JPH0442627B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は全血液中の細胞性成分の分離方法およ
び装置に関し、さらに詳しくは未梢血液リンパ球
を高純度および高収率で遠心分離する方法および
装置に関する。

体液例えば血液の臨床的検査は医療において極
めて重要である。かかる検査は体液の特定成分に
ついて行なわれ、体液供給者の医学的状態の指針
を与えるものである。

血液試料を採取した場合、分析すべき血液試料
の特定成分ができるだけ純粋な形で技術者に渡さ
れることがしばしば必要である。かかる成分の分
離に遠心分離がしばしば使用される。遠心分離の
際、血液は容器内で、懸濁している赤血球、白血
球および血小板が血漿または血清と分離される迄
所定の時間「遠心沈降」にかけられる。血清の方
はその中に存在する臨床的に重要な可溶性成分に
ついて検査することができる。遠心後、分離した
血清および細胞（および血小板）はデカンテーシ
ヨン、サイホン、ピペツト法のいずれかによつて
分離する。血清は例えば米国特許第4321432号明
細書に記載の如き自動分析装置によつて分析しそ
の中の特定の成分例えばグリコース、コレステロ
ール等の濃度を測定することができる。また、分
離された細胞および血小板を検査して臨床的に重
要な知見を得ることもできる。例えば異種の白血
球および血小板の絶対数および相対値は供給者の
医学的状態に関する極めて重要な知見を与えるも
のである。通常白血球の分離は遠心分離によつて
行なわれ、この場合白血球と赤血球との中間の比
重を有する生理的に不活性な障壁を血液試料を入
れた管に最初に導入する。従つて遠心分離におい
て白血球は上澄液と共に、障壁によつて赤血球と
分離される。白血球の比重はサブセツトが異つて
も類似しているので、白血球の一サブセツトであ
るリンパ球をこの技法で純粋に分離することは困
難である。かかる技法は例えば米国特許第
4190535号明細書に記載されている。

以後純度という語は、分離後の上澄液中に存在
するリンパ球の数を、その血液試料画分中に存在
するすべての種類の白血球の合計数で除した値の
意味で使用する。収率とは分離された試料中に存
在するリンパ球の総数を原全血液試料中のリンパ
球の数で除した値を意味する。生活力とは分離さ
れた試料中のトリパン青排除性リンパ球の数をこ
の試料中のリンパ球の総数で除した値を意味す
る。

研究室においても臨床試験室においても、純粋
な未梢血液リンパ球の取得の必要性が益益増大し
ている。

血液試料中のリンパ球の数の検査により臨床的
に極めて重要な知見が得られる。例えば組織適合
性の判定において、ある種の試剤（抗原）に対す
るリンパ球の反応は、ヒトのある器官が移植の際
に受容されるか拒否されるかを知るのに有用であ
る。また免疫能の試験においてはリンパ球を特定
の物質（抗原）と混合して両者間の反応を調べ
る。反応の程度により患者の免疫不全性疾患、自
己免疫性疾患等の存在に関する指標が得られる。
しかし有意義な結果を得るためには血液試料から
得たリンパ球が高度に純粋、すなわち他のサブセ
ツトの白血球を含まず、原血液試料中のリンパ球
の総数を正確に反映することが重要である。検査
結果が患者の医学的状態を正確に示すためには高
い収率と純度とが極めて重要である。

リンパ球の分離のためには従来多数の方法が知
られている。例えば米国特許第3709791号明細書
には全血液試料中のリンパ球を他の細胞性成分と
分離する方法および装置が記載されている。その
記載によれば、血液試料を使い捨て注射筒内で磁
性粒子と混合しインキユベートすると、粒子は単
球および好中球の食作用を受けるがリンパ球には
捕食されない。その結果食作用を有する白血球は
〓磁気的に標織〓される。さらに、赤血球の沈降
促進のため沈降剤が注射筒内に導入される。次
で、沈降した赤血球を除く血液試料を注射筒か
ら、高強度不均一磁界内を通る導管に通す。標議
された白血球および遊離の磁性粒子はこの磁界に
よつて導管内に残り、精製リンパ球を採取するこ
とができる。

