EP0441884A1 - Verwundungsstimulierte dna-sequenz aus solanum tuberosum und ihre verwendung - Google Patents

Verwundungsstimulierte dna-sequenz aus solanum tuberosum und ihre verwendung

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EP0441884A1
EP0441884A1 EP89912967A EP89912967A EP0441884A1 EP 0441884 A1 EP0441884 A1 EP 0441884A1 EP 89912967 A EP89912967 A EP 89912967A EP 89912967 A EP89912967 A EP 89912967A EP 0441884 A1 EP0441884 A1 EP 0441884A1
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EP
European Patent Office
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wun1
promoter
dna
plants
gus
Prior art date
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Pending
Application number
EP89912967A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Logemann
Lothar Willmitzer
Josef Schell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible

Definitions

  • the invention relates to wound-stimulated DNA from Solanum tuberosum and parts thereof, their use for the expression of gene products in higher plants when wounded or
  • DNA transmission vectors containing them and plants or parts of plants containing them.
  • the invention accordingly relates to DNA sequences from Solanum tuberosum which are stimulated by injury and / or infection with pathogenic germs, and to their parts, in particular the promoter part and the structural part.
  • the invention further relates to the use of these DNA sequences for the expression of gene products in higher plants in the case of injury and / or pathogenic attack.
  • the invention further relates to DNA transmission vectors with DNA sequences inserted therein, as defined above.
  • the invention relates to plant or plant materials which contain such a DNA sequence.
  • active region of a gene is understood to mean those nucleotide sequences which are absolutely necessary in the promoter part of the gene for the activation of the structural part and in the structural part for the expression of an effective or active gene product.
  • Structural genes is understood not only to mean that in the homologous system of the DNA sequence described here from Solanum tuberosum, but also structural genes from other origins, that is to say from heterologous systems.
  • Any suitable DNA molecules that can be introduced into the ultimately receiving bacterium can be used as transmission vectors. These are usually plasmids as described in more detail in the materials section. The insertion techniques are known to the person skilled in the art.
  • Bacteria of the genus Agrobacterium in particular Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes, can be used as bacteria for the absorption and transmission of the transmission vector.
  • EP-A 122 791 describes a DNA transfer vector which comprises T-DNA with a plant gene inserted therein.
  • This plant gene consists of a plant promoter and a plant structural gene, the plant promoter being adjacent to the 5 'end of the plant structural gene and the plant structural gene being located behind the plant promoter in the direction of transcription.
  • EP-A 122 791 describes in detail methods and measures for inserting genetic material into DNA transmission vectors, to which express reference is made here.
  • a cDNA library was set up on the basis of purified polyA RNA from wounded tubers of the potato variety Granola, which were also incubated with Erwinia.
  • Differential colony hybridization of 4000 cDNA clones against radioactively labeled RNA from unwound and Erwinia-wounded tubers identified 2 clones, here called wun1 and wun2, whose complementary mRNA in tubers from various tetraploid potato varieties and the haploid variety AM 80/5793 were wounded be induced.
  • Wunl mRNA accumulates 30 minutes after the mechanical wounding of a tuber and is therefore involved in wound-induced primary processes, whereas wun2 is not induced until 3.5 hours later.
  • Wun1 mRNA accumulates in high amounts in wounded potato tubers (quantitatively comparable to proteinase inhibitor llmRNA in unwound potato tubers, see Sanchez-Serrano et al., Mol. Gen. Genet. 203, 15 (1986)), but is in unwound tubers undetectable. It already appears 30 Minutes after wounding with a maximum from the 4th to 24th hour after wounding. In smaller quantities, it was still detectable after 48 hours.
  • wun1 and wun2 mRNA after wounding are not limited to the tuber, but also takes place in leaves, stems and roots of various tetraploid potato plants with similar kinetics and intensity.
  • Wunl mRNA is also induced in leaves without wounding if these are sprayed with compatible Phytophtora infestans spores. This result shows that wun1 can be induced not only by mechanical wounding, but also by the presence of (fungal) pathogens.
  • Wunl mRNA was expressed higher in aerobically wounded tubers than in the corresponding anaerobic approach.
  • Fig. 1 shows the relative size of the clones used for sequencing.
  • the clone wun1-25A2 exists in two orientations in the Pstl interface, which are referred to as 25A2 * MP19 and 25A2MP19 due to the location of the asymmetrical Xhol interface.
  • 25A2 * MP19 and 25A2MP19 due to the location of the asymmetrical Xhol interface.
  • the size of the cDNA clone wun1-25A2 is 711 bp.
  • a 14 bp poly A tail can be found at the 3 end (position 697-711).
  • the largest open reading frame spans 105 amino acids (positions 121-438). Also located 5'-further are two short open reading frames which code for position 3 for 3 amino acids and code for position 8 for 8 amino acids (underlined). However, the last two open reading frames listed differ from the reading frame, which encodes the 105 amino acids.
  • the reading frame coding for 105 amino acids is to be regarded as that of the wun1 protein.
  • the translation starting point of the wun1 protein TTTTTGATGCAA is only slightly correct with that of Joshi, Nuc. Acids Res. 15, 6643, (1987) determined consensus sequence for plant translation starts TAAACAATGGCT.
  • the wun1 cDNA-equivalent fragment in wun1-85 has a size of 4 Kb. It thus corresponds exactly to that in wun1 cDNA hybri fragmenting fragment size of EcoRI-digested DNA from the haploid potato. Due to the asymmetric Xhol cleavage in the 5 'region of the cDNA clone, the orientation of the gene in the 4 Kb fragment could be determined. Accordingly, there is an approximately 1 Kb promoter region in front of the wun1 gene, while an approximately 2 Kb non-homologous part is located 3 'of the gene. The additional 8 Kb EcoRI fragment contained in wun1-85 could not be used for a closer analysis of the wun1 gene. Due to the total digestion of the potato DNA with EcoRI, it is likely that during the subsequent ligation two fragments which do not belong together were brought into the EMBL4 vector and therefore cannot be functionally related to one another.
  • Figure 4 shows the arrangement of wun1 in the genomic clone wun1-85.
  • the 4 kb EcoRI fragment of the genomic clone wun1-85 contains 1.0 kb of the wun1 promoter, 0.8 kb of the wun1 gene and 2.0 kb of the 3 'end.
  • the 4 Kb fragment of wun1-85 was ligated in EcoRI-cut pUC8 for further analysis (see FIG. 4).
  • the 4 Kb fragment was further cloned into the EcoRI site of M13mp18. Its orientation was determined by means of control digestions at the asymmetrically located Xhol interface.
  • the clones 85 * mp18 and 85mp18 represent both orientations of the
  • FIG. 5 shows the result of the deletion analysis of the clone wun1-85 in schematic form.
  • the resulting deletion clones with different fragment sizes were used for sequencing. Overall, it was possible to sequence the entire wun1 gene bidirectionally, as well as to analyze approximately 400 bp of the 3 'end unidirectionally.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the wun1 promoter and gene from wun1-85.
  • the CAAT box, TATA box and poly-A signal are highlighted, transcription start and stop are marked by arrows.
  • the Sl nuclease mapping method was used to identify the exact start of transcription of the wun1 gene.
  • Xhol cleavage region from pLS000 with wun1 mRNA leads to a 162-179 bp long DNA-RNA hybrid (TU) which is protected from the single-stranded Sl nuclease.
  • the transcription start begins 179 bp upstream from the Xhol site, i.e. with the sequence ACCATAC.
  • This sequence agrees in the central area (CAT) with that of Joshi et al. (1987) determined the consensus sequence for the start of transcription CTCATCA. Further information results from the position of the transcription start (see FIG. 6):
  • CAAT box in the range between -60 and -80 can be found in the wun1 promoter in position -58 (CAAACT).
  • CAAACT CAAT box in the range between -60 and -80
  • the gene encoding wun1 mRNA comprises 794 bp, which corresponds very precisely to the size determination of wun1 mRNA based on the "Northern blot" analyzes.
  • the cDNA clone wun1-25A2 lacks 97 bp of the 5'-untranslated region in the wun1 gene.
  • the wun1 gene does not have introns.
  • FIG. 8 shows the arrangement and position of important regions in the wun1 gene.
  • the wun1 promoter is marked in black, the wun1 gene is hatched.
  • Important recognition sequences are framed;
  • the mRNA is represented by a serpentine line, the protein coding region by crosses.
  • the size of the individual areas is given in base pairs (bp).
  • Figure 9 shows a sequence comparison between the cDNA clone wun1-25A2 and the genomic clone wun1-85. 2368 bp of the genomic clone wun1-85 were compared with 711 bp of the cDNA clone wun1-25A2. Homologous base pairings are identified by a vertical line. The absence of nucleotides is indicated by a dot. The two arrows document the sequence of two 10 bp direct repeats in the cDNA clone.
  • the gene codes for a 12,000 dalton protein, the size of which could also be approximately confirmed in hybrid-released translation experiments.
  • Computer evaluations regarding the amino acid composition of the wun1 protein showed that it is a very hydrophilic protein.
  • the amino acid sequence results from FIGS. 2 and 6.
  • PR The size of the wun1 protein, its hydrophilic properties, the inducibility of wounding in various tissues and the inducibility by pathogens suggest that it belongs to the PR proteins.
  • PR or "pathogenesis-related" protein is used to summarize proteins from different plants which can be induced, inter alia, by pathogenic attack and in some cases have chitinase or glucanase activity, ie the activity of enzymes which can destroy the cell walls of fungi .
  • plants transformed with 3850 K m have the ability to synthesize nopaline, a property that distinguishes them from untransformed plants (Zambryski et al, EMBO J. 1 147-152
  • Kanamycin-resistant and nopalin-positive LS1 plants were transferred to the greenhouse and analyzed at the DNA and RNA levels.
  • Figure 10 shows the construction of wun1-wun1 and wun1-CAT fusions that were used for expression studies based on transient expressions and stable transformations.
  • the 4 Kb fragment which contains the wun1 promoter, the wun1 gene and 2 Kb of the 3 'end, was cloned into the vector pMPK110 via the EcoRI sections (pLS001 ).
  • This pMPK110 derivative allows the transfer of the wun1-wun1 construction to the Agrobacterium 3850 km .
  • the wun1 promoter and 179 BP of the 5'-untranslated wun1 gene region were fused to the CAT gene including the 3 'end via the Xhol interface (pLS010).
  • a cloning over PstI in the vector pMPK110 (pLS011) has the advantage that this plasmid can be used on the one hand for transient studies in protoplasts and on the other hand also acts as a mobilization plasmid for the transfer of the wun1-CAT construction into the Agrobacterium 3850 km .
  • RNA level A functional analysis of the wun1-wun1 DNA of positive LS1 plants was possible at the RNA level. There was only a very weak cross hybridization against a wun1 cDNA sample in both wounded and unwound untransformed tobacco plants. In addition, isolated RNA from untransformed tobacco plants was raised against the 5 'region of the wun1 gene, which is the
  • An object of the invention is to construct and isolate genes capable of expressing fused proteins as required. For this it is necessary that the wun1 promoter is solely responsible for the expression of the downstream structural gene, which need not always be the case (eg proteinase inhibitor II).
  • Transcriptional fusions consisting of the wun1 promoter and 178 bp of the S'-untranslated gene were fused with various structural genes (wun1-CAT, wun1-NPT, wun1-GUS), the detection of which was possible using radioactive or fluorometric methods.
  • GUS stands for ⁇ -glucuronidase (Jefferson et al, Proc. Nat. Acad. Sci. 83, 8447-8451 (1987)).
  • the construction wun1-CAT was tested for its transient functionality in potato protoplasts. This method makes it possible to analyze promoter activities within a few days by transferring highly purified plasmid DNA, which contains the constructions, to protoplasts using known methods, where they are stable and can also be read. A prerequisite for expression is that the promoter is functional and that the inducing factors are present in protoplasts treated in this way.
  • the wun1 promoter including 179 bp of the 5'-untranslated region was transcriptionally fused with the chloramphenicol acetyl transferase gene (CAT).
  • CAT chloramphenicol acetyl transferase gene
  • CAT analysis of such protoplasts transformed with pLS011 DNA revealed high CAT activities.
  • a parallel test approach with a CAMV-35S-CAT construction (35S promoter from the Cauliflower mosaic virus (CAMV)) (pRT101-CAT) brought about comparable CAT activity, whereas in a control approach without addition of DNA no CAT activity was recognizable.
  • the CAMV promoter is considered to be the strongest known promoter in plants.
  • LS2 plants grown in the greenhouse showed slightly increased CAT activity in their unwounded leaves compared to the background activity of untransformed tobacco leaves. In wounded leaves, an approximately 4-fold higher CAT activity was found compared to unwounded leaves. If, however, an excess of boiled potato tuber extract was added to the wound, the increase was 6 times higher than in the unsealed condition. This effect was independent of the condition of the tubers before extraction (unwound or wounded tubers or tubers freshly removed from the soil (unstored) or stored). Each extract had the same inducing effect, which indicates an inductor present in the extract.
  • the transient system was also used to test which plant species the wun1 promoter is active in and
  • this promoter is not only active in potato, tobacco and parsley protoplasts, but also in rice protoplasts shows an expression level which corresponds to the activity of a homologous system.
  • the wun1 promoter including 179 bp of the 5'-untranslated region was cloned via EcoRI-Xhol-blunt in front of an NPT-II gene (neomycin phosphotransferase-II).
  • NPT-II neomycin phosphotransferase-II
  • the wun1-NPT-II fusion was cloned into a highly replicating vector (pLS 020).
  • NPT-II activity was found in tobacco and in parsley protoplasts.
  • wun1-dependent NPT-II activity could also be detected in rice protoplasts (Oryza sativa japonica cv Taipai), the intensity of which was comparable to that of wun1 -NPTII activity in potato protoplasts.
  • Comparative transient expression of wun1-NPTII and NOS-NPTII (pGV1103) in rice protoplasts also showed similarly high values. In this together, reference is also made to the CAMV-35S-CAT-like transient expression in potato protoplasts.
  • wun1 promoter has a very high activity in both homologous and heterologous systems. Neither in parsley nor in tobacco bones nor in rice protoplasts could be found with wun1-hybridizing mRNA. Factors that stimulate the wun1 promoter must be assumed, which occur equally in all plant species tested.
