JPH04355369A - 修飾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、可逆的に相互に結合し
得る２種類あるいはそれ以上の物質を修飾するに当たり
、それぞれの物質どうしが結合した複合体を形成させた
上で修飾を施し、その後、修飾された複合体を解離して
物質の修飾体を得る方法に関するものである。さらに詳
しくは、物質の複合体形成に関与する部位が修飾されて
結合活性が低下することのない修飾方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】近年、抗原・抗体反応、レセプター・リ
ガンド反応、ＤＮＡプローブ反応などの特異的相互作用
を利用して、体液中に存在する微量物質を測定する方法
が行われている。これらの測定に用いる標識体（標識物
質としてはラジオアイソトープ、蛍光物質、化学発光物
質、酵素などがある）を調製するに当たり、標識物質と
被標識物質を一溶液内に混合し、バッチ法にて反応させ
、反応終了後、過剰の未反応標識物質を透析、クロマト
グラフィーなどの手段を用いて分離除去するという方法
が用いられている。

【０００３】このような調製方法では、被標識物質が複
数の標識物質結合部位を有し、その中のいくつかが特異
的相互作用を示す部位と重なっているような場合、結合
活性が低下するという問題があった。例えば抗原・抗体
反応を利用した測定法に用いる抗体を、その表面のアミ
ノ基を利用して標識物質と結合させるときに、抗体の抗
原結合部位やその近傍のアミノ基と標識物質が結合した
場合には、抗原との結合活性がなくなった標識抗体や、
結合活性が著しく低下した標識抗体が混在することがあ
る。従って結合活性を有する均一な標識抗体を得るには
、バッチ反応混液をさらにクロマトグラフィーなどの手
段により分離精製する必要がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述のごとく従来の抗
体標識法では、被標識抗体と標識物質を同一溶液内に混
合して反応させるため、被標識抗体の限定された箇所に
標識物質を結合させることができなかった。即ち抗体の
抗原結合部位にまで標識物質が結合するため、抗原と結
合しない標識抗体が混入する可能性があった。さらに、
標識抗体が標識物質を介して非特異的に会合し多量体を
生成する場合があるため、分子量が均一でかつ抗原との
結合活性が均一な標識抗体を得ることが困難であるとい
う問題点があった。本発明の目的は、このような従来法
よりも迅速かつ高収率に均一な結合活性を示す修飾体を
調製する方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題に
関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本
発明は、可逆的に相互に結合し得る少なくとも２種類の
物質のうち、少なくとも１種類の物質を修飾する方法に
おいて、その少なくとも２種類の物質同士が結合した複
合体に修飾を施した後、修飾された複合体を解離させる
ことにより、少なくとも１種類の物質の修飾体を得るこ
とを特徴とする方法である。

【０００６】以下本発明を詳細に説明する。本発明に使
用される可逆的に相互に結合し得る物質とは、例えば抗
原・抗体反応における抗原と抗体、リガンド・レセプタ
ー反応におけるホルモンあるいはサイトカインとそれに
対応するレセプター、酵素反応における酵素と基質ある
いは補酵素、ＤＮＡ分子どうしなどの、ある特異的な相
互作用により互いに結合することのできる個々の物質で
あれば特に限定はなく、分子量の高低を問わない。生体
外での複合体形成に当たっては、関与する物質が生体内
に通常存在する場合は、これらの物質どうしの結合が生
体内で行われるときの生理的条件にできる限り近づけて
行うのが好ましいが、本発明の実施に先立って予備的に
実験を行い、複合体の形成を確認しておけば問題はない
。こうしてまず可逆的に相互に結合し得る少なくとも２
種類の物質どうしが結合した複合体を形成させる。

【０００７】ついでこのような複合体に修飾を施す。本
発明でいう修飾とは、相互に結合し得る物質の一部を分
解・除去したり、または何らかの物質を導入させたりす
ることを意味する。例えば、不要な配列の切断、標識剤
，担体などの結合などがあげられる。該複合体の修飾試
薬として、標識剤では例えば３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ
等の放射性物質、例えばフルオレセインイソチオシアネ
ート、テトラローダミンイソチオシアネート、フルオレ
スカミン、４−フルオロ−７−ニトロベンゾ−２−オキ
サ−１，３−ジアゾール等の蛍光物質、例えばアミノピ
レン、ルミノール誘導体、アクリジニウム誘導体等の化
学発光物質、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ウレアーゼ
等の酵素等を使用することができる。修飾試薬を該複合
体に導入する部位としては、該複合体中のアミノ基、チ
オール基、水酸基等を利用する方法がある。

