HU200486B - Process for producing expression vector - Google Patents

Process for producing expression vector Download PDF

Info

Publication number
HU200486B
HU200486B HU883685A HU368588A HU200486B HU 200486 B HU200486 B HU 200486B HU 883685 A HU883685 A HU 883685A HU 368588 A HU368588 A HU 368588A HU 200486 B HU200486 B HU 200486B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
plasmid
amino acid
sequence
dna
Prior art date
Application number
HU883685A
Other languages
English (en)
Inventor
Tamas Lukacsovich
Andras Orosz
Pal Venetianer
Gabriella Baliko
Imre Boros
Eva Balla
Original Assignee
Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Vegyeszet filed Critical Richter Gedeon Vegyeszet
Priority to HU883685A priority Critical patent/HU200486B/hu
Priority to PCT/HU1989/000035 priority patent/WO1990000610A1/en
Priority to AU39619/89A priority patent/AU3961989A/en
Priority to KR1019900700542A priority patent/KR920007684B1/ko
Priority to JP1507625A priority patent/JPH04500453A/ja
Priority to EP89907811A priority patent/EP0424429A1/en
Publication of HU200486B publication Critical patent/HU200486B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új expressziós vektorok előállítására, amelyek az idegen gén kifejezésére alkalmas szokásos transzkripciós és transzlációs regulátor szekvenciákon — promóter, operátor, riboszóma-kötőhely, transzlációs startkodon, transzkripciós terminátorok, stb. - kívül egy 15-20 aminosavnyi β-galaktozidáz részt kódoló szekvenciát, az operátor szekvenciának, vagy annak valamely részletének ismétlését, újabb riboszómakötőhelyet, transzlációs startkodont, egy 5-10 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt kódoló szekvenciát, majd egy újabb ATG-kodont tartalmaznak.
Az in vitro DNS rekombináció módszerével tetszőleges eredetű és információtartalmú gének juttathatók be a baktériumsejtekbe. Az, hogy az idegen DNS stabilan fennmaradjon a sejtben, és a benne kódolt információ kifejeződjék, megfelelő hordozó molekulákkal: expressziós (kifejező) vektorokkal biztosítható. Egy fehérjét kódoló gén baktériumsejtben történő expressziójakor (kifejezésekor) a baktériumsejt enzimei előbb a transzkripció során a DNS-ről mRNS-t szintetizálnak, majd erről a transzláció során polipeptidet. Az expressziót egy úgynevezett promoter régió iniciálja. Az RNS polimeráz ezt a promotert ismeri fel, és ehhez kötődik a transzkripció iniciálása során. Gyakorlatban az in vitro DNS rekombináció módszere akkor alkalmazható gazdaságosan, ha a célzott fehérje kielégítő mennyiségben keletkezik, azaz, ha mind a transzkripció, mind a transzláció megfelelő intenzitású, és a keletkező mRNS, illetve a szintetizált fehérje megfelelően stabil a hordozó sejtben.
Idegen - eukaryota - gének expressziója számos esetben rendkívüli nehézségekbe ütközhet az alábbi okok miatt:
- a géntermék toxikus a gazdasejtre
- az adott génről szintetizálódott m-RNS baktériumsejtben nem stabil
- maga a géntermék - fehérje - gyorsan degradálódik, nem halmozódik fel.
Az első nehézség egy adott pillanatban beindítható, szabályozható promoter segítségével hidalható át, amelyet akkor kapcsol be a felhasználó, amikor a baktériumok már kellő sűrűséget értek el. Ekkor már nem jelent problémát, hogy a továbbiakban csak a termék szintézise folyik a sejtekben, további osztódás nincs, az életkörülmények - éppen a termék szintézise és toxicitása miatt - nem ideálisak a gazdasejt számára.
Az mRNS és fehérje szintű védelmet a termeltetni kívánt gén „álcázásával” érik el a legtöbb esetben, mégpedig úgy, hogy egy bakteriális eredetű fehérje génjének egy darabját fúzionáltatják a termék génjének 5’ végéhez. Ez a védőpeptid a legtöbb esetben a β-galaktozidáz enzim egy darabja, amelynek mennyiségi aránya a fúziós termékben általában igen magas, mivel minimálisan 150 aminosavnyi szakasz szükséges a védelemhez. E körülmény továbbiakban a termék tisztításánál jelent hátrányt, mivel egyrészt a ténylegesen hasznos fehérje aránya kicsi a fúziós proteinben, másrészt a legelterjedtebb elválasztási eljárás, a BrCN-os hasítás során több fragment keletkezik, melyek közül nehéz kiválasztani az autentikusát.
