JPH04500453A - 新規の発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の発現ベクター 本発明は、通常の転写及び翻訳調節配列、すなわちプロモーター、オペレーター 、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、転写ターミネータ−等の他に、１５〜 ２０個のアミノ酸を含んで成るβ−ガラクトシダーゼの一部をコードする配列、 オペレーター配列の反復体又はそのいづれかの部分、追加のリポソーム結合部位 、翻訳開始コドン、５〜１０個のアミノ酸を含んで成るホモポリマーオリゴペプ チドをコードする配列及び追加のＡＴＧコドンを含んで成る新規の発現ベクター に関する０本発明はまた、上記発現ベクターの生成方法にも関する。

インビトロＤＮＡ組換え方法は、すべての起源及び情報含有の遺伝子を細菌細胞 中に導入するために使用され得る。適切なビークル分子、すなわち発現ベクター の使用は、外来性ＤＮＡが細胞中で安定して存在し、そしてコードされる情報を 発現することを確保する。細菌細胞においてタンパク質をコードする遺伝子を発 現する場合、まず初めに細菌細胞の酵素が転写の間、ＤＮＡからｍＲＮＡを合成 し、続いて翻訳の間、それからタンパク質を合成する０発現はいわゆるプロモー ター領域により開始される。ＲＮＡポリマラーゼは、このプロモーターを認識し 、そして転写の開始の間、それに結合する。

インビトロＤＮＡ組換え方法は、標的タンパク質が十分な量で生合成される場合 、すなわち転写及び翻訳の両者が適切な強度を有し、そして生成されたｍＲＮＡ 及び生合成されたタンパク質が宿主細胞中で適切に安定することができる場合に おいてのみ実質的な価値を有する。

外来性（真核性）遺伝子の発現は、次の理由のために時々ひじょうに難かしいニ ー遺伝子生成物は宿主細胞に対して毒性であり−与えられた遺伝子から合成され るｍＲＮＡは細菌細胞において安定しておらず 一遺伝子生成物（タンパク質）はひじように早く分解し、蓄積され得ない。

初めの問題は、細菌細胞が適切な密度に達する場合、使用者により向けられる一 定の瞬間で調節でき、そして開始できるプロモーターにより克服され得る。この 段階で、それは、生成物の合成が単に細胞中で進行する場合、細胞の追加の分割 は存在せず、その生命条件（生成物の合成及び毒性のために）は宿主細胞のため に理想的でないいづれの問題も意味しない。

はとんどの場合、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの保護は、細菌起源の遺伝子の 一部が生成物の遺伝子の５′末端に融合されるような方法で問題の遺伝子を“マ スクする”ことによって達成される。はとんどの場合、この保護ペプチドはβ− ガラクトシダーゼ酵素の一部であり、その相対的な量は、１５０個のアミノ酸の 配列が保護のために最少必要とされるので、融合生成物においてひじように高い 。この事実は生成物の精製に重大な欠点を示す。なぜならば、有用なタンパク質 の相対的な量は融合タンパク質において少なく、そして最っとも広く使用される 分離方法、すなわちＢｒＣＮ切断法が多くのフラグメントをもたらし、これから 純粋なフラグメントの選択が困難であるからである。

最近、Ｅ、コリにおける外来性タンパク質の保護を目的とする遺伝子の５′−末 端へのアミノ酸のホモポリマーをコードする短いＤＮＡ端の融合が開発され、そ して報告されている（Ｗｉｎｇ　Ｌ、　Ｓｕｎｇなど、：短い合成オリゴデオキ シリボヌクレオチドリーダー配列がＥ、コリで合成されるヒトプロインシュリン の蓄積を増強する（Ｓｈｏｒｔ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒ ｉ−ｂｏｎｕｃｌｅｏｔｆｄｅ　１ｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｅｎｈａｎ ｃｅ　ａｃｃｕ＋ｗｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、　Ｐｒ ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３巻、５６１〜５６５ページ 、１９８６）。