  • the fusion of the wun1 promoter with the known TR promoter from the Agrobacterium tumefaciens TR-DNA may be mentioned as an example.
  • this TR promoter is responsible for the expression of mannopine synthase and has the following characteristics: 1. It is bidirectionally active, ie one fuses
  • tumefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormones. Proc. Natl. Acad. Be. USA, 86: 3219-3223.
  • the orientation of the TR promoter can be found with l 'and 2'
  • the TR promoter can be induced by wounds.
  • beta-galactosidase leads to a higher beta-gal activity in wounded transgenic tobacco plants than in unwounded ones.
  • the activity of the TR2 'promoter is mainly found in the leaf veins, that is, in the vascular bundle system.
  • TR1 'promoter 4.
  • the properties of the TR1 'promoter have so far not been investigated so intensively. However, it is known that the TR1 'promoter is about 4-7 times weaker than the TR2' promoter, but otherwise has similar properties.
  • the TR promoter was fused to the wun1 promoter, namely in the
  • TR1'-wun1 Orientation TR1'-wun1 (Fig. 12).
  • the marker gene GUS beta-glucoronidase
  • TR1'-wun1-GUS was used to demonstrate the promoter activity.
  • Agrobacterium tumefaciens transformation system this construction was used in tobacco
  • GUS activity is mainly found in the epidermis of leaves and stems.
  • TR1'-wun1-GUS transgenic tobacco the GUS activity is mainly localized in the lead bundle system. So there is the possibility, depending on the scientific question, of being able to direct gene products to different parts of the tissue. In contrast, the wound induction behavior of TR1'-wun1-GUS transgenic tobacco plants is comparable to the behavior of wun1-GUS transgenic tobacco plants.
  • TR1'-wun1 promoter among the strongest promoters available for expression in plants.
  • the wun1 promoter according to the invention can be fusioned with the TR1 'promoter in the following
  • Leaf or Stenge1 epidermis of transgenic tobacco is shifted into the lead bundle system by the fusion with the TR1 'promoter;
  • the TR1'-wun1 promoter in transgenic tobacco leaves and stems is about 10 times stronger than the wun1 promoter alone;
  • the TR1'-wun1 promoter is about 30 times stronger than the wun1 promoter in transient experiments with a representative of the monocotyledonous plants (rice).
  • the invention e.g. increase the expression of the wun1 promoter by fusing it with an enhancer element of the CamV-35S promoter.
  • an enhancer element of the CamV-35S promoter For example, the fusion of the enhancer element of the CamV-35S promoter to the 5 'end of the wun1 promoter leads to an increased wun1 promoter activity in transgenic tobacco and potato.
  • Figure 12 shows the organization of the clones wun1-GUS, TR1'-GUS and TR1'-wun1GUS.
  • Figure 13 shows Northern blot analysis of wounded and wounded transgenic tobacco leaves. Unwound (NW) and wounded (W) leaves of the transgenic tobacco plants wun1-GUS, TR1'-wun1-GUS No. 5 and No. 11 and 35S-GUS were used to isolate RNA. 50 ⁇ g of total RNA each was on a
  • Plant media The media used are derived from that of Murashige and
  • MSC10 MS + 2% sucrose, 500 ⁇ g / ml claforan,
  • MSC15 MS + 2% sucrose, 500 ⁇ g / ml claforan,
  • MS15 MS + 2% sucrose, 100 ⁇ g / ml kanamycin sulfate
  • Plasmi de: pUC8 (Vieira and Messing, Gene
  • plasmid DNA, transformation of bacteria, etc. are as described in Maniatis et al. (1982).
  • Potato bulb material was cut into 3mm thick slices
  • Leaf, stem, root and tuber material was processed immediately after its removal from the living plant or frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • the densitometric evaluations of the wun1 hybridization strength showed a 4-fold increase in the amount of wun1 mRNA just two hours after treatment of the leaves with water and spores of the incompatible phytophore species. From the 4th to the 8th hour, the amount of expression remained approximately the same before it gradually decreased to 1.5 to 2 times by the 30th hour. Wun1-mRNA showed the same expression behavior when using water without spores (control).
  • Potato tubers were homogenized without adding buffers at 4 ° C. and centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm in the SS34 rotor. The supernatant was boiled for 10 minutes and centrifuged again. The clear supernatant was added in a ratio of 1:10 to 20 mM phosphate buffer, pH 7.0 and the tissue to be tested was incubated therein under the normal conditions.
  • RNA isolation The isolation of RNA from various organs of the potato and tobacco was carried out as in Logemann et al. in anal. Biochem., 163: 16-20 (1987).
  • RNA was electrophoresed on a 1.5% formaldehyde agarose gel (Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743, (1977)). As with Willmitzer et al., EMBO J. 1, 139-146,
  • RNA was then transferred to nitrocellulose, fixed and hybridized against 32 P * radiolabeled cDNA, washed and exposed. DNA isolation
  • Nuclear DNA was obtained from potato leaves by the method of Bedbrook, PMB Newsletter II, 24 (1981) and used for cloning in LambdaPhagen EMBL4. DNA from transformed tissue was purified after the combined disruption with Triton X 100, SDS, and Proteinase K (Wassenegger, dissertation, Cologne (1988)).
  • DNA was electrophoretically separated on 0.8 to 1.2% agarose gels, transferred to nitrocellulose and fixed
  • Example 2 "Hybrid-releasec-translation" experiments The 800 bp fragment of the cDNA clone wun1-25A2 and the 700 bp fragment of the cDNA clone wun2-29C12 were obtained via Pstl
  • Reticulocyte lysate (Pelham and Jackson, Eur. J. Biochem. 67, 247 (1976)) translated in the presence of 35 S-methionine.
  • the one- or two-dimensional electrophoretic separation on a polyacrylamide gel was carried out according to Mayer et al. (1987).
  • Leaf DNA of the haploid line AM isolated according to the Bedbrook (1981) method was used as the genomic potato DNA
  • This DNA was digested completely with EcoRI.
  • EMBL4-DNA was cut into three fragments with EcoRI, using gel electrophoretic separation followed by Frag ment isolation the two vector arms could be separated from the middle fragment.
  • commercially available and cleaned EMBL4 arms were used (Amersham).
  • the packaging material comes from a "Lambda in vitro packaging kit” from Amersham.
  • the genomic library was created with a concentration of 25,000 plagues per plate
  • Chloroform was added to 20 ml of a C600-lysed bacterial culture in order to obtain a bacteria-free supernatant after subsequent centrifugation.
  • the phages were sedimented from the supernatant by centrifugation at 10,000 rpm for 4 hours.
  • the phage sediment was taken up in 500 ⁇ l phage buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl 2 ) and treated with DNase and RNase. After extraction of the DNA by repeated phenolization, the phage DNA was EtOH-precipitated, washed with 70% EtOH and taken up in TE.
  • the approximately 711 bp insert of the clone wun1-25A2 was cloned into the M13mp19 vector via the PstI sites, the orientation of the insert being determined via the asymmetric Xhol site.
  • the clones 25A2-4-mp19 and 25A-5-mp19, which differed in the orientation of the insert, were cut with Kpnl / Xbal in order to enable bidirectional exonuclease digestion into the fragment. Deletion clones of different sizes could be obtained by successively stopping the exonuclease reaction, which was prepared as a single-stranded DNA for sequencing according to the method of Sanger et al. (1977) served.
  • Starting point of the transcription is based on the fact that by hybridizing single-stranded DNA from the 5 'region of the wun1 gene with wun1-mRNA, only those regions are protected against degradation of the single-stranded nuclease S1 which, due to their homology, can form a double strand.
  • the size of the protected DNA fragment can be determined on a sequence gel and the start of transcription can thus be traced back.
  • the transcription start point was determined according to Berk and Sharp, Proc. Natl. Acad. Be. USA 75, -1274 (1987).
  • the 1.2 kb fragment was isolated from the plasmid pLS000 with EcoRI and Xhol and dephosphorylated by treatment with phosphatase.
  • the 5'OH ends were then radiolabeled by the combination of polynucleotide kinase and y- 32 -P-ATP. After denaturing the DNA fragments, they were hybridized with 50 ⁇ g total RNA (hybridization buffer: 80%. Formamide, 0.4 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4 and 1 mM EDTA).
  • the protoplasts come from a potato stem suspension culture of the Datura variety.
  • the DNA cloned in E. coli was prepared according to the method described by Van Haute et al. (1983) transferred the method using the helper strain GJ23 into the agrobacterial strain 3850.
  • the 3850 km agrobacteria required for infection were grown in selective antibiotic medium (Zambrisky et al., 1983), sedimented by centrifugation and washed in YEB medium without antibiotics. After renewed sedimentation and absorption in YEB medium, the bacteria could be used for infection.
  • NPT-II activity in transformed plants was detected according to Reiss et al., Gene 30, 217-223 (1984) and Schreier et al., EMBO J. 4, 25-32 (1985).
  • Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) activity was determined by the methods of Veiten and Schell, Nuc. Acids, Res. 13, 6981-6997 (1985) and Herrera-Estrella et al., EMBO J. 2, 987 (1983).
  • Agrobacterial strains GV3101pmp90RK Koncz, C, and Schell, J. "The promotor of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vetor", (1986), Mol. Gen. Gent 204: 383-396).
  • Plasmids pPCV720 (previously unpublished plasmid of
  • 35S-GUS pRT99-GUS (Töpfer, R., Schell, J. and
  • TR1'-GUS (Logemann et al., In press)
  • RNA isolation “Northern blot” analysis, DNA isolation, transient expression in rice protoplasts, “Southern blot” analysis and DNA analysis of agrobacteria, reference is also made to Examples 1-8.
  • the DNA cloned in E. coli was prepared according to that of Van Houte, E., Joos, H., Maes, M., Warren G., Van Montagu, M., Schell, J.
  • the GV3101pmp90RK agrobacteria which contain the desired plasmid, were grown in selective antibiotic medium (hygromacin), sedimented by centrifugation and washed in YEB medium (Maniatis et al, 1982) without antibiotics. After renewed sedimentation and absorption in YEB medium, the bacteria could be used for infection.
  • selective antibiotic medium hygromacin
  • YEB medium Maniatis et al, 1982
  • Dirnethylformamide are pH 50 in 50 mM phosphate buffer
  • Thin tissue sections are incubated as described under "wounded plant tissue” and then stained in X-Gluc solution overnight at 37 ° C. Finally, the chlorophyll is removed by adding 100% methanol at 60 ° C.
  • Thin tissue sections are incubated in X-Gluc solution, which also contains the translational inhibitor cycloheximide (1.8 mM). Incubation period and methanol treatment is identical to the wounded tissue.
  • pollen grains are incubated directly in X-Gluc. without the formation of pollen tubes.
  • the TR1 'promoter becomes transcriptional with the GUS gene
  • TR1'-wun1-GUS
  • the pA signal of the octopine synthase gene is cloned behind the 1 'promoter of the TR promoter in order to prevent transcription through the wun1 promoter.
  • Behind the OCS pA signal lies the wun1 promoter (1022 bp), which (in homology to the wun1-GUS construction) over 179 bp des
  • untranslated 5 'region of the wun1 gene is fused to the GUS gene transcriptionally.
  • the pA signal of the 35-S gene serves as the termination sequence for the GUS gene.
  • TR1'-wun1-GUS lies in the binary
  • Vector pPCV720 which can replicate itself both in E. coli and in agrobacteria (with the help of a helper plasmid).
  • RNA from wounded and from unwounded leaves of various TR1'-wun1-GUS transgenic tobacco plants as well as from wun1-GUS and 35S-GUS leaves was isolated and radioactively labeled GUS-DNA hybridizes.
  • RNA is higher both in TR1'-wun1-GUS plants and in wun1-GUS plants in wounded leaves than in unwounded leaves.
  • the wound inducibility already known for wun1-GUS is thus also confirmed for TR1'-wun1-GUS.
  • TR2'1'-wun1-GUS plants A quantitative analysis of the GUS activity of transgenic TR1'-wun1-GUS plants shows that the TR2'1'-wun1 promoter in transgenic leaves can be induced by a factor of 2 to 13 times by wounding (about 6 times on average). This roughly corresponds to the wound inducibility of the wun1 promoter in transgenic leaves (Logemann J., Lipphardt S., Lörz H., whether I., Willmitzer L. and Schell J. "5'upstream segments from the wun1-gene are responsible for gene activation by wounding in transgenic plants "The Plant Cell 1: 151-158 (1989A)).
  • the promoter is 10 times stronger than the wun1 promoter.
  • the TR1'-wun1 promoter is about 100 times stronger than the TR1 'promoter.
  • the activity of the wun1 promoter is mainly limited to the epidermis (including trichomes) and to a lesser extent to the
  • the wun1 promoter activity is thus to be regarded as epidermis-specific in leaves and stems.
  • TR1'wun1-GUS plants an intense blue coloration can be seen in the guide bundle system of wounded leaf sections. In other areas (epidermis, parenchyma) the color is only weak. Unwound leaf cuts show a slight blue color in the lead bundle system and no color in the epidermis. The same results are achieved with stem cross sections.
  • TR1 'wun1-GUS is a promoter which is specific in the guide bundle system and expresses in leaves and stems. A relative comparison of promoter activities in transgenic tobacco leaves and stems shows that the wun1 promoter is about 10 times stronger than the TR1 'promoter.
  • the TR1'-wun1GUS is a promoter which is specific in the guide bundle system and expresses in leaves and stems. A relative comparison of promoter activities in transgenic tobacco leaves and stems shows that the wun1 promoter is about 10 times stronger than the TR1 'promoter.
  • the promoter is 10 times stronger than the wun1 promoter.
  • the TR1'-wun1 promoter is about 100 times stronger than the TR1 'promoter.
  • the activity of the wun1 promoter is mainly limited to the epidermis (including trichomes) and to a lesser extent to the
  • the wun1 promoter activity is thus to be regarded as epidermis-specific in leaves and stems.
  • TR1'wun1-GUS plants an intense blue coloration can be seen in the guide bundle system of wounded leaf sections. In other areas (epidermis, parenchyma) the color is only weak. Unwound leaf cuts show a slight blue color in the lead bundle system and no color in the epidermis. The same results are achieved with stem cross sections.