さらに遠心分離法も白血球の分離に使用されて
きた。広く使用される一つの方法は、例えば、
Transplantation、22巻、21号、101ページ
（1976年）に記載されている。この方法では、希
釈血液試料をフイコル−ハイパツク（Ficoll−
Hypaque）液上に層状に置く。この液は密度障
壁として使用するもので、単核白血球（および血
漿ならびに血小板）と赤血球および分裂白血球と
のそれぞれの比重の中間に調節された比重を有し
ている。フイコル−ハイパツクは水性液体である
ので希釈血液でその表面上に層を作る際には相互
に混り合わぬよう注意して行なわなければならな
い。また、上澄液および細胞性成分はフイコル−
ハイパツク液と混合し得るので、遠心分離後の相
分離も慎重に行なう必要がある。一般に試料は希
釈され（１：１ないし１：４）、得られる収率は
比較的低くその原因の少くとも一部は希釈の微妙
な影響のためである。また白血球のサプセツトの
比重が互いに類似しているので分離したリンパ球
の純度が低い。

密度障壁−希釈血漿界面においてよりシヤープ
の細胞帯を得られるよう遠心分離前に試料を希釈
することによつてリンパ球の分離を改善すること
が試みられた。シヤープな帯形成により採取は容
易になりリンパ球収率は若千改善される。しかし
収獲されたリンパ球の収率、純度はなお理想の段
階に達しない。

さらに、遠心分離法において有用な密度障壁材
料に関しても改良が行なわれている。例えば米国
特許第4021340号および米国特許第4333564号明細
書には、チキソトロピー性を有する疎水性ゲル状
不活性組成物の使用が記載されている。かかる材
料は、分離用容器への試料の導入が容易な点でフ
イコル−ハイパツク液に優つている。これらの材
料は疎水性であるため試料が導入時にこの材料と
混合する傾向はほとんど無い。しかもこれらの材
料は遠心力によつて比較的容易に変形および移動
するが、遠心後には比較的変化し難い障壁となる
ため、上澄液の分離が著しく容易になる。

本発明の目的とする所は、例えば高収率で実質
的に単球、好中球およびその他の食作用性細胞
（以下食作用性細胞と総称する）の混入していな
いリンパ球画分を得るための、凝固防止血液試料
中のリンパ球を遠心分離するための方法および装
置である。周知の如く白血球のサブセツトの比重
は相互にほとんど差が無い。例えば単球の比重
（浮遊密度）の範囲はリンパ球と重なつており、
前者はリンパ球の数の約25％存在する。このため
通常の遠心分離法を使用する場合白血球のサブク
ラスないしサブセツト間の分離は比較的良くな
い。従つてリンパ球のみを収獲することは極めて
困難である。

本発明によれば、生理的で親水性の媒質によつ
て湿潤または懸濁した高密度の粒子と、疎水性不
活性障壁層材料との両者を適当な容器または管内
に置くことにより、高収率および高純度で典型的
には一段工程のリンパ球分離を達成することがで
きる。もしこれらの成分間の相互作用または混合
が生ずれば高密度粒子が障壁材料内に捕促される
恐れがあるがこれは、実質的にすべての粒子が食
作用を受け得るようにすることによつて防止する
ことができる。全血液試料を予備希釈の必要なし
に管内に導入し、食作用増進のためにインキユベ
ートしながら粒子と混合する。インキユベーシヨ
ン後管を遠心操作にかけると、赤血球および食細
胞（後者は食作用の結果比重が増加している）は
容易に障壁層を通過し、またはその付近に集る。
得られた上澄液は血小板と、実質的に単球および
顆粒球の混在しない高収率および高純度のリンパ
球層とを含有する。その後リンパ球は容易に分離
して所望の目的に使用することができる。操作の
全所要時間は、従来技術によるリンパ球分離が１
時間以上であるのに対し40分未満である。

障壁材料は好ましくは水に不溶（疎水性）のチ
キソトロピ−性材料であつて、化学的に不活性で
あり、比重が分離すべきリンパ球よりやや大きい
が赤血球および食作用を行つた白血球の比重より
は小さいものである。障壁材料は最初は容器の底
部に置く。粒子は親水性媒質によつて被覆（湿
潤）するかその中に懸濁して障壁材料上に導入す
る。従つてこれら粒子が障壁材料に附着またはこ
れと混合して食作用を受けられなくなつたり障壁
材料の比重を増加させたりする恐れはない。それ
故、障壁材料および粒子を入れた管は長期間貯蔵
することができ、唯一の必要条件は粒子を湿潤ま
たは被覆している親水性材料が、例えば蒸発防止
のため管を密封することにより、保持されること
である。

本発明の大きな利点は、添付図面による以下の
詳細説明により明かとなるであろう。ここで 第１図はリンパ球分離装置の縦断面図であり、 第２図はリンパ球分離装置の別の態様の部分縦
断面図であり、 第３図は血液試料添加後、混合およびインキユ
ベーシヨン工程中における第１図の装置を示し、 第４図は遠心分離後の第３図の装置を示す。