いくつかのアミノ酸（Ｔｈｒ、　Ｇｉｎ、　５ｅｔ）の場合、ひじように良好な 発現が達成され得（合計タンパク質含有量の６〜２６％）、そして融合タンパク 質における有用な生成物の割合は、ホモポリマー部分が６〜８個のアミノ酸のみ から成るので著しく高まった。しかし、このベクターは、本発明のベクターのよ うに一般的に使用され得ない、その理由は、上記に記載されるβ−ガラクトシダ ーゼをコードする短い（３個のアミノ酸の長さ）配列は、十分なｍＲＮＡレベル の保護を付与しないことである。これまでの実験に基づけば、有用な長さの配列 （約１５０個のアミノ酸をコードする）がそのようなタイプの安定化効果を有す ると思われるので、著者は上記配列に重きを置かなかったことがその報告から理 解できる。

モノトーン（ｍｏｎｏｔｏｎ）アミノ酸をコードする領域が短いβ−ガラクトシ ダーゼＤＮＡ配列（１５〜２０個のアミノ酸をコードする）の後及び発現される べき遺伝子の前に挿入される場合、ｅａＲＮＡｍＲＮＡレベル驚くべきには達成 され得ることが見出された。この“サンドイッチ”配置は、十分なａ＋ＲＮＡ及 びタンパク質レベルの保護を確保する。結論は、β−ガラクトシダーゼコード部 分がｍＲＮＡレベルの保護のために重要であり、そしてホモポリマーアミノ酸末 端がタンパク質レベルに対して大きな重要性を有することである。

本発明の目的は、良好なタンパク質収率を確保し、同時に確実に調節され得、そ して発現されるべきいづれの種類の遺伝子の場合においても十分な−ＲＮＡ及び タンパク質レベルの安。

定性を付与する新規の発現ベクターを開発することであった。

発現ベクターｐＥＲＶＩ／２３　（ハンガソー特許出願第４１１１／８７号に記 載される）の適切なメンバーから、上記必要条件を包含するｔｈｒｅｏ−αプラ スミドｐＥＲ２３が、インビトロＤＮＡ組換え技法を用いて構成された。（プラ スミドの制限及び機能地図は第２ａ図に示される）、このプラスミドの構成は、 β−ガラクトシダーゼをコードする驚くべき短い配列（４０〜６０個のヌクレオ チドの長さ）及びアミノ酸のホモポリマーをコードするヌクレオチド配列の適用 により、有意なｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの保護が達成され得る発見により 可能にされた。

さらに、はぼ完全なオペレーター領域の導入により、ベクターの制御能力がより 一層完全４こなった。追加のリポソーム結合部位及び翻訳開始コドンの導入によ り、本発明のベクターにより生成されるタンパク質の範囲が有意に高まった。

従って、β−ガラクｔシダーゼの１５〜２０個のアミノ酸をコードする配列、オ ペレーター配列の反復体又はそのいづれかの部分、追加のリポソーム結合部位、 翻訳開始コドン、５〜１０個のアミノ酸を含んで成るホモポリマーオリゴペプチ ドをコードする配列及び追加のＡＴＧコドンを、アミノ酸のホモポリマーをコー ドする配列を、プラスミドベクターｐＥＲＶＩ／２３の誘導体中のプロモーター 、オペレーター、リポソーム結合部位及び翻訳開始コドンの領域の後及び発現さ れるべき遺伝子の前で導入することを含んで成る、アミノ酸のホモポリマーをコ ードする配列を導入することによって新規の発現ベクターを構成するための方法 を提供することが本発明の目的である。