  • TR1 'wun1-GUS is an in
  • TR1 'GUS plants Leaves and stems of a promoter expressing the guide bundle system.
  • Leaf sections of TR1 'GUS plants served as a control. Because of the weak promoter activity of the TR1 'promoter (10 times weaker than the wun1 promoter), no blue coloration is discernible either in wounded or in unwounded cross sections of the leaf.
  • 35S-GUS were used for transient expression studies with rice protoplasts of the variety (Oryza sativa japonica cv Taipai). As Table 1 shows, the activity of TR1'-GUS does not differ significantly from the control (GUS activity of rice protoplasts that were transformed without DNA). wun1-GUS and 35S-GUS show 2-3 times higher activity than the control. TR1'-wun1-GUS DNA, on the other hand, shows on average 57 times higher activity than the control and is therefore a highly active promoter in rice protoplasts.
  • the indicated GUS activity was determined from 5 independent experiments.
  • Table 1 The statement in Table 1 can be substantiated by staining the protoplasts with X-Gluc. Only protoplasts transformed with TR1'-wun1-GUS show an intense blue color.

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Description

Verwundungsstimulierte DNA-Sequenz aus Solanum tuberosum
und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft verwundungsstimulierte DNA aus Solanum tuberosum sowie Teile davon, deren Verwendung zur Expression von Genprodukten in höheren Pflanzen bei Verwundung oder
pathogenem Befall, diese enthaltende DNA-Ubertragungsvektoren und diese enthaltende Pflanzen oder Pflanzenteile.
Es ist bekannt, daß die mechanische Verwundung von Pflanzengewebe morphologische und physiologische Veränderungen bewirke kann. So steigt die Aktivität verschiedener Enzyme nach der Verwundung an, beispielsweise von Phenylalaninammoniumlyase und Peroxidasen in Kartoffelknollen, Extensin im Speichergewebe der Karotte, Fettsäuresynthetase in Kartoffelknollen und Proteinaseinhibitoren in Tomaten- und Kartoffelblättern. Bei einigen dieser Enzymen ist die Aktivitätszunahme mit erhöhten mRNA-Spiegeln verbunden. Eines der am besten verstandenen verwundungsinduzierten Gene ist der Proteinaseinhibitor in Tomaten und Kartoffeln; in verletzten Blättern ist die mRNA für dieses Gen deutlich erhöht.
Die verwundungsinduzierte Expression von Genen in Pflanzen ist von grundsätzlichem Interesse, da die hierbei wirksam werdenden Promotoren in der Lage sind, das zugehörige Strukturgen nach einer Verwundung spezifisch zu aktivieren. Derartige Promotoren, in Verbindung mit anderen Genen, die beispielsweise Resistenzen verleihen , antibiotisch wirksame Substanzen codieren oder die Heilung von Verletzungen fördern, sind natürlich von großem wirtschaftlichem Interesse, wenn sie in das genetische Material von anderen Pflanzen eingeschleust werden können.
Es wurde nun gefunden, daß es in verwundeten und/oder von Keimen befallenen Kartoffelpflanzen spezifisch zur Bildung von relativ hohen Konzentration von induzierter mRNA kommt. Diese mRNA konnte isoliert und charakterisiert werden; sie tritt in gesunden, unverwundeten Pflanzen nicht auf.
Gegenstand der Erfindung sind demnach DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum, die durch Verletzung und/oder Infektion mit pathogenen Keimen stimuliert werden, sowie deren Teile, insbesondere der Promotorteil und der Strukturgenteil. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung dieser DNA-Sequenzen zur Expression von Genprodukten in höheren Pflanzen bei Verletzung und/oder pathogenem Befall.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin DNA-Übertragungsvektoren mit darin insertierten DNA-Sequenzen, wie sie vorstehend definiert wurden. Schließlich sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen- oder Pflanzenmaterialien, welche eine solche DNA- Sequenz enthalten.
Unter dem Begriff "aktiver Bereich" eines Gens, seines Promotor- oder Strukturgenteils werden diejenigen Nukleotid-Sequenzen verstanden, die im Promotorteil des Gens für die Aktivierung des Strukturgenteils und im Strukturgenteil zur Expression eines wirksamen bzw. aktiven Genprodukts unbedingt benötigt werden.
Unter "Strukturgen" wird nicht nur das im homologen System der hier beschriebenen DNA-Sequenz aus Solanum tuberosum verstanden, sondern auch Strukturgene anderer Herkunft, also aus heterologen Systemen. Als Beispiele wird auf die CAT-, NPT- und GUS-Strukturgene hingewiesen, die mit dem hier beschriebenen verwundungsstimulierbaren Promotorteil fusioniert werden können und zur Expression des jeweiligen Strukturgens in der Kartoffel oder fremden Pflanzen verwandt werden können.
Als Ubertragungsvektoren können jegliche geeignete DNA-Moleküle verwandt werden, die in das letztendlich aufnehmende Bakterium eingeführt werden können. Gewöhnlich sind dies Plasmide, wie sie im Materialienteil näher beschrieben sind. Die Insertionstechniken sind dem Fachmann bekannt.
Als Bakterien zur Aufnahme und Weitergabe des Ubertragungsvektors können Bakterien der Gattung Agrobacterium, insbesondere Agrobacterium tumefaciens und Agrobakterium rhizogenes verwandt werden.
Die EP-A 122 791 beschreibt einen DNA-Ubertragungsvektor, der T-DNA mit einem darin insertierten Pflanzengen umfaßt. Dieses Pflanzengen besteht aus einem Pflanzenpromotor und einem Pflanzenstrukturgen, wobei der Pflanzenpromotor an das 5'-Ende des Pflanzenstrukturgens angrenzt und das Pflanzenstrukturgen in der Transkriptionsrichtung hinter dem Pflanzenpromotor angeordnet ist. Die EP-A 122 791 beschreibt ausführlich Verfahren und Maßnahmen zur Insertierung von genetischem Material in DNA-Übertragungsvektoren, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Untersuchungen haben gezeigt, daß Erwinia-Bakterien latent auf Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum) vorhanden sind, und erst parallel zu einer Verwundung des Gewebes vorwiegend Stamm und Knolle der Kartoffel befallen. Dies wurde an Kartoffelknollen der Sorte Datura induziert, indem die Knolle in Scheiben geschnitten und gleichzeitig mit Erwinia carotovora ssp. atroseptica inkubiert wurde. Wie erwartet wiesen diese Knollen nach 18-stündiger Inkubation eine stark mazerierte Oberfläche auf. Die Isolation von mRNA aus dem darunter liegenden Gewebe war mit herkömmlichen Methoden nicht möglich. Hohe Kontamination der RNA durch Polysaccharide, schlechtes Präzipitations- und Lösungsverhalten der RNA, ein hoher Grad an RNA Degradation, geringe RNA-Ausbeute und hoher Arbeits- und Materialaufwand waren die Ursachen. Durch Variation und Neukombination bestehender Methoden konnte aber eine Technik entwickelt werden, die hohe Mengen an undegradierter RNA bei geringem Material- und Zeitaufwand auch aus polysaccharidhaltigem Gewebe zu isolieren imstande war (Logemann et al., Anal. Bioch. 163, 16, 1987).
Auf Basis gereinigter polyA RNA aus verwundeten und zusätzlich mit Erwinia inkubierten Knollen der Kartoffelsorte Granola wurde eine cDNA-Bank aufgebaut. Durch differentielle Koloniehybridisierung von 4000 cDNA-Klonen gegen radioaktiv markierte RNA aus unverwundeten und Erwinia-verwundeten Knollen konnten 2 Klone, hier wun1 und wun2 genannt, identifiziert werden, deren komplementäre mRNA in Knollen verschiedener tetraploider Kartoffelsorten sowie der haploiden Sorte AM 80/5793 durch Verwundung induziert werden. Wunl-mRNA akkumuliert bereits 30 Minuten nach der mechanischen Verwundung einer Knolle und ist damit in verwundungsinduzierte Primärprozesse involviert, während wun2 erst 3,5 Stunden später induziert wird. Beide Klone zeigen auch 24 Stunden nach der Verwundung noch hohe Expressionswerte an. Wird zusätzlich zur mechanischen Verwundung die Knolle mit Erwinia carotovora ssp. atroseptica inkubiert, so finden keine Veränderungen am Expressionsschema statt. Insgesamt haben die Expressionsstudien an der Knolle ergeben, daß wun1- und wun2-mRNA's Gene repräsentieren, die nicht Erwinia-spezifisch induziert werden, sondern durch alle Vorgänge, die Zerstörung des Knollengewebes zur Folge haben, stimulierbar sind.
Wun1-mRNA akkumuliert in hohen Mengen in verwundeten Kartoffelknollen (mengenmäßig vergleichbar mit Proteinase-InhibitorllmRNA in unverwundeten Kartoffelknollen, vgl. Sanchez-Serrano et a., Mol. Gen. Genet. 203, 15 (1986)), dagegen ist sie in unverwundeten Knollen nicht nachweisbar. Sie erscheint bereits 30 Minuten nach Verwundung mit einem Maximum ab der 4ten bis 24ten Stunde nach Verwundung. In geringeren Mengen war sie auch noch nach 48 Stunden nachweisbar.
Die Akkumulation von wun1- und wun2-mRNA nach Verwundung ist nicht auf die Knolle beschränkt, sondern findet auch in Blätter, Stämmen und Wurzel verschiedener tetraploider Kartoffelpflanzen mit ähnlicher Kinetik und Intensität statt.
Wunl-mRNA wird im Gegensatz zur wun2-mRNA auch ohne Verwundung in Blättern induziert, wenn diese mit kompatiblen Phytophtora infestans-Sporen besprüht werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß wun1 nicht nur durch mechanische Verwundung induzierbar ist, sondern auch durch die Anwesenheit von (pilzlichen) Pathogenen.
Es ergaben sich Unterschiede in der Expression des wun1-Gens, je nachdem ob die Knollen unter aeroben Bedingungen verwundet wurden (Knollenscheiben wurden mit P-Puffer benetzt und für 18 Stunden inkubiert, sie waren somit weiterhin dem Luftsauerstoff ausgesetzt) oder unter anaeroben Bedingungen verwundet wurden (Knollenscheiben wurden in P-Puffer eingetaucht und in diesem luftsauerstoffarmen Zustand für 18 Stunden inkubiert).
Wunl-mRNA wurde in aerob verwundeten Knollen höher exprimiert, als im entsprechenden anaeroben Ansatz.
Wichtig für die erfindungsgemäße Verwendung der Promotoren zur Expression von Genen ist, ob die nach Verwundung nachweisbare wun1- bzw. wun2-mRNA durch Neusynthese entsteht (transkriptionelle Regulation), oder aber constitutiv vorhanden ist, und nur im Falle einer Verwundung stabil vorliegt (posttransknptionelle Regulation).
"Run-Off" Transkriptionstests konnten sowohl bei wun1 als auch bei wun2 transskriptionelle Regulation feststellen, was bedeutet, daß die Promotoren dieser Gene im Falle einer Verwundung für die Neusynthese verantwortlich sind. Nach bekannten Verfahren wurden aus der tetraploiden Kartoffel "Granola" eine Reihe von Wunl-homologen cDNA-Klonen erhalten, von denen einige sequenziert wurden. Durch die Klonierung von wun1-25A2 in M13mp19-P nagen in beiden Orientierungen und partielle Exonukleaselll-Verdauung konnte die Nukleotidsequenz bidirektional nach der Dideoxymethode bestimmt werden.
Fig. 1 zeigt die relative Größe der zur Sequenzierung verwandten Klone. Der Klon wun1-25A2 liegt in zwei Orientierungen in der Pstl-Schnittstelle vor, die aufgrund der Lage des asymmetrischen Xhol Schnittstelle als 25A2*MP19 und 25A2MP19 bezeichnet werden. Durch sukzessive Exonukleaselll-Verdauungen konnten unterschiedlich große Deletionsklone erhalten werden, die als Klone 25A2*MP19delta 1-3 bzw. 25A2MP19delta 1-4 zur
Sequenzierung zur Verfügung standen.
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des cDNA-Klons wun1-25A2. Alternative offene Lesearten sind unterstrichen.
Die Größe des cDNA-Klons wun1-25A2 beträgt 711 bp. Am 3-Ende ist ein Poly-A-Schwanz von 14 bp zu finden (Position 697-711) . Das größte offene Leseraster erstreckt sich über 105 Aminosäuren (Position 121-438). Weiter 5'-gelegen befinden sich außerdem zwei kurze offene Leseraster, die an Position 23 für 3 Aminosäuren kodieren und an Position 95 für 8 Aminosäuren kodieren (unterstrichen). Die beiden zuletzt angeführten offenen Leseraster unterscheiden sich jedoch vom Leseraster, das die 105 Aminosäuren kodiert. Unter Berücksichtigung der genomischen Sequenzdaten (Fig. 6) ist das für 105 Aminosäuren kodierende Leseraster als das des wun1-Proteins anzusehen. Der Translationsstartpunkt des wun1-Proteins TTTTTGATGCAA stimmt nur in geringern Maße mit der von Joshi, Nuc. Acids Res. 15, 6643, (1987) ermittelten Konsensussequenz für pflanzliche Translationsstarts TAAACAATGGCT überein.
Die Untersuchung der genomischen Organisation des für wun1-mRNA kodierenden Gens in der haploiden Kartoftellinie AM80/5793 zeigt, daß dieses Gen in nur geringer Kopienzahl vorliegt. Die Hybridisierung radioaktiv markierter wun1-cDNA gegen HindllI-, PstI- und EcoRI-geschnittene Blatt-DNA führte in der "Southern- Blot"- Analyse zur Ausprägung von jeweils einer starken und 1 bis 2 schwachen Banden. Das Ergebnis der "Southern-Blot"-Analyse von wun1- und von wun2-cDNA ist in Fig. 3 dargestellt.
Die "Southern-Blot"-Analyse konnte in der haploiden Kartoffellinie AM80/5793 nur wenige für die Expression von wun1- und wun2-mRNA verantwortliche Gene nachweisen. Die Chance, ein aktives Gen und kein inaktives Pseudogen zu erhalten, war hier besonders hoch.