Nemrégiben fejlesztették ki és írták le idegen fehérjék védelmére E. coli baktériumsejtekben egy rövid homopolimer aminosavrészt kódoló farok fúzióját a gén 5’ végéhez (Wing L. Sung et. al.: Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequence enhance accumulation of humán proinsulin synthesized in Escherichia coli, Proc.Natl.Acad.Sci. USA Vol. 83, pp. 561-565, 1986). Néhány aminósav esetében (Thr, Gin, Ser) rendkívül jó expressziót (az összfehérje
6-26 %-a) sikerült elérni, és jelentősen megnőtt a fúziós fehérjén belül a hasznos tennék aránya, hiszen a homopolimer rész mindössze 6-8 aminosavból állt. Ez a vektor azonban nem használható univerzálisan, mint a találmányunk szerinti vektor. Ennek oka az, hogy a fenti cikkben leírt rövid három aminósav hosszúságú β-galaktozidázt kódoló szekvencia nem nyújt megfelelő mRNS szintű védelmet A cikkből kiviláglik, hogy a szerzők nem is tulajdonítottak jelentőséget a fenti szekvenciának, mivel a korábbi kísérletek alapján azt feltételezték, hogy csak a szokásos hosszúságú (kb. 150 aminosavat kódoló) szekvencia fejthet ki ilyen jellegű stabilizáló hatást.
Kísérleteink során meglepő módon azt találtuk, hogy az mRNS-szintű védelem elérhető oly módon, ha a monoton aminosavakat kódoló régiót egy rövid (kb. 15-20 aminosavat kódoló) β-galaktozidáz gén szakasz mögé, és az expresszáltatni kívánt gén elé inszertáljuk. Ez a „szendvics” elrendezés biztosítja a hatékony mRNS és fehérje szintű védelmet. Következtetéseink szerint a β-galaktozidáz kódoló résznek főként az mRNS szinten, míg a homopolimer aminósav faroknak a fehérje szinten van nagyobb jelentősége.
Célunk az volt, hogy olyan új expressziós vektort hozzunk létre, amely jó fehérje hozamot biztosít, ugyanakkor megbízhatóan szabályozható, és tetszőleges kifejeztetni kívánt gén esetén is biztosítja a megfelelő mRNS illetve fehérje szintű stabilitást.
A 197 595 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett pERVl/23 expressziós vektorcsalád megfelelő tagjaiból in vitro DNS rekombinációs technikák felhasználásával létrehoztuk a fenti követelményeknek eleget tevő pER 23 threo-alpha plazmidot. (A plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 2/a ábrán szemléltetjük.) E plazmid kialakítását az a felismerésünk tette lehetővé, hogy egy meglepően rövid (40-60 nukleotidnyi) β-galaktozidázt kódoló szakasz és egy homopolimer aminosavszekvenciát kódoló nukleotid szakasz alkalmazásával jelentős mRNS és fehérje szintű védelmet sikerült elérni. Ezenfelül egy újabb, majdnem teljes operátor régió beépítésével még tökéletesebbé vált a vektor szabályozhatósága. További riboszómakötőhely és transzlációs startkodon beépítésével elértük, hogy jelentősen bővült a vektorunkkal előállítható fehérjék köre.
A találmány tárgya tehát eljárás új expressziós vektor előállítására homopolimer aminosavrészt kódoló szekvencia beépítésével, amely abban áll, hogy a pERVI/23 vektorcsalád valamely tagjába a promóter, operátor, riboszómakötőhely és transzlációs startkodon régiói után - az expresszáltatni kívánt gén elé - egy 15-20 aminosavnyi β-galaktozidáz részt kódoló szekvenciát, az operátor szekvencia, vagy annak valamely részlete megismétlését, újabb riboszómakötőhelyet, transzlációs startkodont, egy 5-10 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt kódoló szekvenciát, majd egy újabb ATG-kodont építünk be.
