１０１ｐｍｐ　９０ＲＫを、 選択的抗生物質培地（ハイグロマイシン）中で成長させ、遠心分離によって沈澱 させ、抗生物質なしにＹＥＢ培地（マニアティス等：　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８２）中て洗浄した。更に沈澱させ２　ＹＥＢ培地中で除去し た後に、この細菌を感染用に使用することができた。

リーフディスク感染 これを実施例８において記載したようにして実施したが、ツバリン試験は採用し なかった。

形質転換した植物体の分析 ＧＵＳ活性の証明 Ａ：ジェファーソン、エイ、アール、力ヴアナフ、ティー、ニー、ベヴアン、エ ム、ダヴリュ：　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，、ＫａＶａｎａｐｔｌ。

Ｔ、　Ａ、、　Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、　Ｗ、ｒＧＵｓ融合：高等植物体における感 受性及び可動性の遺伝子融合マーカーとしてのβ−グルコロニダーゼ：　Ｇｕｓ −Ｆｕｓｉｏｎｓ　：β−Ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ　ａｓ　ａ　５ｅｎｓｉ ｔｉｖｅ　ａｎｄＶｅｒｓａｔｉｌｅ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ 　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ　Ｊ　、ｒＥＭＢＯＪ、Ｊ　６　：　３９ ０１〜３９０７（１９８７）の方法に従って、ベーターグルコロニダーゼ活性（ ＧＵＳ活性）のフルオロメトリー分析を実施した。

Ｂ：ＧＵＳ活性に関する組織の青色染色がＸ−Ｇｌｕｅ溶液を用いることで得ら れた。Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液。１〜２　ｍＭのＸ−Ｇｌｕｅ　（５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリル−グルクロニダーゼ）、及びジメチルホルムアミドを、５ ０ｍＭリン酸緩衝液中にｐＨ７，０で溶解した。

−傷つけた組織： 組織の薄いスライスを「植物組織の損傷」の項目の下で記述したようにして培養 し、次いてＸ−Ｇｌｕｅ溶液中３７°Ｃで終夜染色した。最終的に、６０°Ｃて １００９６メタノールを加えてクロロフィルを除去した。

一傷つけていない組織： 翻訳阻害剤シクロヘキシイミド（ＣｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅＸｌ、　８ｍＭ） を更に含有するＸ−Ｇｌｕｃ溶液中で、組織の薄いスライスを培養した。

この培養時間とメタノール処理とは、傷つけていない組織の場合と同じである。

花粉のＸ−Ｇｌｕｃ染色： 花粉を２８°Ｃて３００６シヨ糖中て終夜培養し、花粉管を発現させた。最終的 に、２倍に濃縮した３００６　Ｘ−Ｇ　ｌｕｃ溶液を加え、この花粉を２８°Ｃ て終夜培養した。また、花粉管を発現させることなしに、花粉粒をＸ−Ｇｌｕｅ 中で直接に培養する。

ｗｕｎｌ−ＧＵＳ　： １０２２ｂｐのｗｕ旧プロモーターと１７８ｂｐのＷＬＩ旧５′非翻訳領域とを 、ベーターグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）と転写融合させた。

ツバリン−シンターゼ遺伝子（ＮＯ３）のポリアデニル化信号（ｐＡ）を終結配 列として使用した。

ＴＲＩ’　−ＧＵＳ　： ＴＲＩ’プロモーターをＧＵＳ遺伝子と転写融合させ、ＮＯＳ遺伝子のｐＡ倍信 号よって終結させた。

ＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ　： ＴＲプロモーターの１′プロモーターの後ろで、オクトビン−シンターゼ遺伝子 （ＯＣＳ）のｐＡ倍信号クローニングし、ｗｕｎ　ｌプロモーターによって転写 を抑制した。ＯＣＳ　ｐＡ倍信号後ろに、ＧＵＳ遺伝子と転写融合するｗｕｎｌ 遺伝子の非翻訳５′領域を１７９ｂｌ）（ｗｕｎｌ　−ＧＬＩＳ構成体と相同に ）含んで、ｗｕｎ　ｌプロモーター（１０２２ｂｐ）を配置する。３５−８遺伝 子のｌ）Ａ信号は、ＧＵＳ遺伝子用の終結配列として働く。この構成体（ＴＲ１ ’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ）はバイナリ−ベクターｐＰｃＶ７２０中に存在し、 （ヘルパープラスミドの助けによって）これは大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）及びア ブロバフタ−の双方において複製できる。