第１図について説明すると、遠心分離器に装着
するのに適当な型の容器または管１はゴム栓３に
よつて封じられる。密栓に先立つて、調節された
比重すなわち約1.030−1.087を有するゲル状で不
活性な障壁材料５と、不活性粒子例えば鉄、白
金、金、銀、鉛等またはそれらの合金の粒子の懸
濁物７とを管１内に入れる。これら粒子は食作用
を受けた場合に食細胞の「実効」比重を障壁材料
５の比重より大とするに十分な比重を有してい
る。例えばこれら粒子の比重は約3.0gｍ／cm³より
大であつてよい。全血液試料は患者から直接注射
針採取法で通常EDTA抗凝固剤と共に採取して
管１に導入する。

障壁材料５の選定は、これら疎水性であり、か
つ、チキソトロピー性を示すかまたは適当な温度
例えば室温よりやや高温度の融点を有し、液状で
容易に遠心分離でき次に遠心分離後室温よりやや
低温に冷却すると固化して比較的固い障壁を形成
し得るように行なう。

障壁材料５は好ましくはチキソトロピー性を有
し、かつ液状シリコーン（例えばジメチルポリシ
ロキサン）と非常に微細な疎水性シリカ粉末とか
ら成るものであつてよい。液状シリコーンとシリ
カ粒子とを混合してゲル状のコンシステンシーと
少くとも約200000csの初期粘度とを有するように
する。また障壁材料５の比重は約1.030から1.087
の範囲に設定することができ、この調節は混合物
中の液状シリコーンとシリカ粉末との比を変える
ことにより行なうことができる。理解し得る如
く、障壁材料５の比重は、例えば、1.07すなわち
血液試料中に存在するリンパ球（および血小板）
の比重より僅か大きいが赤血球および粒子を捕食
した顆粒球および単球の比重よりは小さい値に設
定することができる。

あるいはまた、障壁材料５は低密度液体例えば
ｎ−ヘキサデカンまたはｎ−オクタデカン等と高
密度ハロゲン化炭水素油（例えばニユージヤージ
ー、ハツケンサツク所在ハロカーボンプロダクツ
社の27／100−700／100シリーズ）とからの密度
1.030−1.087で融点が室温より僅か高い混合物か
ら成つていてもよい。

いずれの場合にも障壁材料５の量は図に示す如
く遠心後管１の軸に直角に連続障壁層を形成する
のに十分でなければならない。例えば、管１の大
さによるが、この量は1.7ないし2.0グラムの範囲
であることができる。

リンパ球以外の白血球の特定サブセツトは本質
的に食作用を有するので、かかるサブセツトの細
胞は、これと接触する異物にロイコアドヒジヨン
（leukoadhesion）により附着させ食作用を起さ
せることができる。本発明の好ましい態様におい
ては鉄粒子をその高い比重すなわち約7.5gｍ／cm³
のために使用するが、比重が約3.0gｍ／cm³より大
で白血球が捕食し得る大きさの、比較的不活性な
任意の粒子を使用し得ることは明らかである。こ
れらの粒子の目的は要するに食細胞を「標織」し
それによつて細胞の「実効比重」を障壁材料５の
比重より大きくすることである。これによつて食
作用のある白血球と無い白血球との比重の差が大
幅に増大し、後述の如くその分離が容易となる。
その結果分離されたリンパ球の収率および純度は
実質的に増大する。その上リンパ球の生活力は95
％のオーダーに維持される。

食作用には遊離の二価陽荷電イオン例えばカル
シウムまたはマグネシウムイオンの存在が必要で
あるので、懸濁液７中には塩類例えば塩化カルシ
ウム、塩化マグネシウム等が溶解含有されてい
る。抗凝固剤としてEDTAが使用されるときは
かかる塩の添加は、EDTAに結合した遊離イオ
ンを置換することにより「EDTA」血液のイオ
ン含量を回復し、懸濁液７内のイオン濃度を正常
とするのに役立つ。この場合、EDTAが添加イ
オンによつて中和される結果血液試料が凝固する
のを防止するため、懸濁液７にはまた適当な代用
生理的抗凝固剤例えばヘパリンをも含有させる。
最初の抗凝固剤がヘパリンである場合の血液試料
のイオン含量は抗凝固剤によつて実質的に変化し
ないので、かかるイオンの添加は不要であること
は理解し得るであろう。さらに懸濁液７内の粒子
は通常食作用を促進するため、粒子表面に沈着さ
せた増感剤により増感される。かかる増感剤は、
懸濁液７中に含有されていてよいが、高度に陽に
荷電したポリマー、例えば、Ｄ，DLまたはＬ形
のポリリシン、ポリアルギニン等のような塩基性
ポリアミノ酸またはポリペプチドを含有して成つ
ている。粒子上の陽電荷は食作用を実質的に増進
させる傾向がある。食作用についてさらに理解を
深めるには米国特許第3700555号および米国特許
第3709791号明細書を参照されたい。