Die Präsenz nur einer ausgeprägten Bande im "Southern-Blot" der haploiden Kartoffellinie läßt auf eine geringe Anzahl an Genet pro Genom schließen. Betrachtet man dies im Zusammenhang mit einer verwundungsspezifischen und hohen Expression an wun1-mRNA in der haploiden Linie und der transkriptioneilen Expressionsregulation, so sind hochaktive Gene wahrscheinlich.
Zur Anlage einer genomischen Bank wurden 10 μg EcoRI-geschnittene DNA aus AM80/5793 mit EcoRI-geschnittenen EMBL4-Armen ligiert und auf einem C600-Bakterienrasen ausplattiert. Etwa 500000 Plagues wurden erhalten, die statistisch gesehen das Genom der Kartoffel repräsentieren sollten. Nach dem Transfer dieser Plagues auf Nitrozellulose konnte durch Plaquehybridisierungstechniken gegen radioaktiv markierte wun1-cDNA der genomische Klon wun1-22 und wun1-85 identifiziert und gereinigt werden.
Die Isolierung von rekombinanter EMBL4-DNA aus wun1-22 und wun1-85 sowie deren Restriktionskartierung und Hybridisierung gegen radioaktive wun1-cDNA ergab die folgende Organisation.
Das wun1-cDNA-äquivalente Fragment in wun1-85 hat eine Größe von 4 Kb. Es entspricht damit exakt mit der in wun1-cDNA hybri disierenden Fragmentgröße EcoRI-verdauter DNA aus der haploiden Kartoffel. Aufgrund der asymmetrischen Xhol-Schnittstelle im 5 ' -Bereich des cDNA-Klons konnte die Orientierung des Gens in dem 4-Kb-Fragment ermittelt werden. Demnach liegt vor dem wun1-Gen ein etwa 1 Kb großer Promotorenbereich, während sich 3' vom Gen ein etwa 2 Kb großer nicht homologer Teil befindet. Das zusätzlich in wun1-85 enthaltene 8 Kb große EcoRI-Fragment konnte nicht zur näheren Analyse des wun1-Gens herangezogen werden. Aufgrund des Totalverdaus der Kartoffel-DNA mit EcoRI ist es wahrscheinlich, daß bei der anschließenden Ligation zwei nicht zusammengehörige Fragmente in den EMBL4-Vektor gebracht wurden, die demnach nicht in funktioneller Beziehung zueinander stehen können.
Fig. 4 zeigt die Anordnung von wun1 in dem genomischen Klon wun1-85. Auf dem 4 Kb großen EcoRI Fragment des genomischen Klons wun1-85 sind 1,0 Kb des wun1-Promotors, 0,8 Kb des wun1-Gens sowie 2,0 Kb des 3'-Endes vorhanden.
Da im Restriktionsverhalten keine Unterschiede zwischen wun1-85 und wun1-22 festgestellt wurden, wurde zur weiteren Analyse des 4 Kb-Fragments von wun1-85 in EcoRI-geschnittenen pUC8 ligiert (s. Fig. 4). Zur Sequenzierung des wun1-Promotors sowie des wun1-Gens erfolgte eine weitere Umklonierung des 4 Kb-Fragments in die EcoRI-Schnittstelle von M13mp18. Die Bestimmung seiner Orientierung wurde mittels Kontrollverdauungen an der asymmetrisch gelegenen Xhol-Schnittstelle durchgeführt. Die Klone 85*mp18 und 85mp18 repräsentieren beide Orientierungen des
Fragments. Das Schneiden dieser Plasmide mit SphI und Xbal ermöglichte es, mit Hilfe der Exonukleaselll beim Klon 85mp18 des 3'-Endes des wun1-Gens und beim Klon 85*mp18 das 5'-Ende des wun1-Gens sukzessive abzudauen.
Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Deletionsanalyse des Klons wun1-85 in schematischer Form. Die resultierenden Deletionsklone mit unterschiedlichen Fragmentgrößen wurden für die Sequenzierung benutzt. Insgesamt gelang es, das gesamte wun1-Gen bidirektional zu sequenzieren, sowie zusätzlich etwa 400 bp des 3'-Endes unidirektional zu analysieren.
Fig. 6 zeigt die Nukleotidsequenz des wun1-Promotors und Gens aus wun1-85. CAAT-Box, TATA-Box und Poly-A-Signal sind herausgehoben, Transskriptionsstart und -stop durch Pfeile markiert. Zur Identifikation des genauen Transkriptionsstarts des wun1- Gens wurde die Methode der Sl-Nuklease-Kartierung benutzt.
Fig. 7 erläutert die Bestimmung der Größe des S1-geschützten Fragments des wun1-Gens. Die Hybridisierung des 5' von der
Xhol-Schnittstelle gelegenen Bereichs aus pLS000 mit wun1-mRNA führt zu einem 162-179 bp langen DNA-RNA-Hybrid (TU), das vor der einzelstrangspezifischen Sl-Nuklease geschützt ist. Der tatsächliche Transkriptionsstart liegt also 162-197 bp 5' von der Xhol Schnittstelle entfernt (A,C,G,T = Sequenzauftragung zur Größenbestimmung des DNA-Fragment).
Geht man von dem längsten erhaltenen Fragment aus, so beginnt der Transkriptionsstart 179 bp stromaufwärts von der Xhol-Stelle, d.h. mit der Sequenz ACCATAC. Diese Sequenz stimmt im zentralen Bereich (CAT) mit der von Joshi et al. (1987) ermittelten Konsensussequenz für Transkriptionsstart CTCATCA überein. Aus der Position des Transkriptionsstarts ergeben sich weitere Informationen (s. Fig. 6):
(1) In Position-33, gesehen vom Transkriptionsstart, ist eine TATA-Box CTATATATT zu finden, die gut mit der von Joshi et al. (1987) ermittelten Konsensusseguenz TCACTATATATAG übereinstimmt.
( 2) Die von Benoist et al., Nuc. Acids Res. 8, 127-142 (1980) beschriebene CAAT-Box im Bereich zwischen -60 und -80 ist im wun1-Promotor in Position -58 (CAAACT) zu finden. (3) Der 5'-untranslatierte Bereich des wun1-Gens erstreckt sich über 217 bp und ist damit verhältnismäßig groß.
(4) Das wun1-mRNA kodierende Gen umfaßt 794 bp, was sehr genau der Größenbestimmung von wun1-mRNA aufgrund der "Northern-Blot"- Analysen entspricht.
(5) Dem cDNA-Klon wun1-25A2 fehlen 97 bp des 5'-untranslatierten Bereichs im wun1-Gen.
(6) Neben den bereits im cDNA-Klon ermittelten offenen Leserastern werden keine weiteren im 5'-'ntranslatierten Bereich des genomischen Klons gefunden.
(7) Das wun1-Gen verfügt nicht über Introns.
Fig. 8 zeigt die Anordnung und Position wichtiger Bereiche im wun1-Gen. Der wun1-Promotor ist schwarz markiert, das wun1-Gen schraffiert. Wichtige Erkennungssequenzen sind eingerahmt; Die mRNA ist durch eine geschlängelte Linie, der proteinkodierende Bereich durch Kreuze wiedergegeben. Die Größe der einzelnen Bereiche ist in Basenpaaren (bp) angegeben.
Fig. 9 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen dem cDNA-Klon wun1-25A2 und dem genomischen Klon wun1-85. 2368 bp des genomischen Klons wun1-85 wurden mit 711 bp des cDNA-Klons wun1-25A2 verglichen. Homologe Basenpaarungen sind durch einen senkrechten Strich gekennzeichnet. Das Fehlen von Nukleotiden wird durch einen Punkt aufgezeigt. Die zwei Pfeile dokumentieren die Sequenz zweier 10 bp langer direkter Sequenzwiederholungen im cDNA-Klon.
Vergleichende Analyse zeigt, daß die Sequenz des genomischen Klons wun1-85 der haploiden Kartoffel AM80/5793 mit der Sequenz des cDNA-Klons wun1-25A2 der tetraploiden Kartoffel "Granola" zu 97 % homolog ist. Insgesamt konnten 11 Basenaustausche iden tifiziert werden, davon 5 im translatierten Bereich. Alle 5 Basenaustausche im translatierten Bereich führten zu keiner Veränderung der Aminosäuresequenz. Die zusätzlich sequenzierten 400 Nukleotide stromabwärts des Transkriptionsstops wiesen keine bemerkenswerten Bereiche auf.
Das Gen codiert für ein 12000 Dalton großes Protein, dessen Größe auch in Hybrid-Released-Translation-Experimenten ungefähr bestätigt werden konnte. Computerauswertungen bezüglich der Aminosäurezusammensetzung des wun1-Proteins ergaben, daß es sich um ein sehr hydrophiles Protein handelt. Die Aminosäuresequenz ergibt sich aus Fig. 2 und 6.
Die Größe des wun1-Proteins, seine hydrophilen Eigenschaften, die Verwundungsinduzierbarkeit in verschiedenen Geweben und die Induzierbarkeit durch Pathogene lassen auf seine Zugehörigkeit zu den PR-Proteinen schließen. Mit dem Namen PR- oder "Pathogenesis-related"-Protein werden Proteine verschiedener Pflanzen zusammengefaßt, die unter anderem durch pathogenen Befall induzierbar sind und in einigen Fällen Chitinase- bzw. GlucanaseAktivität aufweisen, also die Aktivität von Enzymen, die Zellwände von Pilzen zerstören können.
Der vollständige genomische wun1-Klon inclusive wun1-Promotor und wun1-Gen wurde unter Verwendung des Agrobakterium-TransformationsSystems in transgenen Tabakpflanzen getestet. Eine Expressionsstudie war auf mRNA-Ebene möglich, da Tabak-mRNA nur sehr schwach mit wun1 kreuzhybridisiert und zusätzlich über keine wun1-homologen 5'-Enden verfügt, wie aus S1-Nuklease-Kartierungen zu entnehmen war. Tatsächlich wurde in transgenen Tabakpflanzen in verwundeten Blättern hohe Mengen an etwa 800 bp großer wun1-mRNA nachgewiesen, was einerseits einen aktiven wun1-Promotor dokumentiert, andererseits auch die Verwendung des richtigen Transkriptionsstartpunktes zeigt.
Ein 4 Kb-Fragment aus pLS000, welches den wun1-Promotor, das vollständige wun1-Gen, sowie 2 Kb des 3'-Bereichs des Gens ent hält (wun1-wun-1) wurden über die EcoRI-Schnittstellen in den für die Agrobacterium tumefaciens (At)Transformation benötigten Mobilisierungsvektor pMPK110 kloniert (pLS001). Nach erfolgtem Transfer in das At3850km, wurde die Tabaklinie Wisconsin 38 (W38) mit diesem Agrobakterium über Blattstücke transformiert. Die unter Kanamycinselektion nach etwa 3 Wochen erscheinenden kleinen Kalli wurden durch die Verwendung eines Sproßinduk- tionsmediums zur vollständigen Pflanze (LSI) regeneriert.
Neben der Fähigkeit, auf Kanamycin wachsen zu können, besitzen mit 3850K m transformierte Pflanzen die Fähigkeit zur Synthese von Nopalin, eine Eigenschaft, die sie von untransformierten Pflanzen unterscheidet (Zambryski et al, EMBO J. 1 147-152
(1985)). Wunl-wun1 transformierte Pflanzen, hier LS1-Pflanzen genannt (4= LS1-4; 6=LS1-6), zeichneten sich durch hohe Nopalinmengen aus. In untransformierten Pflanzen war dagegen kein
Nopalin nachweisbar. Kanamycin-resistente und Nopalin-positive LS1-Pflanzen wurden in das Gewächshaus transferiert und auf DNA- und RNA-Ebene analysiert.
Fig. 10 zeigt die Konstruktion von wun1-wun1- und wun1-CAT- Fusionen, die für Expressionsuntersuchungen auf Basis von transienten Expressionen und stabilen Transformationen verwandt wurden.
(1) Herstellung des Plasmids pLS001:
Ausgehend von Plasmid pLS000 (s. Fig. 4) wurde das 4 Kb-Fragment, das den wun1-Promotor , das wun1-Gen sowie 2 Kb des 3'-Endes enthält, über die EcoRI-Schnittsteile in den Vektor pMPK110 kloniert (pLS001). Dieses pMPK110 Derivat erlaubt den Transfer der wun1-wun1-Konstruktion ins Agrobakterium 3850Km.
(2) Herstellung des Plasmids pLS011:
Der wun1-Promotor sowie 179 BP des 5'-untranslierten wun1-Genbereichs wurden über die Xhol Schnittstelle mit dem CAT-Gen inclusive 3'-Ende fusioniert (pLS010). Eine Umklonierung über PstI in den Vektor pMPK110 (pLS011) hat den Vorteil, daß dieses Plasmid einerseits für transiente Studien in Protoplasten benutzt werden kann und andererseits auch als Mobilisierungsplasmid zum Transfer der wun1-CAT-Konstruktion in das Agrobakterium 3850Km fungiert.
Die "Southern-Blot"-Analyse EcoRI verdauter DNA aus transgenen
LS1-Tabakpflanzen, sowie untransformierter W38-Tabakpflanzen ergab bei Verwendung einer 32P-radioaktiv mar kierten wun1-cDNA
Probe sowohl in den untransformierten als auch in den tranformierten Pflanzen DNAs eine positive Hybridisierung. In beiden Fällen war eine starke und eine schwache Bande erkennbar. In den transgenen LS1-Pflanzen erschien jedoch zusätzlich eine 4 Kb große Bande, die in ihrer Größe exakt der Größe des EcoRIInserts aus pLS000 entsprach. Durch verleichende Auftragung verschiedener DNA-Mengen konnte eine 2 bis 5fache Kopienzahl von wun1-wun1 in allen getesteten LS1-Pflanzen ermittelt werden. In einiien LS1-Pflanzen wurden zusätzliche Banden im hochmolekularen Bereich gefunden, die vermutlich auf rearrangierte DNA oder unverdaute DNA zurückzuführen sind.