【０００８】修飾方法としては、複合体を遊離の状態で
形成させ、次に修飾試薬と混合し反応させる方法、ある
いは、可逆的に相互に結合し得る物質の一方を固定化用
担体に固定化しておき、この物質を固定化した担体（以
下、固定化物質）および可逆的に結合し得る物質の他方
を同一溶液内にて懸濁し、複合体を形成させ、次に修飾
試薬と混合し反応させる方法などのバッチ法があげられ
る。さらに過剰の未反応の被修飾物質や修飾試薬を簡単
に除去できるという面においては、つぎに述べるカラム
法が好ましい。即ち、該固定化物質をカラムに充填し、
修飾しようとする物質溶液を送液し、カラム内にて複合
体を形成せしめた後、該複合体形成に関与していない未
反応の物質を洗浄し、次に修飾試薬溶液に切り換えて同
様に送液して反応させ、最終的に過剰の修飾試薬を洗浄
除去するという一連の操作を行う。被修飾物質や修飾試
薬を反応させる際には、それらを送液循環させると反応
収率の向上が期待できる。

【０００９】本方法に使用される固定化用担体は、その
基材として例えば、ガラス、シリカ等の無機系ゲル、ま
た例えば、スチレン、エチレングリコール、メタクリレ
ート等のポリマー系またはそれらのコポリマー系ゲル、
さらには例えば、デンプン、アガロース、デキストラン
等の多糖類系ゲル等が使用できるが、化学的安定性、保
存性、耐久性の面から、メタクリレート等のポリマー系
で、好ましくは水酸基等の親水基を保持した、蛋白質や
修飾試薬の非特異的吸着を防止できるゲルがよい。ゲル
の粒径としては、５〜５０μｍ程度のものが使用できる
が、固定化収率の面からは、５〜１０μｍ程度のゲルが
好ましい。

【００１０】修飾された複合体を修飾された相互に結合
し得る物質どうしに、あるいは特定の修飾された物質を
修飾された固定化物質から解離せしめる方法としては、
例えば、緩衝液のｐＨを生理的条件（約ｐＨ６〜８）か
ら外す、イオン（例えばカオトロピックイオン）強度を
上げる、有機溶媒（例えば酢酸、プロピオン酸等の表面
張力の低い有機酸）を添加する、温度を変化させる等が
ある。実施に先立っては、予備的に実験を行い、最適の
解離条件を確認しておけば問題はない。

【００１１】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように本発明は
、（１）可逆的に相互に結合し得る少なくとも２種類の
物質を修飾するに当たり、結合活性と分子量の均一な修
飾体を得ることができる（２）可逆的に相互に結合し得
る少なくとも２種類の物質の、相互の結合部位の検索に
有用である（３）短時間で修飾体の調製が可能であり、
自動化も容易なため、省力化が図れるといった有用性を
有している。

【００１２】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。（実施
例１）タンパク質固定化用担体１００ｍｇ（ＴＳＫｇｅ
ｌ　　Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ商品名　　東ソー株式会社
製）と、抗ヒトインターロイキン６・モノクローナル抗
体（ａｎｔｉ−ＩＬ−６）を１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．５）に溶解したもの（６６７μｇ／ｍｌ）３ｍｌを室
温で４時間反応させ、ａｎｔｉ−ＩＬ−６固定化担体を
調製した。この固定化ａｎｔｉ−ＩＬ−６をミニカラム
（１０×６ｍｍＩＤ）に充填し，１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解したヒトインターロイキン６（２
８０μｇ／ｍｌ）を室温にて１時間送液（１ｍｌ／ｍｉ
ｎ）した後、カラム内の遊離しているインターロイキン
６を洗浄した。