障壁材料５と懸濁液７を管１内に入れた後ゴム
栓３で栓をする。調製した管１は第１図に示す形
で技術者に提供される。粒子が水性媒質内に、そ
れに湿潤されるように含有されている限り、相当
数の粒子が障壁材料５または管１の壁に強く附着
することはあり得ない。従つて懸濁液７内の粒子
のほとんど全部が食作用を受けることができる状
態にある。障壁材料の疎水性と粒子の実効的親水
性とによつて上記の非附着現象が確保される。

第２図は粒子が懸濁液中に含まれない、本発明
の別の一態様を示す。図では粒子９の数が少なく
粒度が大きいが、これは単に説明の便宜上べあ
る。粒子９は非常に薄い親水性材料９ａの層例え
ばアガロースまたはポリアクリルアミド皮膜によ
つて〓湿潤〓または被覆されている。従つて粒子
９は障壁材料５の表面にも管１の内壁にも強く附
着することはない。そのため血液試料を管１内に
導入した場合粒子９は容易に試料液中に懸濁され
て食作用を受け得るようになる。別の方法とし
て、〓湿潤した〓粒子９を、管１に試料を加える
のと同時にまたは加えた後に添加することができ
る。

次に第３図において、栓３を除いて所定容量の
血液試料を針１１を通じて管１に導入する。所望
ならば針１１により直接栓３を通して試料を導入
してもよい。この場合には導入を可能とするため
密栓した管１を真空排気することができる。導入
後管１に再び栓をし、管１内の血液試料および懸
濁液１３を例えば、矢印１５で記号的に示す回転
式混合器内でよく混合する。混合中、混合物１３
を例えば37℃で15−30分間インキユベートする。
混合およびインキユベーシヨンは、混合物１３内
の各食細胞が多くの粒子と接触して確実に食作用
が行なわれるようになるに十分な時間継続する。
また、粒子は実効的に親水性であるので、混合工
程中粒子のほとんど全部が食作用を受け得る状態
に保たれ、これにより食作用に必要な全体の時間
が短縮される。従つて、かかる粒子を〓湿潤性〓
水性媒質中に懸濁するか湿つた親水性材料によつ
て被覆することにより、これらの粒子を管１内に
時間の制限なく存置し、しかも直ちに血液試料と
混合し得る状態とすることができる。

食作用工程が終了すると、第４図矢印１７で記
号的に示すように「遠心沈降」させるために管１
を遠心分離器内に置く。遠心分離の間、容器１を
比較的高速度、例えば約1200gで回転する。従つ
て赤血球および捕食した粒子を含有する細胞は比
重が〓高い〓ため管１の底部に移動し、一方、よ
り軽い血小板および比重の変化しなかつたリンパ
球は容器１内で上方に移動する。遠心分離の継続
に伴い血液試料の細胞性成分および障壁材料によ
る比重勾配が生じそれぞれ比重に応じた層をな
す。障壁材料５は応力下で流動して管１内を移動
して第４図に示すように静止障壁５ａを形成し、
これは低比重および高比重相１９および２５を有
効に分離する。低比重相１９は血漿（および血小
板）の層２１と障壁５ａのすぐ上のリンパ球層２
３とを含有する。高密度相２５は試料の他の成分
全部すなわち赤血球、捕食した粒子を含む白血
球、および捕食されなかつた粒子全部を含有す
る。

障壁５ａは低密度相１９の成分と非混合性であ
り、かつ遠心応力が無くなると再びゲル化するの
で、分離したリンパ球の採収は極めて容易にな
る。障壁層５ａは遠心分離後は固く比較的変形し
難いので、障壁５ａを撹乱することなしに低密度
相１９をピペツト２７によつて吸上げたり下げた
りして血漿層２１とリンパ球層２３とを混合しリ
ンパ球層２３を再懸濁させることができる。その
後再懸濁したリンパ球をピペツトで採取し所望の
任意の分析操作に付する。別の方法として、血漿
層２１の大部分を最初にピペツトで除き、層２１
の残りとリンパ球層２３とを採取して別の容器に
移し、所望の目的に使用する。

障壁層５の既述の如く室温よりやや高い融点を
有する低および高比重材料の混合物から成る場合
は、既述の通り障壁５ａを固化させ層２３のリン
パ球の収獲を容易とするに十分なだけ管１を冷既
する。