A találmány szerinti expressziós vektor és a vele biztosított génexpresszió főbb jellegzetességei a következők:
HU 200486 A
- a vektor rendkívül erős regulálható promotert hordoz;
- az mRNS és fehérje szintű védelmet az expresszáltatni kívánt gén előtt elhelyezkedő β-galaktozidáz részt kódoló szekvencia, és a homopolimer aminosav részt kódoló szekvencia alapján szintetizálődő homopolimer aminosav farok látja el;
- a farok hossza összesen csupán kb. 40 aminosav, ami a tennék tisztítását lényegesen megkönnyíti;
- a kifejeztetni kívánt gén elé beépített ATG-kodon következtében egyszerű BrCN-os hasítással leválaszthatjuk a termék fehérjéről a további, nemkívánatos, fuzionált fehérjerészeket;
- a β-galaktozidázt kódoló részt követően egy második, csaknem teljesen ép lac operátor szekvencia található (a β-galaktozidázt kódoló résszel és az aminosavakat kódoló szekvenciával azonos leolvasási fázisban). Ez a második operátor az első - promoter mögötti - intakt operátor szakasszal együtt tökéletessé teszi a repressziót még olyan erős promoter mögött is, mint a riboszómális RNS operon p2 promoteiéből és az E. coli lac operon szabályozó szekvenciáiból kialakított 6/23 promoter (lásd 197 595 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás);
- a β-galaktozidázt kódoló rész mögött és a homopolimer aminosavakat kódoló szekvencia előtt egy második riboszómakötőhely és transzlációs startkodon található. Kísérleti adatok arra mutatnak, hogy bizonyos fehérjék esetén csak az első vagy második, míg más esetekben mindkét transzlációs szignál felhasználódik, így gyakorlatilag a rendszer szabadsági foka nőtt meg azáltal, hogy a baktérium transzlációs apparátusa maga választhatja meg a számára optimálisabb, könnyebben elérhető szignált;
- a vektor alkalmas bármely más, Clal linkerekkel ellátott, ill. a vektor Clal helyére beépített fehérje gén expressziójára (természetesen a polilinkerben lévő egyéb restrikciós helyek is felhasználhatók);
- különböző fehérjék egylépéses, immunológiai módszeren alapuló tisztítására is lehetőség kínálkozik a monoton aminosav farok segítségével;
- az eddig kipróbálásra került gének esetében (humán proinzulin, szintetikus inzulin A és B lánc, vasoaktív intentirális polipeptid) a vektorral igen magasszintű (az ossz sejtfehérje 25-30 %-át kitevő) expressziőt sikerült elérni.
A fenti expressziós vektor felépítésére kidolgozott találmány szerinti eljárás előnyösen az alábbi - későbbiekben részletezendő - lépéseket foglalja magába.
1. Kiválasztunk egy olyan peptidet, melynek génje klónozott formában rendelkezésünkre áll, és amely pepiidről ismert, hogy E. coli sejtben rendkívül instabil (pl. humán proinzulin).
2. A gén 5’ végéhez (kezdetéhez) Clal linkéit ligálunk úgy, hogy a Cla I linker utolsó 3 nukleotidja (ATG) közvetlenül megelőzze a gén első aminosavát kódoló nukleotid tripletet (az ATG kodon által kódolt metionin aminosav a fúziós termék BtCN-os hasítását teszi lehetővé), majd a Cla I linkerrel kezdődő gént egy alkalmas plazmidban klónozzuk, lac regulátor szekvenciákat (operátor és riboszómakötőhely) követően.
3. Az így kapott plazmid egyedi Cla I restrikciós helyére beépítünk egy szintetikus oligonukleotidot, amely néhány treonin aminosav egymást követő kodonját tartalmazza. Helyes orientációjú beépülés esetén egyrészt a threoninok azonos leolvasási fázisban vannak a génnel, másrészt a Cla I hely az oligonukleotidnak csak a génhez közelebbi végénél regenerálódik.
4. Az így kapott plazmidból a
- lac regulátor régiót;
- a treoninokat kódoló oligonukleotidot;
- Cla I linkért;
- valamint a gént tartalmazó DNS darabot alkalmas restrikciós enzimmel vagy enzimekkel kivágjuk és a pER Vl/23 plazmidcsalád valamely tagjának α-peptid kódoló régiójában lévő egyedi PvuII restrikciós helyre klónozzuk, úgy, hogy a PvuII helynek megfelelő pozícióban egyedi restrikciós hely (R) generálódjék. Az így kapott plazmid releváns régiójában az alábbi funkciójú DNS szakaszok találhatók egymást követően; 6/23 promoter, lac regulátor régió I; az α-peptid első 34 aminosavát kódoló DNS szakasz; R egyedi restrikciós hely, lac regulátor régió Π; a monoton threonin oligopeptidet kódoló DNS szakasz; Cla I linker az ATG kodonnal; valamint a stabilizálni kívánt peptid génje.