発現ベクター及びそれにより提供される遺伝子発現の主な特徴は次の通りである ニ ーベクターはひじょうに強い調節可能なプロモーターを担持し； 一麟ＲＮＡ及びタンパク質レベルの保護がβ−ガラクトシダーゼをコードする配 列及びアミノ酸のホモポリマーをコードする配列により合成されるホモポリマー アミノ酸末端により提供され（両者は発現されるべき遺伝子の前に位置する）； −前記末端の長さが、生成物の精製を有意に容易にするたった約４０個のアミノ 酸であり； 一発現されるべき遺伝子の前に挿入されるＡＴＧコドンにより、所望しない融合 タンパク譬部分が単純なりｒＣＮ切断法により生成物タンパク質から除去され得 ； −β−ガラクトシダーゼ部分の後に、はとんど損なわれていない第２１のｌａｅ オペレーター配列が見出され得る（アミノ酸コード配列及びβ−ガラクトシダー ゼコード部分と読み枠を整合して）、前記オペレーターの後の第１の損なわれて いないオペレーターと一緒にこの第２のオペレーターは、リポソームＲＮＡオペ ロンのＰｇプロモーター及びＥ、コリのｌａｃオペロンの調節配列から形成され るプロモーター６／２３のような強いプロモーターの後でさえその抑制を完全に しくハンガツー特許出願第４１１１／８７号）； −β−ガラクトシダーゼコード部分の後及びアミノ酸のホモポリマーをコードす る配列の前に、第２のリポソーム結合部位及び翻訳開始コドンが見出され得る。

実験データは、あるタンパク質の場合、第１又は第２翻訳シグナルのみが使用さ れ（他の場合、それらの両者が使用される）、従って実質的に、システムの自由 程度は、細菌の翻訳装置がより効果的な、より容易に使用できるシグナルを選択 することができるので高まることを示し； 一ベクターが、Ｃ１ａｌリンカ−を含むいづれか他のタンパク質遺伝子又はその ベクターのＣ１ａ　１部位中に挿入されるいづれか他のタンパク質遺伝子の発現 のために使用され得（リンカ−の他の制限部位もまた、もちろん使用され得る） ；−モノトンアミノ酸末端の助けにより、種々のタンパク質の１段階精製が免疫 学的方法に基づいて可能であり；−これまで試験された遺伝子の場合（ヒトプロ インシュリン、合成インシュリンＡ及びＢ鎖、バソアクティブ・インテステイナ ル・ポリペプチド）、ひじょうに高いレベルの発現がベクターによりもたらされ 得る（細胞の合計タンパク質含有量の２５〜３０％）。

上記発現ベクターの構成のための本発明の方法は適切には、次の段階を含んで成 る。

１、　ペプチドが選択され、これをコードする遺伝子がクローン化された形で利 用でき、そしてこれはＥ、コリ細胞（たとえばヒトプロインシュリン）において ひじょうに不安定であることが知られている。

λ　リンカ−（ＡＴＧ）の最後の３個のヌクレオチドが、第１アミノ酸をコード するヌクレオチドトリブレットの前に直接配！される（コドンＡＴＧによりコー ドされるアミノ酸メチオニンは融合生成物のＢｒＣＮ切断を可能にする）ような 態様で、Ｃ１ａ　Ｉリンカ−を遺伝子の５′−末端（開始）に連結し、次にその Ｃ１ａ　Ｉリンカ−から出発する遺伝子をｌａｃ調節配列（オペレーター及びリ ポソーム結合部位）の後の適切なプラスミド中にクローンする。

３８　得られたプラスミドのユニークＣ１ａ　Ｉ制限部位中に、あるアミノ酸ト レオニンの連続コード領域を含む合成オリゴヌクレオチドを挿入する。正しい挿 入の場合、トレオニンのトリプレットは、遺伝子と読み枠を整合して存在し、そ して他方、Ｃ１ａ　Ｉ部位は遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドの末端のみで 再生する。

４、得られたプラスミドから、 −Ｉａｃ調ＷＪ領域 一トレオニンをコードするオリゴヌクレオチド−Ｃ１ａｌリンカー −及び遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを適切な制限酵素により切断し、そして Ｐｖｕ　Ｕ部位に対応する位置において、ユニーク制限部位（Ｒ）が生成される べきであるような態様で、プラスミドｐＥＲＶＩ／２３又はそのいづれかの誘導 体のα−ペプチドコード領域のユニークＰｖｕ　Ｕ制限部位中にクローン化する 。

その得られたプラスミドの適切な領域に、次の機能を有するＤ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域 が連続的に見出され得る：　６／２３プロモーター；ｌａｃ　Ｅｌ１節領域Ｉ； α−ペプチドの初めの３４個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列；Ｒユニーク制 限部位；Ｉａｃ調ｖＪ顛域■；モノトントレオニンオリゴペプチドをコードする ＤＮＡ配列；及び安定化されるべきペプチドの遺伝子。