本発明の特定の態様について説明したが、本特
許の請求範囲を逸脱することなく多くの改変を加
え得ることは明かであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はリンパ球分離装置の縦断面図であり、
第２図はリンパ球分離装置の別の態様の部分断面
図であり、第３図は血液試料添加後、混合および
インキユベーシヨン工程中における第１図の装置
を示し、第４図は遠心分離後の第３図の装置を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 開放容器中に疎水性で化学的に不活性な障壁
   材料を導入して前記容器の底部に位置させ、 前記容器中の前記障壁材料上に食細胞の作用を
   受け得る不活性粒子を導入し、ここで前記障壁材
   料の比重は血液試料中のリンパ球よりも大きく、
   前記粒子および赤血球よりも小さいものとし、 前記粒子をそのまま保持し、かつ前記障壁材料
   と混合させないように前記粒子を親水性材料によ
   り湿潤し、 前記血液試料を前記容器中に導入して前記粒子
   と混合し、 前記混合物をインキユベートし、これにより前
   記粒子の少くとも一部は前記試料中の食作用性白
   血球により食作用を受けるものとし、 前記容器を、遠心分離して前記障壁層を前記試
   料中の前記リンパ球と、食作用を受けた粒子を含
   有する前記白血球、食作用を受けていない粒子お
   よび赤血球との間に移動させ、そして 前記遠心分離の後、前記リンパ球を収集するこ
   とを特徴とする、凝固防止血液試料中のリンパ球
   を他の白血球から分離する方法。 ２ 前記湿潤工程が、前記粒子の生理的親水性媒
   質中の懸濁液を形成することから成る、前項１に
   記載の方法。 ３ 前記湿潤工程が前記粒子を親水性材料により
   被覆することから成る、前項１に記載の方法。 ４ さらに、前記遠心工程ののち前記障壁材料を
   固化するため冷却を行なうことから成る、前項１
   に記載の方法。 ５ さらに、前記試料と前記粒子とを混合するた
   め前記容器を回転することから成り、ここで前記
   回転工程と前記インキユベーシヨン工程とは同時
   に行なわれるものとする、前項１に記載の方法。 ６ 前記回転工程とインキユベーシヨン工程とを
   37℃において約15ないし30分間行なう、前項５に
   記載の方法。 ７ 血液試料導入時にその受入を行なうための開
   放端を有する容器、 前記容器内の閉鎖端に位置する疎水性で化学的
   に不活性な障壁材料、 前記試料中の食作用性白血球による食作用を受
   け得る大きさの、親水性材料により湿潤されたそ
   して前記障壁材料上に位置する不活性粒子、およ
   び 比重が前記試料中のリンパ球より大であるが前
   記粒子および赤血球より小である前記障壁材料か
   ら成る、凝固防止血液試料中のリンパ球を他の白
   血球から遠心分離するための内蔵一体型分離装
   置。 ８ 前記障壁材料が、前記容器の遠心操作後に前
   記試料の比重の異なる相の間に障壁層を形成する
   に十分な容積を有するものである、前項７に記載
   の分離装置。 ９ 前記障壁材料が室温よりわずかに低い温度で
   は固体であるような液体である、前項７に記載の
   分離装置。 １０ 前記障壁材料の比重が約1.030ないし1.087
   である前項(7)に記載の分離装置。 １１ さらに前記開口端を封ずるための栓を含有
   する前項７に記載の分離装置。 １２ 前記容器が真空排気される、前項１１に記
   載の分離装置。 １３ 前記不活性粒子が生理的親水性媒質中に含
   有されている、前項７に記載の分離装置。 １４ 前記粒子が親水性材料によつて被覆されて
   いる、前項７に記載の分離装置。 １５ 前記親水性材料がアガロースまたはポリア
   クリルアミドである、前項７に記載の分離装置。 １６ 前記粒子の比重が約3.0gｍ／cm³より大であ
   る、前項７に記載の分離装置。 １７ 前記障壁材料が、少くとも約200000csの初
   期粘度を有しかつチキソトロピー性を示す、前項
   ７に記載の分離装置。 １８ 前記粒子が鉄、白金、金、銀、鉛およびそ
   れらの合金から成る群から選ばれる材料から形成
   される、前項７に記載の分離装置。 １９ 前記生理的媒質中に陽に荷電した重合体を
   食作用促進用増感剤として含有する、前項１４に
   記載の分離装置。 ２０ 前記媒質がヘパリンおよび二価の陽に荷電
   したイオンを含有する、前項１９に記載の分離装
   置。