ＴＲＩ　’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ　トランスジェニックタバコのＲＮＡ分析種 々のＴＲｌ　’　−ｗｕｎｌ　−ＧＬＩＳ　Ｉ□ランスジェニックタバコ植物体 の傷つけた葉及び傷つけていない葉がらのＲＮＡ、と共にｗｕｎｌ　−ＧＵＳ及 び３５Ｓ　−ＧＬＩＳ　トランスジェニックタバコの葉からのＲＮＡを分離し、 放射性標識ＧＬＩＳ−ＤＮＡとハイブリッド形成した。

第１３図のノーザンプロットに示すように、１、トランスジェニックＴＲ１’　 −ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ葉中のＧＵＳ　−ｍＲＮＡは、ｗｕｎｌ−ＧＵＳ　トラン スジェニック葉におけるものと正確に同じ大きさである。双方の構成体において 、同じ転写開始が使用されたことが解る。

２、傷つけた葉におけるＲＮＡの量は、ＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ植物体 及びｗｕｎｌ　−ＧＵＳ植物体の双方において、傷つけていない葉におけるより も高い。ｗｕｎｌ　−ＧＵＳについて既に知られている傷誘導性は、ＴＲＩ　’ 　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳについてもまた真実である。

３、ＲＮＡ量の比較から解ることは、３５Ｓ　−ＧＵＳ　）ランスジェニック葉 におけるよりも、傷ついたＴＲＩ　’　−ＷＬＩｎＩ　）ランスジェニック葉に おける方が、幾分か多くのＲＮＡが見出されることである。３５Ｓプロモーター は植物体における最も強力なプロモーターの一つであるから、ＴＲＩ’　−ｗｕ ｎｌプロモーターは同等の強さを有するものと評価される。

トランスジェニックタバコにおけるＧＵＳ活性の分析トランスジェニックＴＲ１ ’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ植物体のＧＵＳ活性の定量分析が示すところでは、ト ランスジェニック葉におけるＴＲ１’−ｗｕｎｌプロモーターを、損傷によって ２倍から最高１３倍（平均は約６倍）の係数で誘導できる。この観察は、トラン スジェニック葉におけるｗｕｎｌプロモーターの傷誘導性に類似している（ロジ ェマン、ジェイ、リッパルト、ニス、レルッ、エイチ、ハウザー、アイ、ヴイル ミッツアー、エル、及びシエール。

ジエイ：　Ｌｏｇｅｍａｎｎ　Ｊ、、　Ｌｉｐｐｈａｒｄｔ　Ｓ、、　Ｌｏｒｚ 、　Ｈ，、Ｈａｕｓｅｒ、　［。

、　Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、　Ｌ、　ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、、　ｌ’ｗ ｕｎｌ遺伝子から５′上流の配列か、トランスジェニック植物体において損傷に よる遺伝子活性化の原因となる：　５　’　ｕｐｓｔｒｅａｍ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗｕｎｌ−ｇｅｎｅ　ａｒｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌ ｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｗｏｕｎｄｉｎｇ：　１ ５１〜１５８（１９８９Ａ））。トランスジェニックｗｕｎｌ−ＧＵＳタバコ植 物体と同様に、高く、若い方の葉における傷誘導性が最も高く、一方、低く、古 い方の葉において最も小さかった。誘導性におけるこの相違の理由は、傷つけて いない組織におけるＴＲＩ’−ｗｕｎｌプロモーターの活性か、頂部から底部へ 向かって増大することである。古い植物体の古い葉においては、非損傷条件にお いてＴＲＩ’　−ｗｕｎｌプロモーターの活性か既に高いので、（ｗｕｎｌ−Ｇ ＵＳ植物体と同様に）損傷は更なる活性を誘導しない。

トランスジェニックタバコの葉及び茎におけるプロモーター活性の相対比較か示 すところでは、ｗｕｎｌプロモーターは、ＴＲＩ’プロモーターよりも概略１０ 倍強い。他方ＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳプロモーターは、ｗｕｎ　ｌプロ モーターよりも１０倍強い。結果的に、ＴＲ１’　−ｗｕｎｌプロモーターは、 ＴＲＩ’プロモーターよりも概略１００倍強い。