５、　次の段階において、Ｒ制限部位を用いて、プラスミドを線状化し、次にＢ ａｌ　３１ヌクレアーゼ酵素がある１０個のヌクレオチドのみを消化するような 環境下でその酵素により欠失を行ない、次にそのプラスミドをＤＮＡリガーゼに より再び　″環状化する。

６、形質転換の後、所望する大きさの外来性タンパク質を高レベルで発現するク ローンを選択する。

７、免疫学的方法（ＲＩＡ、イムノプロット）を用いて、生成された融合ペプチ ドが発現されるべきタンパク質を包含することが証明される。

８、　プラスミドの正確なヌクレオチド配列を配列決定することにより決定する 。

９、Ｃ１ａｌ制限部位を用いて、遺伝子をコードするＤＮＡ配列を、いづれか他 のペプチドの遺伝子のクローン化を可能にするポリリンカー配列に変える。

本発明の方法は、次の例により例示されるが、それらの例は本発明の範囲を制限 するものではない。

炭−上 ブースミドＥＲ２３Ｔｈｒｅｏ　−ｃｘの構成を実施する場合、次の３種のプラ スミドを出発材料として使用した：　ｐｓＺ１１５３．　ｐＥＲＶＩ／２３ＰＬ Ｈ４，ｐＥＲＶＩ２３（＋ＡＴＧ）。

ｐｓＺ１１５３と命名されるプラスミドは、ハンガソー特許出願第４３６３／８ ４号に記載されており、他の２つのプラスミドは、ノ＼ンガリー特許出願第４１ １．１／８７号に記載されるベクターのメンバーである。

ヒトプロンシュリンをコードするＤ　Ｎ　Ａ　’ｐＨ域を、Ｃ１ａ　Ｉ及び旧ｎ ｄＩＩ［制限酵素によりプラスミドｐｓＺ１１５３から切断し、ここで除去され たＤＮＡフラグメント上に、Ｃ１ａ　Ｉリンカ−に起因するヌクレオチドトリプ レットのすぐ後に、タンパク質の初めのアミノ酸をコードするコドンＴＴＴが存 在する。第１段階において、Ｃ１ａ　Ｉ　＋　Ｈｉｎｄ　ｍ制限酵素による消化 により生成されるＤＮＡフラグメント（プロインシュリン遺伝子）を、プラスミ ドｐＥＲ２３（＋ＡＴＧ）のポリリンカー領域のＣ１ａ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌＩｔ 部位中にクローン化する。

第２段階において、その得られたプラスミド（この後、中間体Ｉと言及する）の Ｃ１ａ　Ｉ部位（プロインシュリン遺伝子のすぐ前）中に、７個のトレオニンア ミノ酸のコドンを連続的に含み、そしてＣ１ａ　Ｉ酵素により消化されたプラス ミドに連結され得る２つの付着端を担持する合成二本鎖オリゴヌクレオチドを挿 入する。正しい配向での挿入の場合、トレオニンコドンはプロインシュリン遺伝 子と読み枠を整合して存在し、そしてＣ１ａ　Ｉ制限部位が前記遺伝子に隣接す るオリゴヌクレオチドの末端上でのみ再生されるべきであるような態様で、オリ ゴヌクレオチドは構成される。（これは、得られたユニークＣ１ａｌ制限部位を 用いていづれかのペプチドの他の遺伝子にプロインシュリン遺伝子を変えること ができるために後で必要である）。

Ｓｕｎｇなとの報告の言及（序論を参照のこと）に反して、上記方法により調製 されたプラスミド（このプラスミドを、この後、中間体■と命名する）により形 質転換されたＥ、コリクローンにはっきり示される発現は存在しなかったことが 注目される。

次の段階において、中間体■プラスミドのユニークＮｓｉ　１制限部位をＥｃｏ ＲＴ制限部位に形質転換する。この方法においては、Ｎｓｉ　Ｉ消化の後、３′ オーバハング末端がＴ４ポリマラーゼ酵素による消化により除去され、次にその プラスミドが、ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化された多量のＥｃｏＲ Ｉリンカ−の存在下でＤＮＡリガーゼにより再環化される。その得られたプラス ミドを、この後、中間体■と命名する。