Eine funktioneile Analyse der wun1-wun1-DNA positiver LS1-Pflanzen war auf RNA-Ebene möglich. Sowohl in verwundeten als auch in unverwundeten untransformierten Tabakpflanzen war nur eine sehr schwache Kreuzhybridisierung gegen eine wun1-cDNA-Probe vorhanden. Zusätzlich wurde isolierte RNA aus untransformierten Tabakpflanzen gegen den 5'-Bereich des wun1-Gens, das den
5'-untranslierten Bereich und den wun1-Promotor enthält (analog zum Fragment zur Transkriptionsstartbestimmung des wun1-Gens) über S1-Analyse auf homologe Bereiche hin getestet. Es zeigte sich, daß weder in unverwundeten noch in verwundeten untransformierten Tabakblättern oder -Stengeln wun1-homologe Sequenzen vorhanden waren.
Von 30 Nopalin-positiven LS1-Pflanzen, die auf RNA-Ebene untersucht wurden, zeigten 5 Pflanzen in "Northern-Blot"-Experimen- ten hohe Mengen an 800 bp großen mit wun1 hybridisierenden mRNA's. Deren S1-Analyse führte zum Nachweis zweier gleich großer DNA-Fragmente, die in ihrer Größe den Fragmenten aus verwundeten Kartoffelblättern entsprachen. Dies war die Bestätigung, daß es sich hier um wun1-homologe mRNA handelt. Mehrere Hinweise sprechen dafür, daß wun1-homologe mRNA auch als Antwort auf hohen TMV-Befall gebildet wird.
Ein Ziel der Erfindung ist die Konstruktion und Isolierung von Genen, die in der Lage sind, den Aufforderungen entsprechend fusionierte Proteine zu exprimieren. Hierzu ist erforderlich, daß der wun1- Promotor allein für die Expression des nachgeschalteten Strukturgens verantwortlich ist, was nicht immer der Fall sein muß (Bsp. Proteinase-Inhibitor II).
Es wurden transskriptionelle Fusionen, bestehend aus dem wun1- Promotor und 178 bp des S'-untranslierten Gens, mit verschiedenen Strukturgenen fusioniert (wun1-CAT, wun1-NPT, wun1-GUS), deren Nachweis über radioaktive oder fluorimetrische Methoden möglich war. (GUS steht für ß-Glucuronidase (Jefferson et al, Proc. Nat. Acad. Sei. 83, 8447-8451 (1987)).
Die Konstruktion wun1-CAT wurde in Kartoffelprotoplasten auf ihre transiente Funktionalität getestet. Diese Methode ermöglicht es, innerhalb von wenigen Tagen Promotoraktivitäten zu analysieren, indem hochgereinigte Plasmid-DNA, die die Konstruktionen enthält, mittels bekannter Methoden in Protoplasten transferiert wird, dort stabil vorliegt und auch abgelesen werden kann. Voraussetzung für eine Expression ist, daß der Promotor funktioneil ist, und daß die induzierenden Faktoren in solchermaßen behandelten Protoplasten vorhanden sind.
Bei diesen Tests wurde der wun1-Promotor inclusive 179 bp des 5'-untranslierten Bereichs transkriptioneil mit dem Chloramphenicolacetyltransferase-Gen (CAT) fusioniert. Die Konstruktion der wun1-CAT-Fusion ist in Fig. 10 dargestellt. Der im pRT101-CAT enthaltene 35S-Promotor wurde über die
Schnittstellen HincII/XhoI entfernt und statt dessen der 1,0 Kb große wun1-Promotor mitsamt 179 bp des 5'-untranslatierten Bereichs über eine aufgefüllte EcoRI Schnittstelle und Xhol eingesetzt. Dieses Chimäre Gen wun1-CAT konnte über die Pstl- Schnittstellen in den Vektor pMPK110 gebracht werden (pLS011) .
In den für transiente Tests verwendeten Kartoffelzellsuspensionen sowie daraus gewonnenen Protoplasten konnten hohe Mengen an endogener wun1-mRNA festgestellt werden . Es wird angenommen , daß die Flüssigkultivierung von Zellen und vor allem die Protoplastierung einen hohen Streß auf die Zelle ausüben, was sich analog dem Verhalten in der Kartoffelknolle in einer hohen Expression von wun1-mRNA äußert.
Zur transienten Analyse der wun1-CAT Konstruktion wurden jeweils 1 Million Protoplasten aus einer Suspensionskultur aus Kartoffelstengeln der Varietät Datura (D12) isoliert und nach der CaCl2/PEG-Methode mit 20 μg pLS011-DNA transformiert.
Die CAT-Analyse solcher mit pLS011-DNA-transformierten Protoplasten ergab hohe CAT-Aktivitäten. Ein paralleler Versuchsansatz mit einer CAMV-35S-CAT-Konstruktion (35S-Promotor aus dem Cauliflower-Mosaikvirus (CAMV) ) (pRT101-CAT) brachte in etwa vergleichbare CAT-Aktivität, während in einem Kontrollansatz ohne Zusatz von DNA keine CAT-Aktivität zu erkennen war. Dies bedeutet, daß in einem transienten Kartoffelprotoplastensystem die Aktivität des wun1-Promotors mit der des 35S-Promotors vergleichbar ist und somit als sehr hoch einzustufen ist. Der CAMV-Promotor gilt als stärkster bisher bekannter Promotor in Pflanzen.
Das schon im transienten System benutzte Plasmiά pLS011
(wun1-CAT) konnte weiterhin zur Transformation von At 3850 Km benutzt werden. 3850Km::pLS011 Agrobakterien wurden über die Methode der Blattscheibeninfektion zur Transformation der Tabaksorte Samsum NN (SNN) benutzt und entstehende Kalli zur Pflanze (LS2) regeneriert. Durch die Verwendung dieses Tabakmosaikvirus (TMV)resistenten Tabaksorte sollte die (vermutete) Induzierbarkeit von wun1 durch TMV umgangen werden. Im Nopalin-Test positive und kanamycinresistente LS2-Pflanzen wurden auf DNA-Ebene und auf das Vorhandensein von CAT-Aktivität getestet. Pstl geschnittene DNA aus Wunl-CAT transformierten Pflanzen wiesen ein 2,2 Kb großes, gegen CAT-CDNA hybridisierendes Fragment auf. Dieses entsprach genau der zu erwartenden Fragmentgröße von wun1-CAT. In untransformierten Pflanzen war keine Hybridisierung zu erkennen. Durch vergleichende DNA-Auftragungen konnte in allen positiven Pflanzen 2 bis 4 Kopien pro haploidem Genom ermittelt werden.
Die funktioneile Analyse von LS2-Pflanzen erstreckte sich auf die Messung von CAT-Aktivitäten in Gewächshauspflanzen und auf in Sterilkultur gehaltene Pflanzen der F1-Generation. Im Gewächshaus angezogene LS2-Pflanzen zeigten in ihren unverwundeten Blättern eine im Vergleich zu der Hintergrundaktivität untransformierter Tabakblätter leicht erhöhte CAT-Aktivität. In verwundeten Blättern konnte im Vergleich zu unverwundeten Blättern eine etwa 4fach höhere CAT-Aktivität nachgewiesen werden. Gab man jedoch in den Verwundungsansatz zusätzlich einen überstand aus abgekochtem Kartoffelknollenextrakt, so war der Anstieg 6fach höher als im unverwundeten Zustand. Dieser Effekt war unabhängig vom Zustand der Knollen vor der Extraktion (unverwundete oder verwundete Knollen bzw. frisch aus dem Boden entnommene (ungelagert) oder gelagerte Knollen). Jeder Extrakt hatte den gleichen induzierenden Effekt, was auf einen im Extrakt vorhandenen Induktor hindeutet.
Die Ursache der relativ niedrigen Induzierbarkeit von wun1-CAT in transgenen Tabakpflanzen, ist in der Aktivität in unverwundeten Blättern zu sehen. Um mögliche gewächshausbedingte Ursachen auszusehalten, wurde der Samen geselbsteter LS2-Pflanzen geerntet, und unter sterilen Bedingungen wieder ausgekeimt. In jungen Blättern kanamycinresistenter Pflanzen war im unverwundeten Zustand eine sehr schwache CAT-Aktivität meßbar, die sich von der CAT-Aktivität untransformierter Blätter wenig unterschied. In verwundeten Blättern stieg die CAT-Aktivität mindestens um den Faktor 40 an. Die Zugabe von abgekochten überständen aus homogenisierten Kartoffelknollen in den Verwundungsansatz führte sogar zu einer 60fach höheren Expression.
Zusätzlich war zu beobachten, daß mit zunehmendem Alter der Pflanze die Aktivität des wun1-Promotors in den Blättern immer constitutiver wurde, wobei die Expressionsstärke die einer transgenen CAMV-CAT-Pflanze glich. Möglicherweise wirken hier Vorgänge der Seneszenz ebenfalls induzierend.
Weiter wurde mit Hilfe des transienten Systems getestet, in welchen Pflanzenspecies der wun1-Promotor aktiv ist, und
dementsprechend verwendbar ist. Es stellte sich heraus, daß dieser Promotor nicht nur in Kartoffeln-, Tabak- und Petersilienprotoplasten aktiv ist, sondern auch in Reisprotoplasten eine Expressionsstärke zeigt, die der Aktivität eines homologen Systems entspricht.
Fig. 11 zeigt die Herstellung von wun1-NPTII Konstuktionen.
Ausgehend von Plasmid pLS001 wurde der wun1-Promotor inclusive 179 bp des 5'-untranslatierten Bereichs über EcoRI-Xhol-blunt vor ein NPT-II Gen (Neomycinphosphotransferase-II) kloniert. Zur besseren Handhabung für transiente Experimente wurde die wun1-NPT-II Fusion in einen hochreplizierenden Vektor umkloniert (pLS 020).
Unter Verwendung der wun1-NPTII Konstruktion wurde in Tabak und in Petersilieprotoplasten NPT-II Aktivität gefunden. Interessanterweise konnte wun1-abhängige NPT-II Aktivität auch in Reisprotoplasten (Oryza sativa japonica c.v. Taipai) nachgewiesen werden , die in ihrer Intensität mit der wun1 -NPTII Aktivität in Kartoffelprotoplasten vergleichbar war. Vergleichende transiente Expression von wun1-NPTII und NOS-NPTII (pGV1103) in Reis-Protoplasten zeigten ebenfalls ähnlich hohe Werte. In diesem Zusam menhang wird auch noch einaml auf die CAMV-35S-CAT ähnliche transiente Expression in Kartoffelprotoplasten hingewiesen.
Insgesamt belegen diese Studien, daß der wun1-Promotor in homologen wie auch im heterologen System über eine teilweise sehr hohe Aktivität verfügt. Weder in Petersilie- noch in Tabaknoch in Reisprotoplasten konnte mit wun1-hybridisierende mRNA gefunden werden. Es müssen also den wun1-Promotor stimulierende Faktoren angenommen werden, die in allen getesteten Pflanzenspezies gleichermaßen vorkommen.
Insgesamt gesehen sind in dem 5'-Bereich von wun1 alle wichtigen DNA-Bereiche vorhanden, um ein dahinter fusioniertes Gen in hohen Mengen und verwundungsinduzierbar exprimieren zu können.
Zusätzlich läßt die Funktionalität von wun1-CAT bzw. wun1-NPTII in diversen transienten Systemen (Kartoffel, Petersilie, Tabak, Reis) wie auch im stabil transformierten Tabak auf jeweils ähnliche molekulare Hintergründe schließen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführte Versuche ergaben ferner, daß es vorteilhaft sein kann, den erfindungsgemäßen wun1-Promotor mit anderen Promotoren oder Verstärkerelementen zu fusionieren.
Als Beispiel sein die Fusionierung des wun1-Promotors mit dem bekannten TR-Promotor von der Agrobacterium tumefaciens TR-DNA erwähnt.
Die Isolierung dieses TR-Promotors von der Agrobacterium tumefaciens TR-DNA ist aus einer Arbeit von J. Veiten und J. Schell "Selection-expression vectors for use in genetic transformation of higher plants", veröffentlicht in Nucl. Acids Res., 13:6981- 6997 bekannt. Aus dieser Literaturstelle ist es auch bekannt, daß dieser Promotor für die Expression der Mannopine-Synthase verantwortlich ist und folgende Cnarakteristika aufweist: 1. Er ist bidirektional aktiv, d. h. fusioniert man an
beide Seiten Strukturgene, so werden beide in ähnlicher
Regulationsweise und Intensität abgelesen. Verwiesen wird in diesem Zusammenhang auch auf die Literaturstelle:
Langridge, W.H.R., Fitzgerald, K.J., Koncz, C, Schell, J.
und Szalay, A.A. (1989). Dual promoter of Agrobacterium
tumefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormones. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:3219-3223.
Die Orientierung des TR-Promotors hat man mit l'und 2'
festgelegt.
2. In transgenen Pflanzen ist der TR-Promotor verwundungs- induzierbar. Eine Fusion des TR2'mit dem Referenzgen
beta-galactosidase (beta-gal) führt in verwundeten transgenen Tabakpflanzen zu einer höheren beta-gal-Aktivität als in unverwundeten.
3. Die Aktivitiät des TR2'-Promotors ist hauptsächlich in den Blattvenen, also im Leitbündelsystem des Blattes zu finden.
Zu 2. und 3. wird verwiesen auf: Teeri, T.H., Lehväslaiho, H., Franck, M., Uotila, J., Heino, P., Palva, E.T., Van Montagu, M. und Herrera-Estrella, L. (1989). "Gene fusions to lacZ reveal new expression patterns of chimeric genes in gransgenic plants". EMBO, 8:343-350.
4. Die Eigenschaften des TR1'-Promotors sind bisher nicht so intensiv untersucht worden. Es ist aber bekannt, daß der TR1'- Promotor etwa 4-7fach schwächer ist als der TR2'-Promotor, ansonsten aber über ähnliche Eigenschaften verfügt.
Im Rahmen von Versuchen mit dem Ziel einer qualitativen und quantitativen Optimierung des wun1-Promotors wurde der TR- Promotor an den wun1-Promotor fusioniert, und zwar in der
Orientierung TR1'-wun1 (Fig. 12). Zum Nachweis der Promotoraktivitiät wurde das Markierungsgen GUS (beta-Glucoronidase) verwandt (TR1'-wun1-GUS). Mittels des Agrobacterium tumefaciens Transformationssystems wurde diese Konstruktion in Tabak
transformiert und analysiert. Folgende Eigenschaften zeichnen diese Tabakpflanzen im Vergleich zu wun1-GUS transgenen Tabakpflanzen aus: 1. Die Gewebespezifität hat sich geändert.