5. A következő lépésben az R restrikciós enzim helyet felhasználva a plazmidot linearizáljuk, majd Bal 31 exonukleázzal deléciósorozatot képezünk, olyan körülmények között, hogy az enzim legfeljebb néhányszor 10 nukleotidot emésszen le, majd a plazmidokat DNS ligázzal recirkularizáljuk.
6. Transzformálás után olyan klánokat keresünk, melyek nagy mennyiségben expresszálnak - a kívánt mérettartományba eső - idegen fehérjét
7. Immunológiai módszerrel (RIA, immunoblot) igazoljuk, hogy a termelt fúziós peptid valóban tartalmazza a kifejeztetni kívánt fehérjét
8. A plazmid pontos nukleotid sorrendjét szekvenciázással állapítjuk meg.
9. A Cla I restrikciós hely felhasználásával a gént hordozó DNS darabot kicseréljük egy polilinker szekvenciára, amely lehetőséget nyújt tetszőleges egyéb peptidek génjeinek klónozására.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példával szemléltetjük részletesebben, anélkül, hogy igényünket a példában ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
A pER 23 Threo a plazmid elkészítése
A konstrukció előállítása során 3 különböző plazmidból indultunk ki: pSzI 153, pERVI/23 PLH4, pERVI/23(+ATG). A pSzI 153 elnevezésű plazmid a 4363/84 alapszámú bejelentésünk között szerepel, a másik kettő pedig a 197 595 lajstromszámú szabadalmi leírásban ismertetett vektorcsalád tagja.
A pSzI 153 plazmidból a humán proinzulint kódoló DNS szakaszt Clal és Hind ΙΠ restrikciós enzimekkel kivágjuk, ahol a kivágott DNS fragmentumon a Cla I linkéiből származó nukleotid tripletet követően közvetlenül a fehérje első aminosavát kódoló TIT kodon következik. Az első lépésben a Cla I, Hind ΙΠ restrikciós enzimekkel történő emésztéssel kapott DNS fragmentumot (proinzulin gént) a pER23(+ATG) plazmid polilinker régiójában található Ga I, Hind ΙΠ helyre klónozzuk.
Második lépésben az így előállított plazmid továbbiakban Intermedier I - Ga I helyére, a pro3
HU 200486 A inzulin gént közvetlenül megelőzően beépítünk egy szintetikus, kettős szálú oligonukleotidot, amely 7 db treonin aminosav egymást követő kodonját tartalmazza, és mindkét végén - Cla I restrikciós enzimmel emésztett plazmiddal összekapcsolható - ún. ragadós véget hordoz. Az oligonukleotidot úgy tervezzük meg, hogy helyes orientációjú beépülés esetén a treonin kodonok a proinzulin génnel azonos leolvasási fázisban legyenek, valamint, hogy az oligonukleotidnak csak a génhez közelebbi végén regenerálódjon a Cla I hasítóhely. (Ez utóbbira azért van szükség, hogy a későbbiek során az így keletkezett egyedi Cla I restrikciós helyet felhasználva, a proinzulin gént tetszőleges egyéb peptid génjére cserélhessük.) [Itt jegyezzük meg, hogy a Sung et. al. közlemény (lásd a bevezetőben) állításaival ellentétben a fentiek szerint kapott - továbbiakban Intermedier Π - plazmiddal transzformált E. coli kiónoknál nem kaptunk kimutatható expressziót.]
Következő lépésben az Intermedier Π plazmid egyedi Nsi I restrikciós helyét EcoRI hasítóhellyé alakítjuk. Ennek során Nsi I emésztés után T4 polimeráz enzimmel történő kezeléssel leemésztjük a 3’ túlnyomó végeket, majd a plazmidot újból cirkularizáljuk DNS ligázzal, nagy mennyiségű - polinukleotid kinázzal foszforilált EcoRI linker jelenlétében. Az eredményül kapott plazmidot a továbbiakban Intermedier ΙΠ-nak nevezzük.
Továbbá a pER23 PLH4 plazmid egyedi Pvu II helyére - az α-peptid kódoló régió közepébe - szintén beépítünk egy EcoRI linkért, az előzőekhez képest azzal az eltéréssel, hogy itt a T4 polimeráz enzimmel történő kezelés szükségtelen volt, lévén, a PvuII enzim amúgy is tompa véget képez.