この後、プラスミドｐＥＲ２３ＰＬＨ４のユニークＰｖｕ　１１部位（α−ペプ チドコード領域の中間）中に、ＥｃｏＲＩリンカ−をまた挿入し、この相違は、 Ｔ４ポリマラーゼ処理がＰｖｕ　Ｕ酵素によりプラント末端を生成するので不必 要であることである。

ここで、中間体■に起因するＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントを、その 得られたプラスミド（この後、中間体■と命名する）のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ 　ｍ部位中にクローン化する。その得られたプラスミドを、この後、中間体■と 命名し、その対応する領域の構造は第１図に示される。

次の段階において、中間体ＶプラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素により消化し、そ して一連の欠失をＥｃｏＲ１部位から両方向にＢａｌ　３１エンドヌクレアーゼ により生成する。それらの一連の欠失のメンバーを選択し、ここでＢａｌ　３１ 酵素は、両方向に多くのヌクレオチドを消化した。これによって、α−ペプチド コード領域と７個のトレオニンコドンとの間の距離が城しられる。

ＤＮＡリガーゼによる再環状化の後、その得られたプラスミドの混合物をＥ、コ リＩＭ　１０７細胞中に形質転換し、そして所望する大きさの範囲に属する外来 性タンパク質を多量発現するクローンを選択する。〔得られるプラスミドを正し く決定するために、適切なりローンを選択し、そして欠失のエンドポイントをそ れから調製されたプラスミドに基づいてＤＮＡ配列決定することによって決定し た。（具体的な構成及び配列が第２ａ、２ｂ図及び第３図に示される。）生成さ れた融合タンパク質は、ヒトプロインシュリンタンパク質に対して特異的な抗体 と強く反応する。〕 最後に、最終段階において、プロインシュリン遺伝子を含むＣ１ａ　Ｉ　Ｈｉｎ ｄ　ｍフラグメントを、ミニプラスミドπνＸに起源するプラスミドＶＴ／２３ 　ＰＬＨ４のＣ１ａ　ｌ−Ｈ１ｎｄｎｌポリリンカーフラグメントに変える。

ヒ　びε　！！ 一般的に使用される実験室用化学物質は、ＲＥＡＮＡＬ、　ＳＩＧＭＡ及びＭＥ ＲＣＫ製品として入手できるブロアナル品質のものである。　（ｒ　−”Ｐ　Ａ ＴＰ及びα３”Ｐ　）ｄＡＴＰ　ｉｌ製物（Ｈｕｎｇａｒｉａｎ　ｌ５ｏｔｏｐ ｅＩｎｓ　ｔｉ　ｔｕ　ｔｅ）の比活性は１００〜１５０　ＴＢｑ／ｍＭであっ た。

使用された制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　ＩＩ　、　ＢｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎ ｄ■は、公開された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｅｄ 　：　Ｌ。

Ｇｒｏｓｓａ＋ａｎｎ、　Ｖ、　Ｍｏ１ｄａｖｅ）第６５巻、８９〜１８０ペー ジ］に基づいて、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｉｎ５ｔｉＬｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｕ ｎｇａｒｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの共同研究者により精製された。酵素Ｃ１ａ　 Ｉ　、　Ｎｓｉ　ＩはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。

Ｂａｌ　３１ヌクレアーゼ及びフレノウ酵素（Ｅ、コリＤＮＡポリマラーゼ１大 フラグメント）はＮｅｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、細菌 性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）は−ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎから入手し、パ ンクリアーゼＲＮ　−ａｓｅ及びリゾチームＲｅａｎａｌから入手した。

Ｔａｍ発性ポリヌクレオチドリガーゼは、Ｍｕｒｒａｙなとの方法（Ｍｕｒｒａ ｙ、　Ｎ、　Ｅ、＋　Ｂｒｕｃｅ　Ｓ、＾、及びＭｕｒｒａｙ＋　Ｋ、　：バク テリオファージＴ４からのＤＮＡリガーゼ遺伝子の分子クローニング（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｇｅｎｅ 　ｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４）ｌ　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、　Ｌ遁ｒ　４９３〜５０５ページ（１９７９）　）により調製された。