In wun1-GUS transgenem Tabak findet man GUS-Aktivität hauptsächlich in der Epidermis von Blättern und Stengeln. In
TR1'-wun1-GUS transgenem Tabak ist die GUS-Aktivität hauptsächlich im Leitbündelsystem lokalisiert. Somit besteht die Möglichkeit, je nach wissenschaftlicher Fragestellung, Genprodukte an verschiedene Stellen des Gewebes dirigieren zu können. Das Wundinduktionsverhalten von TR1'-wun1-GUS transgenen Tabakpflanzen ist dagegen mit dem Verhalten von wun1-GUS transgenen Tabakpflanzen vergleichbar.
2. Insgesamt ist die Aktivität des TR1'-wun1-Promotors in transgenen Tabakblättern und -Stengeln etwa 10fach höher als die Aktivität des wun1-Promotors. Somit zählt der
TR1'-wun1-Promotor zu den stärksten Promotoren, die es für eine Expression in Pflanzen gibt.
3. Während Promotorenaktivität in transgenen dicotylen Pflanzen heutzutage kaum ein Problem darstellt, gibt es bisher wenige Promotoren, die hinreichend aktiv sind in monocotylen Pflanzen (zu denen die wirtschaftlich wichtigen Getreidepflanzen gehören). In transienten Expressionsstudien in Reis-Protoplasten (sie dienen als Ersatz für Studien in transgenen Reispflanzen, die nur sehr schwer zu erhalten sind) zeichnet sich der TR1 ' -wun1-Promotor durch eine etwa 30fach höhere Aktivität aus als der wun1-Promotor. Dies ist umso bemerkenswerter, weil selbst der in dicotylen Pflanzen so starke 35S-Promotor hier 30fach schwächer als der TR1'-wun1-Promotor ist.
Somit läßt sich beispielsweise der erfindungsgemäße wun1- Promotor durch Fusion mit dem TR1'-Promotor in folgenden
Eigenschaften verändern bzw. optimieren:
(a) Die spezifische Aktivität des wun1-Promotors in der
Blatt- bzw. Stenge1-Epidermis von transgenem Tabak wird durch, die Fusion mit dem TR1'-Promotor in das Leitbündelsystem verlagert;
(b) Die Verwundungsinduzierbarkeit des wun1-Promotors wird durch die Fusion nicht geändert;
(c) Der TR1'-wun1-Promotor ist in transgenen Tabakblättern und -Stengeln etwa 10fach stärker als der wun1-Promotor allein; (d) Der TR1'-wun1-Promotor ist in transienten Experimenten mit einem Vertreter der monocotylen Pflanzen (Reis) etwa 30fach stärker als der wun1-Promotor.
Erfindungsgemäß läßt sich ferner z.B. die Expression des wun1- Promotors durch Fusion desselben mit einem Verstärkerelement des CamV-35S-Promotors verstärken. So führt beispielsweise die Fusion des Verstärkerelementes des CamV-35S-Promotors an das 5'-Ende des wun1-Promotors zu einer verstärkten wun1-Promotoraktivität in transgenem Tabak und Kartoffel.
Fig. 12 zeigt die Organisation der Klone wun1-GUS, TR1'-GUS und TR1'-wun1GUS.
Fig. 13 zeigt die Northern-Blot-Analyse von verwundeten un verwundeten transgenen Tabakblättern. Unverwundete (NW) bzw. verwundete (W) Blätter der transgenen Tabakpflanzen wun1-GUS, TR1'-wun1-GUS Nr. 5 und Nr. 11 und 35S-GUS wurden zur Isolierung von RNA benutzt. Je 50 μg Gesamt-RNA wurde auf einem
1,2%igen Formaldehyd-Gel gelelektrophoretisch getrennt, auf eine Nylonmembran transferiert, gegen eine radioaktiv markierte GUS-DNA Probe hybridisiert, und spezifische Bindungen auf einem Autoradiogramm sichtbar gemacht. (A) zeigt eine 2 Tage alte Exposition, (B) eine 6 Stunden alte Exposition.
Die nachstehenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung:
Beispiele 1-8
M a t e r i a l i e n
Medien
Kulturmedien für Bakterien:
Zur Anzucht von Bakterien verwendete Medien wurden nach den Angaben von Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cola Spring, Harbour, New York (1982) hergestellt:
Pflanzenmedien: Die benutzten Medien leiten sich von dem von Murashige und
Skoog, Physiol. Plan. 15, 473-497 (1962), angegebenen Medien (MS) ab.
3MS : MS + 3 % Saccharose
3MSC : MS + 3 % Saccharose, 500 μg/ml Claforan
MSC10 : MS + 2 % Saccharose, 500 μg/ml Claforan,
0,2 μg/ml NAA, 1μg/ml BAP
100 μg/ml Kanamycinsulfat
MSC15 : MS + 2 % Saccharose, 500 μg/ml Claforan,
100 μg/ml Kanamycinsulfat
MS15 : MS + 2 % Saccharose, 100 μg/ml Kanamycinsulfat
Für festes Medium wurden zusätzlich 8g/l Bacto-Agar zugegeben.
Stämme und Vektoren
E. coli-Stämme:
BMH 71-18: (lac-proAB), thi, supE;
F'(laciq, ZdeltaM15, proA+B+) (Messing et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 74, 3642-3646 (1977))
C 600 : = CR34 (Maniatis et al. 1982) GJ23 : AB1157 (R64drd11) (pGJ28)
(Van Haute et al., EMBO J. 2, 411-418, (1983))
Agrobakterien-
Stämme : C58CIpGV3850KM (Zambryski et al.,
EMBO J. 1, 147-152, (1983))
Plasmi:de : pUC8 (Vieira und Messing, Gene
19, 259-268 (1982))
pMPK110 (Eckes et al., Mol. Gen. Genet. 205, 14-22 (1986))
pRT101-cat (Pröls et al., Plant Cell Reports, im Druck (1988)) pGVH03 (Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199, 166-168 (1985))
Phagen : EMBL4 (Frischauf et al., J. Mol.
Biol. 170, 827-842 (1983))
Ml3mpl8 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119, (1985))
M13mp19 (Yanisch-Perron et al., 1985)
Pflanzen:
Solanum tuberosum AM 80/5793 (haploid)
Berolina (tetraploid)
Datura (D12)
Granola
Nicotinia tabacum Wisconsin 38 (W38)
Samsum NN (SNN)
Oryza sativa japonica c.v. Taipai
Alle molekularbiologischen Standard-Methoden, wie z.B. Restriktionsanalyse, Plasmidisolierung, Minipräparation von
Plasmid-DNA, Transformation von Bakterien usw. sind, sofern nicht anders angegeben, wie bei Maniatis et al. (1982) beschrieben, durchgeführt worden.
Verwundetes Pflanzengewebe
Kartoffelknollenmaterial wurde in 3mm dicke Scheiben
geschnitten und in einer Phosphatlösung (20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, mit Chloramphenicol (50 μg/ml)) 18 h lang bei 28°C unter Lichtausschluß inkubiert. Blatt-, Stamm- und Wurzelmaterial wurde in kleine Stücke zerschnitten und unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Nach abgeschlossener Inkubation wurde das Material entweder direkt aufgearbeitet oder bei -70ºC gelagert.
Unverwundetes Pflanzengewebe
Blatt-, Stamm-, Wurzel- und Knollenmaterial wurde sofort nach seiner Entfernung von der lebenden Pflanze aufgearbeitet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.
Aerobe Verwundung von Kartoffelknollen
Behandlung wie in "Verwundung" beschrieben, wobei während der Inkubation die Knollenscheiben nur leicht mit dem Phosphatpuffer benetzt waren. Nach der Inkubation war die Knollenoberfläche angebräunt.
Anaerobe Verwundung von Kartoffelknollen
Behandlung wie in "Verwundung" beschrieben, wobei während der Inkubation die Knollenscheiben vollständig in Phosphatpuffer eingetaucht waren. Nach der Inkubation war die Knollenoberfläche weiß-gelblich hell.
Expression von wun1-mRNA in pathogenbefallenen Kartoffelblättern
Blätter der Sorte "Datura" wurden an ihrem Blattstiel abgeschnitten und mit dem Stiel in Wasser gestellt. Anschließend wurden diese Blätter mit einer Phytophtorasporen-Suspension besprüht, um dann zu verschiedenen Zeiten von je einem Blatt die Gesamt-RNA zu isolieren und über einen "Northern-Slotblot" zu untersuchen. Drei verschiedene Ansätze wurden verwendet: - Wasser, das die Sporen eines in Bezug auf Datura kompatiblen Phytophtora infestans-Stammes PJ1 enthält;
- Wasser, mit Sporen des in Bezug auf Datura inkompatiblen Phytophtora infestans-Starames PJ4;
- Wasser, ohne den Zusatz von Sporen (Kontrolle)
Die densitometrischen Auswertungen der wun1-Hybridisierungsstärke ergab bereits zwei Stunden nach Behandlung der Blätter mit Wasser und Sporen der inkompatiblen Phytophtoraspezies einen 4-fachen Anstieg der wun1-mRNA Menge. Von der 4-ten bis 8-ten Stunde blieb die Expressionsmenge ungefähr gleich, bevor sie dann bis zur 30-sten Stunde sukzessive auf den 1,5 bis 2-fachen Wert zurückfiel. Das gleiche Expressionsverhalten zeigte wun1-mRNA auch bei der Verwendung von Wasser ohne Sporen (Kontrolle).
Bei dem analogen Versuchsansatz mit Wasser und kompatiblen Phytophtorasporen war 2 h nach Befall ein 4-facher wun1-mRNA Anstieg zu beobachten, der sich bis zur 10-ten h nur leicht reduzierte. Spätestens ab der 16-ten h erhöhte sich jedoch die Expression um das 6-fache des Kontrollwertes, um nach konstanter Steigerung nach 30 h den Faktor 9 zu erreichen.
Verwundung unter Zusatz von Kartoffelextrakt
Kartoffelknollen wurden ohne Zusatz von Puffern bei 4°C homogenisiert und 10 Minuten bei 10000 upm im SS34-Rotor zentrifugiert. Der überstand wurde 10 Minuten gekocht und nochmals zentrifugiert. Der klare überstand wurde im Verhältnis 1:10 zu 20mM Phosphatpuffer, pH 7,0 addiert und das zu testende Gewebe unter den normalen Bedingungen darin inkubiert.
B e i s p i e l l
RNA-Isolierung Die Isolierung von RNA aus verschiedenen Organen der Kartoffel und des Tabaks wurden wie bei Logemann et al. in Anal. Biochem., 163:16-20 (1987) beschrieben durchgeführt.
Die selektive Anreicherung von PolyA+RNA erfolgte mittels mAP- Papiers (Werner et al., Analytical Biochem. 141, 329-336
(1984).
"Northern-Blot"-Analyse
Die RNA wurde auf einem 1,5 %-igen Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743, (1977)). Wie bei Willmitzer et al., EMBO J. 1, 139-146,
(1982) beschrieben, wurde anschließend die RNA auf Nitrozellulose transferiert, fixiert und gegen 32P*radioaktiv markierte cDNA hybridisiert, gewaschen und exponiert. DNA-Isolierung
Nukleäre DNA wurde nach der Methode von Bedbrook, PMB Newsletter II, 24 (1981) aus Kartoffelblättern gewonnen und für die Klonierung in LambdaPhagen EMBL4 verwandt. DNA aus transformiertem Gewebe Wurde nach dem kombinierten Aufbruch mit Triton X 100, SDS, und Proteinase K (Wassenegger, Dissertation, Köln (1988) ) gereinigt.
"Southern-Blot"-Analyse
DNA wurde auf 0,8 bis 1,2 %-igen Agarosegelen elektrophoretisch getrennt, auf Nitrocellulose transferiert und fixiert
(Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)), sowie hybridisiert und gewaschen, wie bei Willmitzer et al. (1982) beschrieben.
"Run-off"-Experimente
Eine Methode, die relativ genau zwischen diesen beiden Regulationstypen unterscheidet, ist die "Run-Off"-Methode. Hier werden Zellkerne aus verwundeten und unverwundeten Knollen isoliert, von ihnen neu synthetisierte mRNA radioaktiv puls-markiert und gegen Einzelstrang-DNA der einzelnen Klone hybridisiert. In Zellkernen aus unverwundeten Klonen wurde keine wun1-mRNA produziert, dagegen in Zellkernen aus verwundeten Knollen in hohen Mengen.
Die Isolierung von Zellkernen aus Kartoffelknollen, sowie die anschließende in-vitro-Transkription wurde nach Willmitzer et al., Nucl. Acids Res. 9, 19 (1981) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltenen radioaktiv markierten RNA-Transkripte wurden gegen bidirektional in M13 klonierte cDNA-Klone hybridisiert.
Proteinisolierung und Auftrennung
Die Isolierung von Proteinen aus Kartoffelknollen sowie deren ein- und zweidimensionale gelelektrophoretische Auftrennung ist bei Mayer et al., Plant Cell Reports 6, 77-81 (1987) beschrieben.
B e i s p i e l 2 "Hybrid-releasec-translation"-Experimente Das 800 bp Fragment des cDNA-Klons wun1-25A2 und das 700 bp Fragment des cDNA-Klons wun2-29C12 wurden über die Pstl
Schnittstelle in M13mpl8 kloniert. Die Orientierung der Insertionen in den M13-Klonen wurde durch Komplementations- Analysen (Messing, in: Genetic Engineering of Plants, (1983) Plenum Press, New York, 1983) bestimmt. Die Identifizierung der M13-Klone mit dem kodogenen Strang erfolgte durch ein positives Hybridisierungsverhalten gegen radioaktiv markierte polyA+RNA aus verwundeten Kartoffelknollen.
Die lsolierung von Einzelstrang-DNA aus M13-Phagen (sie enthält den kodogenen Strang), die Fixierung dieser DNA auf Nitrocellulose und Hybridisierung gegen Kartoffelknollen-RNA sowie das Waschen und Freisetzen der selektierten RNA ist bei Maniatis et al. (1982) beschrieben. Die selektierte RNA sowie aus Kartoffelknollen isolierte polyA+RNA wurden in einem Kaninchen-
Retikulozytenlysat (Pelham und Jackson, Eur. J. Biochem. 67, 247 (1976)) m Anwesenheit von 35S-Methionin translatiert. Die ein- bzw. zweidimensionale elektrophoretische Auftrennung auf einem Polyacrylamid-Gel erfolgte nach Mayer et al. (1987).