【００１３】次にカラム内で生成した免疫複合体に対し
て１０倍当量のフルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）を０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解し
たものを、室温にて１時間送液（１ｍｌ／ｍｉｎ）し、
カラム内の遊離しているＦＩＴＣを洗浄した。さらに１
０％アセトニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，０．
１Ｍ硫酸ナトリウム，ｐＨ６．８にて３０分間洗浄し、
免疫複合体と疎水的あるいはイオン的に吸着したＦＩＴ
Ｃを除去した。最後に６００μｌの０．１Ｍクエン酸・
塩酸混合液、ｐＨ１．５を注入して免疫複合体を解離さ
せＦＩＴＣ修飾されたＩＬ−６（ＦＩＴＣ−ＩＬ−６）
を得た。

【００１４】抗体との結合能を確認する意味で、得られ
たＦＩＴＣ−ＩＬ−６と過剰のａｎｔｉ−ＩＬ−６を混
合し３０分間静置させた試料を、排除限界分子量５０万
の親水性シリカゲル（ＴＳＫｇｅｌ　　Ｇ３０００ＳＷ
ＸＬ商品名　　東ソー株式会社製）を用いて分離し、励
起波長４８８ｎｍ，蛍光波長５２５ｎｍにて蛍光検出し
た結果、ＦＩＴＣ−ＩＬ−６の溶出箇所にはピークは認
められず、得られたＦＩＴＣ−ＩＬ−６は、すべてａｎ
ｔｉ−ＩＬ−６とバインディング活性を示した。 （実施例２）タンパク質固定化用担体１００ｍｇ（ＴＳ
Ｋｇｅｌ　　Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰＷ商品名　　東ソー株
式会社製）と抗ヒトインターロイキン６・モノクローナ
ル抗体（ａｎｔｉ−ＩＬ−６）を１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶解したもの（６６７μｇ／ｍｌ）３ｍｌ
を室温で４時間反応させ、ａｎｔｉ−ＩＬ−６固定化担
体を調製した。この固定化ａｎｔｉ−ＩＬ−６をミニカ
ラム（１０×６ｍｍＩＤ）に充填し，１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトインターロイキン６
（２８０μｇ／ｍｌ）を室温にて１時間送液（１ｍｌ／
ｍｉｎ）した後、カラム内の遊離しているインターロイ
キン６を洗浄した。

【００１５】次にカラム内で生成した免疫複合体に対し
て１０倍当量の４−フルオロ−７−ニトロベンゾ−２−
オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）を、０．５
ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウム，１％
アセトンを含む４０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に
溶解したものを５５℃にて１時間送液（１ｍｌ／ｍｉｎ
）し、カラム内の遊離しているＮＢＤ−Ｆを洗浄した。 さらに１０％アセトニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝
液，０．１Ｍ硫酸ナトリウム，ｐＨ６．８にて３０分間
洗浄し、免疫複合体と疎水的あるいはイオン的に吸着し
たＮＢＤ−Ｆを除去した。最後に６００μｌの０．１Ｍ
クエン酸・塩酸混合液、ｐＨ１．５を注入して免疫複合
体を解離させＮＢＤ修飾されたＩＬ−６（ＮＢＤ−ＩＬ
−６）を得た。

【００１６】抗体との結合能を確認する意味で、得られ
たＮＢＤ−ＩＬ−６と過剰のａｎｔｉ−ＩＬ−６を混合
し３０分間静置させた試料を排除限界分子量５０万の親
水性シリカゲル（ＴＳＫｇｅｌ　　Ｇ３０００ＳＷＸＬ
商品名　　東ソー株式会社製）を用いて分離し、励起波
長４８０ｎｍ，蛍光波長５３０ｎｍにて蛍光検出した結
果、ＮＢＤ−ＩＬ−６の溶出箇所にはピークは認められ
ず、得られたＮＢＤ−ＩＬ−６は、すべてａｎｔｉ−Ｉ
Ｌ−６とバインディング活性を示した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】可逆的に相互に結合し得る少なくとも２種
   類の物質のうち、少なくとも１種類の物質を修飾する方
   法において、その少なくとも２種類の物質同士が結合し
   た複合体に修飾を施した後、修飾された複合体を解離さ
   せることにより、少なくとも１種類の物質の修飾体を得
   ることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】少なくとも２種類の物質のうち、一方が担
   体に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】少なくとも２種類の物質のうち、一方が担
   体に固定化されている固定化物質を、カラムに充填して
   用いることを特徴とする請求項２に記載の方法。