１−抹 Ｅ、コリに１２　ＪＭ１０７　［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，など： 改良されたＭ１３ファージクローニングベクター及び宿主株、Ｍ１４　ｍｐ１８ およびＰＵＣ１９ベクターのヌクレオチド配列（Ｉｍｐｒｏｖｅｄガ１３ｐｈａ ｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ　 ｎｕｃｌｅｏｔｔｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１４　ｍｐ１８　 ａｎｄ　ＰＯＣｌ２　ｖｅｃｔｏｒｓ）、　Ｇｅｎｅ、　３１１０３〜１１９　 （１９８５））　。

Ｅ、コリ株は、１２当たりバタトートリブトン１０ｇ５バクト酵母抽出物５ｇ及 びＮａＣｌ５ｇにより完結された液体培地中で増殖された。固体培養培地は、上 記液体培地Ｉｆ当たり１５ｇのバクトー寒天を添加することによって調製された 。

β−ガラクトシダーゼ酵素のＮ−末端部分（α−ペプチド）の発現の評価のため に適切なインジケータープレートは、１１当たり次の成分から構成された２ ２０ｇ　カサミノ酸 ６　ｇ　ＮａＪＰＯａ ３　ｇ　ＫＨｚＰＯ４ ０，５ｇ　ＮａＣ１ １ｇ　ＮＨ４Ｃｌ １５ｇ　バクトー寒天 ２０■　Ｘ−ｇａｌ　（ジメチルホルムアミドに溶解された）２ｍＭ　ＭｇＣｌ □ ０．１１１Ｍ　ＣａＣＩｚ β−ラクタマーゼ遺伝子を担持するプラスミドを含む細胞を、１１００ｔｒ／ｄ ｌのアンピシリンを含む培地において増殖せしめた。

プラスミドＤＮＡの単離は、１００ｘｒ／ｄのアンピシリンを含む培地に問題の プラスミドを担持する細菌株を増殖し、そして０．７〜０，８の００．。。、１ ．に達した時、プラスミドの増幅のために培養培地に１７０ｉｒｇ／ｄのクロラ ムフェニコールを添加することによって行なわれた。プラスミドＤＮＡを予備量 で単離する場合、透明な分離物をＣｌｅｗｅｌ　１及びＨｅ１ｉｎｓｋｉにより 記載される方法（Ｃ１ｅｅｖｅ１１．　Ｄ、　Ｂ、及びＩ’１ｅｌｉｎｓｋｔ、 　Ｄ、　Ｒ，＋（１９６９）Ｅ、コリにおける超らせん環状ＤＮＡ−タンパク質 複合体二開環ＲＮＡ形への精製及び誘発された転換、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６２．１１５９〜１１６６ページ〕により調 製し、次にプラスミドＤＮＡを５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５１００Ｏ（Ｐｈａｒｌｌ ａｃｉａ）カラム上で又は塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾酸上での超遠心 分離により精製した。分析量でプラスミドＤＮＡを単離する場合（細菌培養物１ ．０〜１．５　ｄから）　、Ｄｏｌｙ及びＢｉｒｎｂｏｔ＠により開発され、そ してり、　Ｉｓｈ　Ｈｏｒｏｉ＋ｉｔｈにより改良された酢酸カリウム方法を使 用した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｊ、Ｉ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、＋Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ＋　ｊ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋　 Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　）ＩａｒｂｏｒＬａｄ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　＊ 制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡサンプルの切断を、Ｎｅ賀Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｂｓにより提供される条件下で行なった。