トランスジェニックタバコにおけるＧＵＳ活性の局在化ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ及び ＴＲＩ　’　−ｗｕｎｌ−ＧＵＳ　）ランスジェニックタバコの傷つけた及び傷 つけていない葉及び茎からの組織スライスにおけるＧＵＳ活性を、基質Ｘ−Ｇｌ ｕｃを用いて局在化した。

ｗｕｎｌ−ＧＵＳ　： 青く染色した領域から解るように、ｗｕｎ　１プロモーターの活性は、主として 表皮（細胞糸を含む）に限定され、より低い程度で、傷つけた葉（Ｗ）の導管系 に限定される。他方、傷つけていない葉（ＮＷ）においては、表皮中には、小さ なｗｕｎｌプロモーター活性のみが見られ、導管系内には活性がない。また、こ れと同じ結果か、茎の断面でも得られた。従って、ｗｕｎｌプロモーターの活性 は、葉及び茎において表皮特異的と考えられる。

ＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ植物体においては、傷つけた植物体のスライス の導管系に青色着色の強調が見られた。他の領域では（表皮、柔組織）、着色が 弱い。傷つけていない葉のスライスでは、導管系内に低レベルの青色着色が見ら れ、表皮中は無色である。これと同じ結果が、茎の断面に見られた。

これは、ＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳに関し、葉及び茎における導管特異的 形質発現プロモーターを示唆するようにみえる。

ＴＲＩ’−ＧＵＳ植物体の葉の断面を対照例として用いた。ＴＲＩ’プロモータ ーのプロモーター活性が弱いため（ｗｕｎｌプロモーターよりも１０倍弱い）、 傷つけた又は傷つけていない葉の断面のいずれにも青色染色は見られなかった。

−朽（やく）： 朽の断面及び花粉のＸ−Ｇｌｕｅ染色は次の特徴を示し、これらはｗｕｎｌ　− ＧＵＳ及びＴＲ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳの双方に適用される：青色の染色（ 及びＧＵＳ活性）を、ストミウム（ｓｔｏｍｉｕｍ　：花粉を放出するための朽 の自然穿孔位置）及び花粉内で検出した。

分離した発芽していない花粉と発芽した花粉とにおいて、花粉粒及び花粉管の中 に青色の染色か見られた。

米プロトプラストにおける遷移形質発現構成体ＴＲＩ　’　−ｗｕｎｌ−ＧＵＳ 　、　ｗｕｎｌ−ＧＵＳ　、　ＴＲＩ　’　−ＧＵＳ及び３５Ｓ−ＧＵＳを用い 、変種オリサ　サテイバ　ジャポニカＣ，Ｖ。

タイペイの米プロトプラストにおいて遷移発現を研究した。表１に示すように、 ＴＲＩ’−ＧＵＳの活性は、対照例（ＤＮＡなして形質転換させた米プロトプラ ストのＧＵＳ活性）から顕著に異なっていない。ｗｕｎｌ　−ＧＬＩＳ及び３５ Ｓ−ＧＵＳは、対照例よりも２倍から３倍高い活性を示す。対照的に、ＴＲ１’ 　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ　ＤＮＡは、平均して対照例よりも５７倍高い活性を示 し、従って米プロトプラストにおいて高度に活性のプロモーターである。

表１ ＧＵＳ活性　相　対 構成体　ｎｍｏｌ　ＭＵ／ｍｇ／ｍｉｎ　ＧＵＳ活性ＴＲ−ＧＵＳ　３１　１． ２ ｗｕｎ−ＧＵＳ　５９　２．３ ＴＲ−ｗｕｎ−ＧＵＳ　１４１６　５６．７３５Ｓ−ＧＵＳ　６６　２．６ 対照例　２５　１．０ 表１のための注釈： 与えられたＧＵＳ活性は二５つの独立の試験に基づく。

表１の結果は、Ｘ−Ｇｌｕｅでプロトプラストを染色することによって解る。Ｔ Ｒ１’　−ｗｕｎｌ　−ＧＵＳで形質転換したプロトプラストのみが、強調され た青色染色を示す。