B e i s p i e l 3
Erstellen und Untersuchen einer genomischen Bank
Isolierung der genomischen DNA:
Als genomische Kartoffel-DNA diente nach der Methode von Bedbrook (1981) isolierte Blatt-DNA der haploiden Linie AM
80/5793.
Diese DNA wurde vollständig mit EcoRI verdaut.
Isolierung der Phagen-DNA:
EMBL4-DNA wurde mit EcoRI in drei Fragmente zerschnitten, wobei über gelelektrophoretische Auftrennung mit anschließender Frag mentisolierung die beiden Vektorarme von dem Mittelfragment getrennt werden konnten. Zusätzlich wurden auch kommerziell erhältliche und gereinigte EMBL4-Arme verwandt (Amersham).
Ligation und Verpackung:
Nach erfolgter Ligation der EMBL4-Arme mit der EcoRI verdauten genomischen DNA wurde die ligierte, hochmolekulare DNA in vitro in Phagenköpfe verpackt (Hohn und Murray, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3259-63, (1977); Hohn, Meth. Enzym. 68, 299-309
(1979)). Das Verpackungsmaterial stammt aus einem "Lambda in vitro packaging kit" der Firma Amersham. Die genomische Bank wurde mit einer Konzentration von 25000 plagues pro Platte
(25x25cm) ausplattiert.
Plaquehybridisierung:
Das Auffinden cDNA-homologer Lambda-Klone erfolgte durch
Plaquehybridisierung nach Benton und Davies, Science 196, 180 (1977) mittels radioaktiv markierter cDNA. Positiv hybridisierende Plagues wurden vereinzelt und nochmalig getestet.
DNA-Präparation rekombinanter Phagen:
20 ml einer C600-lysierten Bakterienkultur wurden mit Chloroform versetzt, um nach anschließender Zentrifugation einen bakterienfreien überstand zu erhalten. Das Sedimentieren der Phagen aus dem Überstand erfolgte durch 4-stündiges Zentrifugieren bei 10000 upm. Das Phagen-Sediment wurde in 500 μl Phagen-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2) aufgenommen und mit DNase und RNase behandelt. Nach der Extraktion der DNA durch mehrmaliges Phenolisieren, wurde die Phagen-DNA EtOH-präzipitiert, mit 70 %-igem EtOH gewaschen und in TE aufgenommen.
B e i s p i e l 4
Erzeugung von Deletionsmutanten nach Exonuklease-III-Behandlung Das zu untersuchende Fragment wurde nach Henikoff et al., Gene 28, 351-359, (1984) in beiden Orientierungen in M13mp19 klo niert. Da die Exonuclease III 5'-überstehende Enden abverdaut, jedoch 3'-überstehende Enden verschont, wurden 20 μg der zu analysierenden DNA mit zwei Restriktionsenzymen verdaut, die auf den Seiten des klonierten Fragments je ein 5'- und ein 3'-Ende erzeugten. Da das 5'-Ende dem Fragment zugewandt war, konnte eine Exonuclease-Verdauung in das Fragment hinein erfolgen. Durch sukzessives Stoppen dieser Reaktion konnten jeweils 200 bp kleinere Fragmente isoliert werden, deren überstehende Enden durch eine nachfolgende S1-Behandlung in ligierbare glatte Enden umgewandelt wurden. Zuletzt folgte die Transformation dieser DNA in BMH 7118-Zellen mit anschließender Einzelstrang-DNA-Isolierung.
Sequenzierung
Die Sequenzierung von Einzelstrang-DNA wurde nach der Kettenabbruch-Methode von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463, (1977) durchgeführt. Die Auftrennung der Reaktionsansätze erfolgte auf 6 und 8 %-igen Seguenzgelen (Ansorge und de Mayer, J. Chromatogr. 202, 45-53 (1980); Ansorge und Barker, J. Biochem. Biophys. Meth. 9, 33 (1984)).
Klonierung und Sequenzierung von wun1-25A2
Das etwa 711 bp große Insert des Klons wun1-25A2 wurde über die Pstl-Schnittstellen in den M13mp19-Vektor kloniert, wobei die Orientierung des Inserts über die asymmetrische Xhol-Schnittstelle ermittelt wurde. Die in der Orientierung des Inserts unterschiedlichen Klone 25A2-4-mp19 und 25A-5-mp19 wurden mit Kpnl/Xbal geschnitten, um eine bidirektionale ExonukleaselllVerdauung in das Fragment hinein zu ermöglichen. Verschieden große Deletionsklone konnten durch sukzessives Stoppen der Exonukleasereaktion erhalten werden, die als gereiiigte Einzelstrang-DNA zur Sequenzierung nach der Methode von Sanger et al. (1977) dienten. B e i s p i e l 5
S1-Analyse
Das Prinzip der S1-Nuklease-Kartierung zur Bestimmung des
Transkriptionsstartpunkts basiert darauf, daß durch eine Hybridisierung von Einzelstrang-DNA aus dem 5'-Bereich des wun1- Gens mit wun1-mRNA nur die Bereiche vor einem Abbau der einzelstrangspezifischen Nuklease Sl geschützt sind, die aufgrund ihrer Homologie einen Doppelstrang ausbilden können. Die Größe des geschützten DNA-Fragments kann auf einem Sequenzgel ermittelt werden und somit der Transkriptionsstart zurückverfolgt werden.
Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes wurde nach Berk und Sharp, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, -1274 (1987), durchgeführt. Dazu wurde aus dem Plasmid pLS000 mit EcoRI und Xhol das 1,2 kb Fragment isoliert und durch Behandlung mit Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend erfolgte eine radioaktive Markierung der 5'OH-Enden durch die Kombination von Polynukleotidkinase und y- 32-P-ATP. Nach Denaturierung der DNA-Fragmente wurden diese mit 50 μg Gesamt-RNA hybridisiert (Hybridisierungspuffer: 80 %. Formamid, 0,4 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4 und 1 mM EDTA). Diese Bedingung begünstigt RNA-DNA-Hybride im Vergleich zu DNA-DNA-Hybriden (Casey und Davidson, Nucl. Acids Res. 4, 1539-1552 (1977)). Die Hybridisierungstemperatur beginnt bei 80°C und wird über Nacht auf 40°C gesenkt. Eine anschließende S1-Nuclease Verdauung (120 U/ml) entfernt ungepaarte Stränge. Es wurde erwartet, daß die im 5'-untranslatierten Bereich des wun1-Gens gelegene und radioaktiv markierte Xhol Schnittstelle durch ihre Homologie zur mRNA geschützt ist. Zuletzt wird der S1-geschützte DNA-Strang auf einem Sequenzgel elektrophoretisch aufgetrennt, wobei als Längenvergleich die Sequenz eines bekannten DNA-Fragments dient. B e i s p i e l 6
Transiente Expression in Kartoffelprotoplasten
Je 20 μg hochgereinigte (CsCl-Gradient) Plasmid-DNA wird in PEG/CaCl2-behandelte Kartoffelprotoplasten transformiert
(Lipphardt, Dissertation, Köln, 1988). Die Protoplasten stammen aus einer Kartoffelstengel-Suspensionskultur der Sorte Datura.
Transiente Expression in Reisprotoplasten
20 μg hochgereinigte (CsCl-Gradient) Plasmid-DNA werden nach einer modifizierten Methode von Lörz et al., Mol. Gen. Genet. 199, 178-182 (1985), transformiert. Verändert wurden die
Konzentrationen an Polyethylenglycol und Osmotikum.
B e i s p i e l 7
DNA-Transfer in Agrobakterien
Konjugation:
Die in E. coli klonierte DNA wurde nach der von Van Haute et al. (1983) beschriebenen Methode mittels des Helferstammes GJ23 in den Agrobakterienstamm 3850, transferiert.
DNA-Analyse von Agrobakterien:
Die Überprüfung des DNA-Transfers in das Agrobacterium erfolgte durch die Isolierung von Agrobakterien DNA nach der von Murray und Thompson, Nucl. Acid Res. 8, 4321-4325 (1980) geschilderten Methode. Restriktionsspaltung der DNA, der Transfer auf Nitrocellulose und die Hybridisierung gegen die entsprechende radioaktive Sonde gaben Aufschluß über einen erfolgreichen
DNA-Transfer ins Agrobacterium. B e i s p i e l 8
Transformation von Tabak
Anzucht der Agrobakterien:
Die zur Infektion benötigten Agrobakterien 3850Km wurden in selektivem Antibiotika-Medium angezogen (Zambrisky et al., 1983) durch Zentrifugation sedimentiert und in YEB-Mediumohne Antibiotika gewaschen. Nach erneuter Sedimentation und Aufnahme in YEB-Medium konnten die Bakterien zur Infektion verwandt werden.
Blattscheiben-Infektion:
Für die Blattscheiben-Infektion wurden sterile Blätter der Tabaklinien SNN und W38 verwendet. Etwa 1 cm große Blattstücke wurden durch 10-minütige Inkubation in 0,1 % HgCl2, 0,1 % SDS sterilisiert und dreimal in sterilem Wasser gewaschen . Es folgte das Eintauchen in eine wie oben beschriebene Agrobakteriensuspension mit anschließender Überführung auf 3MS-Medium. Nach 2-tägiger Inkubation bei 16 h unter Licht und bei 25 bis 27°C wurden die Blattstücke mehrmals in flüssigem 3MS-Medium gewaschen und auf 3MSC-Medium überführt. Nach 4-6 Wochen erscheinende Sprosse wurden abgeschnitten und auf 2MSC-Medium inkubiert. Als weiterer Nachweis einer erfolgreichen Transformation wurde der Nopalin-Test durchgeführt.
Analyse der transformierten Pflanzen
Nachweis von Nopalin-Synthase-Aktivität:
Der Nachweis von Nopalin-Synthase-Aktivität in transformierten Pflanzenblättern wurde nach Otten und Schilperoort, Biochem. Biophys. Acta 527, 497 (1978) durchgeführt.
Nachweis von NPT-II-Aktivität:
Die NPT-II-Aktivität in transformierten Pflanzen wurde nach Reiss et al., Gene 30, 217-223 (1984) und Schreier et al., EMBO J. 4, 25-32 (1985) nachgewiesen. Nachweis von CAT-Aktivität:
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase(CAT)Aktivität wurde nach den Methoden von Veiten und Schell, Nuc. Acids, Res. 13, 6981-6997 (1985) und Herrera-Estrella et al., EMBO J. 2, 987 (1983) nachgewiesen.
Beispiel 9
Optimierung des wun1-Promotors durch Fusion mit dem TR-Promotor (TR1'wun1).
Bezüglich der verwendeten Medien wird auf die Beispiele 1-8 verwiesen.
2.1.4. Stämme und Vektoren
Agrobakterienstämme GV3101pmp90RK (Koncz, C, und Schell, J. "The promotor of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vetor", (1986), Mol. Gen. Gent. 204:383-396) .
Plasmide: pPCV720 (bisher nicht publiziertes Plasmid von
Dr. Koncz, MPI f. Züchtungsforschung, Köln)
35S-GUS = pRT99-GUS (Töpfer, R., Schell, J. und
Steinbiß, H.H. "Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells." (1988) wun1-GUS (Siebertz, B., Logemann, J., Willmitzer,
L., Schell, J. "Cis-analysis of the woundinducible promoter wun1 in transgenic tobacco plants and histochemical localisation of its expression". The Plant Cell, im Druck (1989) TR1'-wun1-GUS (Logemann et al., im Druck)
TR1'-GUS (Logemann et al., im Druck)
Pflanzen:
Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W38)
Methoden
Alle molekularbiologischen Standard-Methoden, wie z. B.
Restriktionsanalyse, Plasmidisolierung, Minipräparation von Plasmid-DNA, Transformation von Bakterien u.s.w. sind, sofern nicht anders angegeben, wie bei Maniatis et al., (1982)
beschrieben durchgeführt worden.
Verwundetes und unverwundetes Pflanzengewebe wurde wie in den Beispielen 1-8 beschrieben hergestellt. Bezüglich der RNA-Isolierung, der "Northern-Blot"Analyse, der DNA-Isolierung, der transienten Expression in Reisprotoplasten, der "Southern-Blot'Αnalyse und der DNA-Analyse von Agrobakterien wird ebenfalls auf die Beispiele 1-8 verwiesen.
DNA-Transfer in Agrobakterien
Transformation
Die in E. coli klonierte DNA wurde nach der von Van Houte, E., Joos, H., Maes, M., Warren G., Van Montagu, M., Schell, J.
"Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322: a novel strategy for reversed genetics of Ti-plasmids of Agrobacterium tumefaciens", EMBO J., 2:411-418 beschriebenen Methode mittels des Helferstammes S17-1 in den Agrobacterienstamm GV3101pmp90RK transferiert.
Transformation von Tabak
Anzucht der Agrobakterien
Die Agrobakterien GV3101pmp90RK, die das gewünschte Plasmid enthalten, wurden in selektivem Antibiotika-Medium (Hygromacin) angezogen, durch Zentrifugation sedimentiert und in YEB-Medium (Maniatis et al, 1982) ohne Antibiotika gewaschen. Nach erneuter Sedimentation und Aufnahme in YEB-Medium konnten die Bakterien zur Infektion verwandt werden.
Blattscheiben-Infektion
Es wurde wie in Beispiel 8 beschrieben gearbeitet, jedoch ohne Anwendung des Nopalin-Tests. Analyse der transformierten Pflanzen
Nachweis von GUS-Aktivität
A: Der fluoromoetrische Nachweis von beta-glucoronidase-
Aktivität (GUS-Aktivität) erfolgt nach de Mehode von
Jefferson, A.R., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W. "Gus-Fusions:
ß-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants", EMBO J. 6:3901-3907 (1987).
B: Der färbetechnische Nachweis von GUS-Aktivität in Geweben efolgte mittels einer X-Gluc Färbelösung. X-Gluc Lösung:
1-2 mM X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronid), und
Dirnethylformamid werden in 50 mM Phosphat-Puffer pH 7,0
gelöst.