Ezután az így kapott - továbbiakban Intermedier IV - plazmid EcoRI Hind ΠΙ helyére klónozzuk az Intermedier III-ból származó EcoRI, Hind ΠΙ fragmentet - ezt a plazmidot továbbiakban Intermedier V-nek nevezzük, mely plazmid releváns régiójának szerkezetét az 1. ábra ismerteti.
Következő lépésben az Intermedier V plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd Bal 31 exonukleázzal - az EcoRI helytől mindkét irányban elindulva - deléciósorozatot képezünk. A kapott sorozat azon elemét választjuk ki, amelynél a Bal 31 néhány tucat nukleotidot emésztett le mindkét irányban. Ezáltal csökkentettük az α-peptid kódoló régió és a 7 treonin kodon távolságát.
A DNS ligázzal történő recirkularizáció után a kapott plazmidkeveréket E. coli JM 107 törzsbe transzformáljuk és a kiónok közül olyanokat keresünk, melyek nagy mennyiségben expresszálnak egy - a várt mérettartományba eső - idegen fehérjét. [A kapott plazmid pontos meghatározásának érdekében kiválasztottunk egy alkalmas kiónt, és a belőle preparált plazmidon a deléció végpontjait DNS szekvenciaanalízissel határoztuk meg. (A konkrét konstrukciót és szekvenciát a 2/a, 2/b és 3. ábra mutatja.) A termelt fúziós fehérje erősen reagált humán proinzulin fehérjére specifikus ellenanyagokkal.]
Végezetül a legutolsó lépésben a proinzulin gént tartalmazó Cla I, Hind ΙΠ fragmentet a VU23 PLH4-ből származó - πνχ miniplazmid eredetű - Cla I, Hind III polilinker fragmentumra cseréljük ki.
Vegyszerek és preparátumok
Az általánosan használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, REANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak.
A [_32P ATP és a'32P]dATP preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100150 TBq/mM volt
A használt PvuH, EcoRI, Hindin, restrikciós endonukleázokat az MTA SZBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján [Methods in Enzimology (Ed: L.Grossmann, V. Moldave) Vol. 65. pages 89-180]. A Clal, Nsil enzimek a New England Biolabs készítményei voltak.
A BAL31 nukleáz és Klenow-enzim (E. coli DNAP-polimerasel Large Fragment) New England Biolabs, a bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) Worthington, a pankreász RN-áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt
A T4 indukált polinukleotid ligáz Murray et al. módszere szerint készült [Murray, N.E., Burce S.A. and Murray, K: Molecular cloning of the DNA ligásé gene from bacteriophage T4. J. Mól. Bioi. 132 (1979) 493-505].
Törzsek
E. coli K12 JM107 [Yanisch-Perron, C. és mtsai: Improved M13 phage cloning vectors and hőst strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985) 103-119].
Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bacto-tryptone-t, 5 g Bacto Yeast extract-ot és 5 g NaCl-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A β-galaktozidáz enzim N-terminális rész (α-peptid) expressziójának becslésére alkalmas indikátor lemezek összetétele literenként:
20 g casaminosav
6g N32HPO4
3g KH2PO4
0,5 g NaCl
1 g NH4CI
15 g Bacto-Agar
20 mg X-gal (dimetil-formamidban oldva)
2 mM MgCte
0,1 mM CaCl2
A β-lactamáz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 pg/rnl koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük.
Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törzset 100 gg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és ODöoOnm 0,70,8 elérésekor 170 pg/ml kloramfenikolt adtunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS izoláláskor a Qewell és Helinski által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewell, D.B. and Helinski, D.R., (1969) Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62, 1159-1166], majd a plazmid DNS-t Sephactyl SÍ000 (Pharmacia) oszlopon vagy cézium-41
HU 200486 A klorid-ethidiumbromid sűrűség gradiensben ultracentrifugáivá tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálásra (1,0-1,5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowicz által módosított kálium-acetátos módszert alkalmaztuk (Maniatis, T„ Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Láb., New Yoik].
DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England Biolabs által javasolt reakció körülmények között történt
Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30-40 μΐ) 0,5-1,0 pg DNS-t, 66 mM Tris-HCl-t (pH 7,6), 5 mM MgCh-ot, 5 mM dithiothreitolt, 1 mM ATP-t és 1 egység T4 indukált polinukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2-3 órán át, 14 °C-on végeztük [Maniatis T„ Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York]. Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30-40 pg/ml DNS, 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgCh, 5 mM dithiothreitol, 0,25 mM spermidin, 1 mM ATP, 10 pg/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt A reakcióelegyhez 4-6 egység T4 indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8—12 órán át 14 C-on inkubáltuk.
DNS minták gélelektroforézisét 0,8-2,0 %-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mtsai által leírt (1974) módon végeztük. A poliakrilamid gélelektroforézis - 4 és 8 %-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva - a Maniatis, T., Jeffrey, A. and van de Sande, H. (1975) [Chain length determination of small double and single-stranded DNS molecules by polyacrylamide gél electrophoresis. Biochemistry 14, 3787-3794] által közölt recept szerint történt.
DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Winberg G., Hammarskjöld, M. (1980) [Isolation of DNA írom agarose gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253] DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk.
BAL31 nukleázzal a DNS fragmentumokat 100 pg/μΙ végkoncentrációban, 600 mM NaCl, 12 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM EDTA összetételű reakcióelegyben 30 ’C-on emésztettük. A megkívánt rövidítés mértékétől függően 1,0 pg DNShez 0,4-1,2 egység enzimet adtunk. Minden esetben az adott DNS fragmentummal és a rendelkezésre álló BAL31 enzimpreparátummal teszt reakciót készítettünk, amelyben különböző idejű inkubálás után vett minták gélelektroforetikus analízisével meghatároztuk a fragmentum megrövidülésének mértékét. Az enzim működését a reakcióelegy fenolos extrakciójával állítottuk le, és a DNS etanolos kicsapása után a végeket a 3’ végek jelölésére alkalmas reakciókörülmények között Klenow polimerázzal tompa végekre javítottuk [Maniatis, T„ Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York].
Kompetens sejteket a JM107 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York] CaCl2os eljárással készítettünk.
DNS fragmentumok 5’ végeinek defoszforilása, végjelölése polinukleotid kinázzal és -2P ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilbert, W. (1980) [Sequencing end-labeled DNA with basespecific Chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65 499-560] által leírt protokoll szerint történik.
Az inzulin tartalmú fúziós fehérjét immunobiot módszerrel mutattuk ki (Towbln eL al.: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to introcellulose sheets: Procedúra and somé applications, Proc.Nat.Acad.Sci. USA,. 76:4350, 1979).
Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York] által leírt útmutatásokat követtük.
Deponálási adatok:
Deponált törzs jele Deponálási szám Deponálás dátuma
y 1090/pszI. 153 NCAIM 1064 1988. július 13. 8 óra 50 perc
JM 107/pER 23 Threo-alfa NCAIM 1059 1988. július 13. 8 óra 50 perc
Hivatkozási jelek listája Pr : promoter
TiT2: transzkripciós terminátorok sp : spacer régió sd : Shine-Dalgamo szekvencia (riboszőmakötőhely) aa : aminósav op : lac operátor
V : delécióképzés (Bal 31 exonukleázzal) nu : nukleotid thr : threonin kodonok őri : replikációs origó a : alpha-peptid gén
h.p.i.: humán proinzulin gén
ApR : ampicillin rezisztenciát biztosító béta-laktamáz gén E : Eco Rí restrikciós enzim Ba : Bam Hl restrikciós enzim Pst : Pst I restrikciós enzim Bg : Bgl Π restrikciós enzim X : Xba I restrikciós enzim
H : Hind ΙΠ restrikciós enzim

Claims (5)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás expressziós vektornak a pER VI/23 vektorcsalád valamely tagjából kiinduló előállítására homopolimer aminosavrészt kódoló szekvencia beépítésével, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott plazmid-vektomak a promóter, operátor, riboszómakötőhely és transzlációs startkodon régiói után - az expresszáltatni kívánt gén elé - egy 15-20 aminosavnyi β-galaktozidáz részt kódoló szekvenciát, az operátor szekvencia, vagy annak valamely részlete megismétlését, újabb riboszómakötőhelyet, transzlációs startkodont, egy 5-10 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt kódoló szekvenciát, majd egy újabb ATG-kodont építünk be.