３Ｅ＝＝＝＝＝＝コ ５Ａ２ 二二二二コＬ　Ｆよ５．□ １　人入＾ｃｃｃｃ丁ＧＣ，ＴＧご丁ＣＧＣＣＣ丁λ丁＾〒Ｇ入＾ｃｃｃ”ｒ丁 Ｃ＾ＧＣＴＯ＾０＾ＣＧ入ｃｃ丁ＣＯＴ丁Ｃ＾（、ＣＴＣＣ`Ｃ； ＭＱｍＬＴＧＴＡ）ＣＦＤＮＡＳＦＯＦＬ）ＩＫ１８１　＾ＣＣ＾丁丁Ｇ＾ＣＧ ？ＡＴＴＣＧＣ丁丁ＣＣＧＴＴＣ，ＴＴＣＴＣＣＴＴＧ入＾ＣＣ丁丁Ｃ；ＴＧｋ ＣＣＣ入＾Ｃ（’：ＣＧ＾丁b丁＾丁丁 ＴＸＤＶＦＧＳＶＶＬＶＥＧＣＤＰ　丁　ＲＳ！２４１　ＡＣＴＴＧにに丁ＴＣ ＡＣＧＣＣＴ（、Ｃ；ＡＣＴにＴ丁＾ＣＡＣ；Ａ↑（、ＧＧＧ丁入入ＴＴｋＣＣ ＣｋＧＣ；ＴＴＡＧＧＧｋＣCＴｋ丁ＴＴＣ ？ＷＶ１４ＡＶ？Ｖ　丁　ＤＣＶ！ＴＱＶｊｌＥＹＦ３０１　ＡＡｔＡＣＣＴＣ ＡＣＴＴＡＣ丁ＧＴＣＡＣＣＣＧＴ丁ＴＴＧＧＧ入入＾丁ＣＧＧｋＴｋＴＴＴＣ ＣＴＣＭＴＴＡＣＧｋＣＴＣＴＧＮＴＳＬ’ｒＶ　ＴＰＩＦに　罠　５ＤＸＳＳ ＸＴ　丁　Ｌ３６１　ＣｋＴＴＧＣＣＣｋ丁ＣＴＧ丁ＴＴＧＧＧ＾Ｇ＾Ｇ丁＾Ｇ ＣＴ丁＾ｃｃｒ入＾丁ＣＧＧＧＴＣＣＣ入入＾＾丁Ｃ’ｒＧＴＴＣＣＧＧf丁 ＨＣＰＳＶＷＥＳＳＬＰＮＲＶＧＫＳＶＰに４２１　Ｃ丁子Ｃ丁入丁ＴＧＧＣＴ ロτ＾τ入入Ｇ入八入ＣＧ＾ロＣｃＣ＾丁丁ＴＧＴＧ口丁ＧＧＣＣ；丁τＧ丁＾ 丁ＣＴ丁ＧτＧ丁ロー・OＧτ Ｌ　ｖ　Ｘ＋　＾　Ｌ　Ｅｎ＋５ Ｆｉｇ、２ −ｍ− ５°Ｉ＾＾＾？？？ＴｋＴＡＣＡ＋、＋１ｅＡｔＡＣｋｋｋＣＡｅＪＡ？ｅＡＴ ＴＧｋＴ＆ｅ＆ＴＡＡＣＡＡＦｆｆＧ、７ Ｆ１９．９ マ１” −り Ｆｉｇ、１３ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平９３年５月７８Ｂ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．病原性微生物による感染及び／又は傷によって刺激された、ソラヌム　ツベ ロスムからのＤＮＡ配列。
2. ２．請求項１に従うＤＮＡ配列のプロモーター部分、又はその活性領域。
3. ３．ＴＲプロモーターと融合した、請求項１に従うＤＮＡ配列のプロモーター部 分、又はその活性領域。
4. ４．請求項１に従うＤＮＡ配列の構造遺伝子部分、又はその活性領域。
5. ５．傷及び／又は病原性攻撃を用いて高等植物中に遺伝子産物を発現させるため の、請求項１に従うＤＮＡ配列、又は請求項２若しくは請求項３に従うプロモー ター領域の使用法。
6. ６．請求項２若しくは請求項３に従うＤＮＡ配列のプロモーター領域、又はそれ らの活性領域が、異なる源の構造遺伝子と融合している、請求項５に記載した使 用法。
7. ７．請求項１，２，３又は４に従う挿入ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ転移ベクター 。
8. ８．請求項１，２，３又は４に従う挿入ＤＮＡ配列を有し、異なる源の構造遺伝 子と会合するプロモーター部分又はその活性領域を含有するＤＮＡ転移ベクター 。
9. ９．請求項１，２，３又は４に従うＤＮＡ配列を含有する植物又は植物材料。