- Verwundetes Gewebe:
Dünne Gewebeschnitte werden inkubiert wie unter "Verwundetes Pflanzengewebe" beschrieben und anschließend in X-Gluc Lösung über Nacht bei 37°C gefärbt. Zuletzt wird durch Zugabe von 100% Methanol bei 60°C das Chlorophyll entfernt.
-Unverwundetes Gewebe:
Dünne Gewebeschnitte werden in X-Gluc Lösung inkubiert, die zusätzlich den translationellen Inhibitor Cycloheximid (1,8 mM) enthält. Inkubationsdauer und Methanol-Behandlung ist identisch mit dem verwundetem Gewebe.
-X-Gluc Färbung von Pollen:
Pollen wurden über Nacht bei 28°C in 30%iger Saccharose
inkubiert, was zur Ausprägung von Pollenschläuchen führt.
Anschließend wird doppelt konzentrierte 30%ige X-Gluc Lösung addiert und der Pollen über Nacht bei 28°C inkubiert.
Alternativ werden Pollenkörner direkt in X-Gluc inkubiert. ohne daß es zur Ausprägung von Pollenschläuchen kommt.
E r g e b n i s s e
Organisation von TR1'-wun1-Gus, TR1'-GUS und wun1-GUS (Fig. 12). wun1-GUS:
1022 bp des wun1-Promotors und 178 bp des wun1 5' untranslatierten Bereichs werden transkriptionell mit dem beta- Glucuronidase-Gen (GUS) fusioniert. Als Terminationssequenz dient das poly-Adenylierungssignal (pA) des Nopaline-synthaseGens (NOS). TR1'-GUS:
Der TR1'-Promotor wird transkriptioneil mit dem GUS-Gen
fusioniert und durch das pA-Signal des NOS-Gens terminiert. TR1'-wun1-GUS:
Hinter den 1'-Promotor des TR-Promotors ist das pA-Signal des Octopine-synthase-Gens (OCS) kloniert, um eine Transkription durch den wun1-Promotor hindurch zu verhindern. Hinter dem OCS pA-Signal liegt der wun1-Promotor (1022 bp), der (in Homologie zu der wun1-GUS Konstruktion) über 179 bp des
untranslatierten 5 'Bereichs des wun1-Gens mit dem GUS-Gen transkriptioneil fusioniert vorliegt. Als Terminationssequenz für das GUS-Gen dient das pA-Signal des 35-S Gens.
Diese Konstruktion (TR1'-wun1-GUS) liegt in dem binären
Vektor pPCV720 vor, der sich selbst sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien (mit Hilfe eines Helferplasmids) replizieren kann.
RNA-Analyse von TR1' -wun1-GUS transgenem Tabak
RNA aus verwundeten und aus unverwundeten Blättern verschiedener TR1'-wun1-GUS transgener Tabakpflanzen sowie aus wun1-GUS und 35S-GUS Blättern wurde isoliert und gegen radioaktiv markierte GUS-DNA hybridisiert.
Wie der Northers-Blot in Fig. 13 zeigt, ist 1. die GUS-mRNA in transgenen TR1'wun1-GUS-Blättern genauso groß wie in wun1-GUS transgenen Blättern. Offensichtlich wird in beiden Konstrukten der gleiche Transkriptionsstart benutzt.
2. die Menge an RNA ist sowohl bei TR1'-wun1-GUS-Pflanzen als auch bei wun1-GUS Pflanzen in verwundeten Blättern höher als in unverwundeten Blättern. Die für wun1-GUS bereits bekannte Verwundungsinduzierbarkeit bestätigt sich somit auch für TR1'-wun1- GUS.
3. bei einem mengenmäßigen RNA-Vergleich ist zu erkennen, daß in verwundeten TR1'-wun1-GUS transgenen Blättern teilweise mehr RNA zu finden ist als in 35S-GUS transgenen Blättern. Da der 35S- Promotor zu einem der stärksten in Pflanzen aktiven Promotoren zählt, ist der TR1'-wun1-Promotor ebenfalls so einzuschätzen.
Analyse der GUS-Aktivität in transgenem Tabak
Eine quantitative Analyse der GUS-Aktivität transgener TR1'- wun1-GUS Pflanzen zeigt, daß der TR2'1'-wun1-Promotor in transgenen Blättern durch Verwundung um den Faktor 2 bis 13fach induzierbar ist (im Durchschnitt etwa 6fach). Dies entspricht ungefähr der Wundinduzierbarkeit des wun1-Promotors in transgenen Blättern (Logemann J., Lipphardt S., Lörz H., Häuser I., Willmitzer L. und Schell J. "5'upstream seguences from the wun1-gene are responsible for gene activation by wounding in transgenic plants" The Plant Cell 1:151-158 (1989A)). Analog zu transgenen wun1-GUS Tabakpflanzen ist die Wundinduzierbarkeit in den oberen, jungen Blättern am höchsten, in unteren, alten Blättern am niedrigsten. Ursache für diese Unterschiede in der Induzierbarkeit ist die von oben nach unten zunehmende Aktivität des TR1'1-wun1-Promotors in unverwundetem Gewebe. In alten Blättern von alten Pflanzen ist die TR1'-wun1-Promotor Aktivität in unverwundetem Zustand bereits so hoch, daß sie durch eine Verwundung nicht mehr weiter induziert werden kann (analog zu wun1-GUS Pflanzen). Ein relativer Vergleich von Promotor-Aktivitäten in transgenen Tabak-Blättern und -Stengeln zeigt, daß der wun1-Promotor etwa 10fach stärker als der TR1'-Promotor ist. Der TR1'-wun1GUS
Promotor ist wiederum 10fach stärker als der wun1-Promotor.
Somit ist der TR1'-wun1-Promotor etwa 100fach stärker als der TR1'-Promotor.
Lokalisierung von GUS-Aktivität in transgenem Tabak
-Blatt, Stengel:
Die GUS-Aktivität in den Gewebsschnitten von verwundeten und unverwundeten Blättern und Stengeln von wun1-GUS und TR1'-wun1- GUS transgenem Tabak wurde durch die Verwendung des Substrates X-Gluc lokalisiert.
wun1-GUS:
Wie anhand blaugefärbter Bereiche zu sehen ist, beschränkt sich die Aktivität des wun1-Promotors hauptsächlich auf die Epidermis (inclusive Trichome) und zu einem geringeren Anteil auf das
Leitbündelsystem von verwundeten Blättern (W). In unverwundeten (NW) Blättern hingegen ist nur eine geringe wun1 Promotoraktivität in der Epidermis und keine Aktivität im Leitbündelsystem zu sehen. Die gleichen Ergebnisse werden auch mit Stengelquerschnitten erzielt.
Somit ist die wun1-Promotoraktivität als Epidermis-spezifisch in Blättern und Stengeln anzusehen.
In TR1'wun1-GUS Pflanzen ist eine intensive Blaufärbung in dem Leitbündelsystem verwundeter Blattschnitte zu erkennen. In anderen Bereichen (Epidermis, Parenchym) ist die Färbung nur schwach. Unverwundete Blattschnitte zeigen eine geringe Blaufärbung im Leitbündelsystem und keine Färbung in der Epidermis. Die gleichen Ergebnisse werden auch mit Stengelquerschnitten erzielt.
Offensichtlich handelt es sich bei TR1 'wun1-GUS um einen in Blättern und Stengeln Leitbündelsystem-spezifisch exprimierenden Promotor. Ein relativer Vergleich von Promotor-Aktivitäten in transgenen Tabak-Blättern und -Stengeln zeigt, daß der wun1-Promotor etwa 10fach stärker als der TR1' -Promotor ist. Der TR1'-wun1GUS
Promotor ist wiederum 10fach stärker als der wun1-Promotor.
Somit ist der TR1'-wun1-Promotor etwa 100fach stärker als der TR1'-Promotor.
Lokalisierung von GUS-Aktivität in transgenem Tabak
-Blatt, Stengel:
Die GUS-Aktivität in den Gewebsschnitten von verwundeten und unverwundeten Blättern und Stengeln von wun1-GUS und TR1'-wun1- GUS transgenem Tabak wurde durch die Verwendung des Substrates X-Gluc lokalisiert.
wun1-GUS:
Wie anhand blaugefärbter Bereiche zu sehen ist, beschränkt sich die Aktivität des wun1-Promotors hauptsächlich auf die Epidermis (inclusive Trichome) und zu einem geringeren Anteil auf das
Leitbündelsystem von verwundeten Blättern (W). In unverwundeten (NW) Blättern hingegen ist nur eine geringe wun1 Promotoraktivität in der Epidermis und keine Aktivität im Leitbündelsystem zu sehen. Die gleichen Ergebnisse werden auch mit Stengelquerschnitten erzielt.
Somit ist die wun1-Promotoraktivitat als Epidermis-spezifisch in Blättern und Stengeln anzusehen.
In TR1'wun1-GUS Pflanzen ist eine intensive Blaufärbung in dem Leitbündelsystem verwundeter Blattschnitte zu erkennen. In anderen Bereichen (Epidermis, Parenchym) ist die Färbung nur schwach. Unverwundete Blattschnitte zeigen eine geringe Blaufärbung im Leitbündelsystem und keine Färbung in der Epidermis. Die gleichen Ergebnisse werden auch mit Stengelquerschnitten erzielt.
Offensichtlich handelt es sich bei TR1 'wun1-GUS um einen in
Blättern und Stengeln Leitbündelyystem-spezifisch exprimierenden Promotor. Als Kontrolle dienten Blattquerschnitte von TR1 'GUS Pflanzen. Aufgrund der schwachen Promotoraktivität des TR1'-Promotors (10fach schwächer als der wun1-Promotor) ist weder in verwundeten noch in unverwundeten Blattquerschnitten eine Blaufärbung erkennbar.
-Anthere:
Eine X-Gluc Färbung von Antherenquerschnitten sowie von Pollen zeigt folgende Charakteristika, die sowohl für wun1-GUS als auch für TR1'-wun1-GUS zutreffen:
Eine Blaufärbung (und damit GUS-Aktivität) wird im Stomium
(natürliche Perforationsstelle der Anthere, um den Pollen zu entlassen) und im Pollen nachgewiesen. In separierten ungekeimten und gekeimten Pollen ist eine Blaufärbung im Pollenkorn und im Pollenschlauch zu erkennen.
Transiente Expression mit Reis-Protoplasten
Die Konstruktionen TR1'-wun1-GUS, wun1-GUS, TR1'-GUS und
35S-GUS wurden zu transienten Expressionstudien mit Reis- Protoplasten der Sorte (Oryza sativa japonica c.v. Taipai) benutzt. Wie Tab. 1 zeigt, unterscheidet sich die Aktivität von TR1'-GUS nicht signifikant von der Kontrolle (GUS-Aktivität von Reis-Protoplasten, die ohne DNA transformiert wurden). wun1- GUS und 35S-GUS zeigen eine 2-3fach höhere Aktivität als die Kontrolle. TR1'-wun1-GUS DNA hingegen zeigt im Durchschnitt eine 57fach höhere Aktivität als die Kontrolle und ist somit ein hochaktiver Promotor in Reisprotoplasten.
Legende zu Tab.1:
Die angegebene GUS-Aktivität wurde aus 5 unabhängigen Versuchen ermittelt.
Die Aussage der Tab.1 läßt sich durch das Anfärben der Protoplasten mit X-Gluc belegen. Nur mit TR1'-wun1-GUS transformierte Protoplasten zeigen eine intensive Blaufärbung.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. DNA-Sequenz aus Solanum tuberosum, die durch Verletzung
und/oder Infektion mit pathogenen Keimen stimuliert wird.
2. Promotorteil der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder seine
aktiven Bereiche.
3. Promotorteil der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder seine
aktiven Bereiche, der bzw. die mit dem TR-Promotor fusioniert ist.
4. Strukturgenteil der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder seine aktiven Bereiche.
5. Verwendung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder der
Promotorteile nach Ansprüchen 2 und 3 zur Expression
von Genprodukten in höheren Pflanzen bei Verletzung
und/oder pathogenem Befall.
6. Verwendung nach Anspruch 5,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t,
daß der Promotorteil der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3 oder seine aktiven Bereiche mit einem Strukturgen anderer Herkunft fusioniert ist/sind.
7. DNA-Übertragungsvektor mit insertierter DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 und/oder 4.
8. DNA-Übertragungsvektor nach Anspruch 7,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t,
daß er den Promotorteil oder seine aktiven Bereiche in Verbindung mit einem Strukturgen anderer Herkunft enthält.
9. Pflanzen oder Pflanzenmaterial enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3931969A1 (de) * 1989-09-25 1991-04-04 Max Planck Gesellschaft Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselben
WO1992005261A1 (en) * 1990-09-21 1992-04-02 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Improvements in or relating to organic compounds
US5981843A (en) 1995-05-18 1999-11-09 Board Of Trustee Of The University Of Kentucky Elicitin-mediated plant resistance
US6100451A (en) * 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
WO2001020008A2 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Universiteit Leiden Vascular-specific promoters
DE102005025656A1 (de) 2005-06-03 2006-12-07 IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Promotor zur epidermisspezifischen, pathogeninduzierbaren Transgenexpression in Pflanzen

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207765A (en) * 1983-04-15 1987-03-06 Lubrizol Genetics Inc Plant expression of transferred dna(t-dna)from plasmids associated with agrobacterium sp
DE3733017A1 (de) * 1987-09-30 1989-04-13 Bayer Ag Stilbensynthase-gen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9005187A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2002403C (en) 1999-08-10
DE3837752C2 (de) 1991-06-13
HUT60326A (en) 1992-08-28
DK82591D0 (da) 1991-05-03
DK82591A (da) 1991-05-03
AU4628289A (en) 1990-05-28
JPH04501507A (ja) 1992-03-19
WO1990005187A1 (de) 1990-05-17
DE58908980D1 (de) 1995-03-23
DE3837752A1 (de) 1990-05-10
AU641373B2 (en) 1993-09-23
HU896870D0 (en) 1991-07-29
ES2067514T3 (es) 1995-04-01
ZA898479B (en) 1990-09-26
IL92219A0 (en) 1990-07-26
ATE118246T1 (de) 1995-02-15
EP0368167A1 (de) 1990-05-16
CA2002403A1 (en) 1990-05-07
IL92219A (en) 1995-12-31
EP0368167B1 (de) 1995-02-08

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