付着端を有するＤＮＡフラグメントをお互い結合する場合、０．５〜１．０４の Ｄ　Ｎ　Ａ　、　６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐ）１７．６）、５ｍＭのＭｇ Ｃ１ｚ　−５ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのＡＴＰ及び１単位の誘発され たＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含んで成る反応混合物（３０〜４０ｉｔりを 使用した。この連結は、１４°Ｃで２〜３時間行なわれた（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋Ｅ、Ｆ、、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ａ プラント末端を有するフラグメントの連結は、３０〜４０趨／ｄ（Ｄ　Ｄ　Ｎ　 Ａ、　２５ｄ（７）　）す、２．−）１ｃＩ　（ｐ）１７．４）、５ｄのｒＩｇ Ｃｂ　、５１のジチオトレイトール、０．２５ｍＭのスペルミジン、１ｗＭのＡ ＴＰ、１０ｘ／ｄのＢ　Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ、タイプ■）を含む緩衝液中で行 なわれた。４〜６単位の誘発されたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをその反応混 合物に与え、そしてそれを１４゛ｃで８〜１２時間インキュベートした。

ＤＮＡサンプルのゲル電気泳動を、Ｈｅｌｌｉｎｇなど、（１９７４）の方法に より水平電気泳動装置において０．８〜０．２％のアガロースゲル（Ｓｉｇｍａ 、タイプＩ）で行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４及び８％のＩＩ ｍ厚さの垂直ゲルを用いる）を、Ｍａｎｉａｔｔｓ、　Ｔ、、　Ｊｅｆｆｒｅｙ 、　Ａ、及びｖａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅ＋　Ｈ。

（１９７５）　［ポリアクリルアミドゲル電気泳動による小さな二本鎖及び一本 鎖ＤＮＡ分子の鎖の長さの決定（Ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈｄｅｔｅｒｖｉｎａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓ＋＋＋ａｌｌ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｄ　ｓｊｎｇｌｅ　５ｔ ｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ ｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｉａ、　３７８７　３７９４）の方法により行な った。

アガロース及びポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡフラグメントの単離は、Ｄ ＥＡＥ紙を用いてＷｉｎｂｅｒ　Ｇ、、　Ｈａｓ＋ｍａｒｓｋｊ６１ｄ。

ｈの方法（ＤＥＡＥ紙を用いてアガロースゲルからＤＮＡの単離。

アデノウィルスタイプ１６のＤＮＡの制限部位マツピングへの適用（Ｉｓｏｌａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｔａ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌｓ　ｕｓｉｎｇ 　ＤＥＡＥ−ｐａｐｅｒ。

Ａｐｐｌｉｃａｔｆｏｎ　ｔｏ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ａ＋ａｐ ｐｉｎｇ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ　１６０ＮＡ）　、　ＮＡＲ， 旦、　２５３　（１９８０））により行なわれた。

ＤＮＡフラグメントを、６００＋ａＭのＮａＣ１，１２ｍＭのＣａＣＩｚ　、２ ０ｍ１Ｍのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，０）、１．Ｏａ＋ＭのＥＣＴ八を含む反 応混合物において１００ｘｒ／１１１の最終濃度でＢａｌ　３１ヌクレアーゼに より３０℃で消化した。

所望する短縮の程度に依存して、０．４〜１．２単位の酵素をＤＮＡ１．Ｏｇに 添加した。それぞれの場合、試験調製物は与え製造され、それによって、種々の インキュページ町ン期間の後、フラグメント短縮の程度がサンプルのゲル電気泳 動分析により決定された。酵素の機能は反応混合物のフェノール−抽出により停 止され、そしてＤＮＡのアルコール沈殿の後、それらの末端を３′末端−ラベリ ングのために通切な反応条件下でタレノウポリマラーゼによりプラント末端に修 復した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋　Ｅ、　Ｆ、、　Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ、　１．（１９８２）＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｒｉｇ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　 。

Ｊ？Ｉ　１０７細菌株の形質転換のために、コンピテント細胞を、Ｍａｎｄｅｌ 及びＦＩｉｇａにより記載されるＣａＣ１，方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ＋丁、。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、＋　５ａｓｂｒｏｏｋ、　１．　（１９８２）　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）に従って調製した。

ＤＮＡフラグメントの５′末端の脱リン酸化及びγ−！ｐ−ＡＴＰを用いてポリ ヌクレオチドキナーゼによる末端−ラベリング並びにヌクレオチド配列の決定を 、Ｍａｘａｍ　Ａ、及びＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、（塩基特異的化学的切断による 末端ラベル化されたＤＮＡの配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｒ＋ｇ　ａｎｄ−１ａ ｂｅｌｌｅｄ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈｂａｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈｅｍｉｃａｌ 　ｃｌｅａｖａｇｅｓ）、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５゜４９９〜５ ６０ページ（１９８０）　）により記載される手段に従って行なった。

インシュリンを含む融合タンパク質をイムノプロット法により示した［７ｏｗｂ ｉｎなと。：ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへのタンパク 質の電気泳動による移動方法及び適用（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒ ａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ ｅ　ｇｅｌｓ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ、　Ｐｒｏ ｃｅｄｕｒｅａｎｄ　ｓｏ＋＊ｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７６＋４３５０（１９７９） 　）。

発現ベクターを調製する場合、Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、＋　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　 Ｅ。

Ｆ、、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　１．（１９８２）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ　）により記載される方法及び工程が適用された。

炎此■ヱニ叉 Ｉ　１０９０／ｐｓｚ　Ｉ　１５３　１３．０７．１９８８８ｓ０ＡＭＩＭ　１ ０７／ｐＥＲ２３Ｔｈｒｅｏａｌｐｈａ　１３．０７．　１９８８　８’°八ｈ ゛に　される　許のリスト Ｐｒ：プロモーター ７４ｚ：転写ターミネータ− ５ｐ：シャインーダルガルノの配列（リポソーム結合部位）ａａミ二アミノ ｏ　ｐ　：　ｌａｃオペレーター ：欠失（Ｂａｌ　３１エクソヌクレアーゼによる）ｎｕ：ヌクレオチド ｔｈｒ：ｈレオニンコドン ｏｒｉ　：復製の起点 α：α−ペプチド遺伝子 り、ｐ、ｉ、：ヒトプロインシュリン遺伝子Ａｐｌ　、アンピシリン耐性を提供 するβ−ラクタマーゼ遺伝子 Ｅ　：　ＥｃｏＲ，制限酵素 Ｂａ　：　Ｂａｗｌ　Ｉ制限酵素 Ｐｓｔ　：　Ｐｓｔ　Ｉ制限酵素 Ｂｇ：ＢｇｌＩ［制限酵素 Ｘ　：　Ｘｂａ　Ｉ制限酵素 Ｈ：Ｈｉｎｄｌｌｉ制限酵素 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸ホモポリマー領域をコードする配列を導入することによって発現ベ クターを構放するための方法であって、アミノ酸をコードする配列、オペレータ ー配列の反復体又はそのいづれかの部分、追加のリボソーム結合部位、翻訳開始 コドン、５〜１０個のアミノ酸のホモポリマーをコードする配列及び追加のＡＴ Ｇコドンを、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位及び翻訳開始コ ドン領域の後及び発現されるべき遺伝子の前でプラスミドベクターｐＥＲＶＩ／ ２３の誘導体中に導入することを含んで成る方法。 ２．ｐＥＲＶＩ／２３（＋ＡＴＧ）発現ベクターが出発材料として使用される請 求の範囲第１項記載の方法。 ３．β−ガラクトシダーゼの１７個のアミノ酸をコードする配列が導入される請 求の範囲第１又は第２項記載の方法。 ４．７個のアミノ酸のホモポリマー、好ましくはトレオニンをコードする配列が 挿入される請求の範囲第１〜３項のいづれか１項記載の方法。 ５．アミノ酸のホモポリマーをコードする配列を含む発現ベクターであって、プ ロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位及び翻訳開始コドン領域の後、 及び発現されるべき遺伝子の前に、β−ガラクトシダーゼの１５〜２０個のアミ ノ酸をコードする配列、オペレーター配列の反復体又はそのいづれかの部分、追 加のリボソーム結合部位、翻訳開始コドン、５〜１０個のアミノ酸のホモポリマ ーをコードする配列及び追加のＡＴＧコドンが含まれるような態様でプラスミド ｐＥＲＶＩ／２３の誘導体が形質転換されることを特徴とする発現ベクタ６．第 ２ａ図に従っての発現ベクター。 ７．Ｅ．コリ宿主株によりタンパク質を過剰生成するための方法であって、請求 の範囲第５〜第６項のいづれか１項の発現ベクターを使用することを特徴とする 方法。