    HU 200486 A
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy kiindulási expressziós vektorként a pERVI/23[+ATG] vektort alkalmazzuk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 17 aminosavnyi β-galaktozidáz részt kódoló szekvenciát építünk be.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 7 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt, előnyösen treonint kódoló szekvenciát
  5. 5 építünk be.
HU883685A 1988-07-14 1988-07-14 Process for producing expression vector HU200486B (en)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU883685A HU200486B (en) 1988-07-14 1988-07-14 Process for producing expression vector
PCT/HU1989/000035 WO1990000610A1 (en) 1988-07-14 1989-07-11 New expression vectors
AU39619/89A AU3961989A (en) 1988-07-14 1989-07-11 New expression vectors
KR1019900700542A KR920007684B1 (ko) 1988-07-14 1989-07-11 신규한 발현 벡터와 그의 제조방법
JP1507625A JPH04500453A (ja) 1988-07-14 1989-07-11 新規の発現ベクター
EP89907811A EP0424429A1 (en) 1988-07-14 1989-07-11 New expression vectors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU883685A HU200486B (en) 1988-07-14 1988-07-14 Process for producing expression vector

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU200486B true HU200486B (en) 1990-06-28

Family

ID=10965065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU883685A HU200486B (en) 1988-07-14 1988-07-14 Process for producing expression vector

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0424429A1 (hu)
JP (1) JPH04500453A (hu)
KR (1) KR920007684B1 (hu)
AU (1) AU3961989A (hu)
HU (1) HU200486B (hu)
WO (1) WO1990000610A1 (hu)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU197595B (en) * 1987-09-16 1989-04-28 Richter Gedeon Vegyeszet Process for producing expression vectors

Also Published As

Publication number Publication date
KR920007684B1 (ko) 1992-09-14
KR900702038A (ko) 1990-12-05
EP0424429A1 (en) 1991-05-02
JPH04500453A (ja) 1992-01-30
WO1990000610A1 (en) 1990-01-25
AU3961989A (en) 1990-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Miller Primary structure of the himA gene of Escherichia coli: homology with DNA-binding protein HU and association with the phenylalanyl-tRNA synthetase operon
EP0207459B1 (en) New gram-positive expression control sequences
Carter-Muenchau et al. Growth-rate-dependent regulation of 6-phosphogluconate dehydrogenase level mediated by an anti-Shine-Dalgarno sequence located within the Escherichia coli gnd structural gene.
Zerbib et al. Expression of proteins essential for IS1 transposition: specific binding of InsA to the ends of IS1.
JPH0235089A (ja) タンパク質の発現方法およびそれに用いるクローニングベクター
JPS58107184A (ja) 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法
US5024943A (en) Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
US4642333A (en) Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein B of herpes virus types 1 and 2
Moore et al. The effect of tra mutations on the synthesis of the F-pilin membrane polypeptide
Loechel et al. A novel translation initiation region from Mycoplasma genitalium that functions in Escherichia coli
Berman et al. Selection of lac gene fusions in vivo: ompR-lacZ fusions that define a functional domain of the ompR gene product
US4626510A (en) Plasmidic vectors for expressing in bacillus subtilis and a method of preparing them
Jay et al. Gene expression: chemical synthesis of E. coli ribosome binding sites and their use in directing the expression of mammalian proteins in bacteria
US4987078A (en) Plasmid vectors for expression in Escherichia coli and/or Bacillus subtilis
Vandenberghe et al. 3'-Terminal nucletide sequence (n equals 361) of bacteriophage MS2 RNA.
Hegemann et al. Mutations in the right boundary of Saccharomyces cerevisiae centromere 6 lead to nonfunctional or partially functional centromeres
Seiki et al. Identification of a suppressor sequence for DNA replication in the replication origin region of the Bacillus subtilis chromosome.
Mukhopadhyay et al. Replication from one of the three origins of the plasmid R6K requires coupled expression of two plasmid-encoded proteins.
HU200486B (en) Process for producing expression vector
Donly et al. Affinities of ribosomal protein S20 and C-terminal deletion mutants for 16S rRNA and S20 mRNA
US4703012A (en) High copy-number plasmid vectors, production and use thereof
SE469560B (sv) Foerfarande foer uttryckande av gener medelst bacillus brevis
CA1278540C (en) Modified antibiotic resistance gene
Mackie Cloning of fragments of lambda dapB2 DNA and identification of the dapB gene product.
EP0109428B1 (en) Cloning vector with indicator genes which have been inactivated by frameshift

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee