JPH04325099A - 核酸の膜への固定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は核酸の、核酸のハイブリ
ダイゼーション等に使用するポリアミド系合成樹脂膜等
の膜への固定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、核酸はいわゆるコロニーハイブリ
ダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、サザ
ンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼー
ションなどの手法により他の核酸の塩基配列との相同性
が調べられている。これらの手法においては、先ず調べ
られる検体の核酸をニトロセルロース、ナイロン等のポ
リアミド系合成樹脂あるいはポリフッ化ビニリデンから
なる膜などに固定し、これらの膜に固定された核酸に対
してプローブと呼ばれる核酸が水素結合するか否か、す
なわちハイブリダイズするか否かによって、プローブと
同じ配列あるいは相補的な配列の有無を調べている。

【０００３】これらの方法に於いては検査対象である遺
伝子等の核酸を所定量得て、それらを膜に固定し、そう
した上でプローブをその膜に固定された核酸にハイブリ
ダイズさせることが一般的には行われている。

【０００４】しかしこの手順で検査を行う場合には、検
査の都度あるいは検査対象毎に、対象とする核酸を膜に
固定することが必要であり、操作が煩雑である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】一方、プローブを膜に
予め固定しておけば、検査の度に核酸を膜に固定する操
作を省くことができ、検査者はハイブリダイゼーション
の操作のみを行えば良くなるので、上記煩雑さは解消さ
れる。

【０００６】しかしこの方法は、通常プローブとして使
用される核酸が短鎖であるために、従来行われている加
熱処理あるいは紫外線照射処理による方法では膜などに
固定しにくいので、実現が困難であった。改良法として
、ハイブリダイズ反応に関わらない塩基配列をプローブ
に結合させることにより鎖長を長くし、膜に吸着しやす
くする方法が採られている。しかしこのような方法にお
いては酵素反応、あるいは化学合成法による核酸の伸長
反応が用いられるため、操作的にも、時間的にも、経費
的にも必ずしも最上の方法とは言い難い。

【０００７】また、加熱処理などによる固定方法では固
定が不完全であり、１０００塩基長程度の長い鎖長の核
酸であっても高々３０ないし４０％程度の核酸が固定さ
れるに過ぎず、さらに短い核酸にあっては殆ど固定され
ない。

【０００８】本発明は、このような従来法の欠点を解消
するために、鎖長の長い核酸のみならず鎖長の短い核酸
であっても膜に効率よく固定する方法を提供し、簡単な
操作によるハイブリダイゼーションを可能にするもので
ある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、膜を構成する物質
の官能基と核酸を脱水縮合試剤により処理することによ
り、核酸を膜に化学結合させる方法を見いだし、本発明
に到達した。

【００１０】すなわち本発明は、核酸を膜に固定する方
法であって核酸と脱水縮合剤を共存させ、脱水縮合反応
により核酸を膜に結合させることを特徴とする核酸の膜
への固定法およびこの方法により核酸を固定した膜に関
するものである。

【００１１】以下、本発明について詳細に説明する。 １．使用する膜の種類 本発明において使用される膜としては、脱水縮合剤によ
り脱水縮合が可能な官能基を有する膜が挙げられる。例
えばセルロース、ポリアミド系合成樹脂を成分として含
む膜が好んで用いられる。

【００１２】上記膜は、フィルム状でも使用できるが、
フィルター状のものが好ましく、例えば、市販のハイブ
リダイゼーション用ナイロンメンブレンを使用すること
ができる。例えば、Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅ膜（ＢＲＬ社製
）、Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を挙
げることができる。 ２．脱水縮合用試剤 核酸を膜に固定する操作においては、この核酸が溶液状
態であることが好ましく、脱水縮合用試剤としては核酸
が溶解し易い環境下、即ち水溶液中での反応に耐える試
剤を使用することが望ましい。従って、一般に好んで用
いられる脱水縮合剤であるジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（以下、ＤＣＣと記す。）は水中での分解が起こる
ため、水中での脱水反応が可能である水溶性の試剤の使
用が好適である。

【００１３】このような条件を満たす水溶性の脱水縮合
剤として、次式で表される化合物、この誘導体、又はこ
れらのＲＸ付加物（ＲはＨ、又はＣ１〜Ｃ１０のアルキ
ル基、Ｘはハロゲン原子）を挙げることができる。

【００１４】 　　上式においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３はＣ１〜Ｃ１０のア
ルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、ブチル基等を挙げることができる。また、ｎは１〜
６の整数であり、２〜５が好ましい。

【００１５】上式で表される好ましい脱水縮合剤として
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（以下、ＥＤＣという）、１−エチル−３−
（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドを例示
することができ、さらにこれらの塩酸塩、ヨウ化メチル
付加物あるいはヨウ化エチル付加物等を挙げることがで
きる。

【００１６】本発明により核酸を膜に固定する際に、脱
水縮合剤は核酸に対して０．０１以上、１００以下のモ
ル比の範囲で使用される。反応は温度０℃〜１２０℃の
範囲で、時間は１分〜２４時間の範囲で行われる。

【００１７】また後述するようなリンカー（ＤＮＡと膜
との結合の介在部分をいう。）を使用することもできる
。

【００１８】但し、ＤＣＣもその使用方法によっては本
発明において使用することが可能である。例えば、ＤＣ
Ｃが溶解する有機溶媒中で、膜とリンカーとの共存下、
ＤＣＣを反応させて膜にリンカーを結合させる。次いで
核酸水溶液に上記反応物を加え、水溶性脱水縮合剤を添
加して反応を進めることによって核酸を膜に固定するこ
とができる。

【００１９】３．リンカー リンカーは、膜への核酸の固定に必須の要件ではないが
、使用することにより核酸の固定量を増すことが出来る
。

【００２０】リンカーとしては、脱水縮合反応が可能な
試剤であれば使用が可能であり、官能基として、メルカ
プト基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、
スルホン酸基などを有する化合物を挙げることができる
。

【００２１】これらの官能基の中ではメルカプト基、ヒ
ドロキシル基が好んで用いられる。これらの官能基を有
する化合物としては、例えば下記の化合物を挙げること
ができる。

【００２２】メルカプト基を有する化合物として、メル
カプトエタノール、ジメルカプトエタノール、ジチオス
レイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトこはく
酸、ジメルカプトこはく酸、メルカプト酢酸、１，１０
−ジメルカプトデカン、２，３−ジメルカプト−１−プ
ロパノール、１，２−ジメルカプトエタン、２，５−ジ
メルカプト−１，３，４−チアジアゾールを、スルホン
酸基を有する化合物として、ベンゼンジスルホン酸、Ｐ
−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、Ｐ−オキシカルボニ
ルベンゼンスルホン酸を、アミノ基あるいはポリアミノ
基を有する化合物として、ロイシン、グリシンなどのア
ミノ酸あるいはエチレンジアミンを、カルボキシル基を
有する化合物として、こはく酸、フタル酸、オキシカル
ボン酸、グリコールカルボン酸、Ｐ−ヒドロキシ安息香
酸、チオ酢酸を、水酸基とメルカプト基、あるいはアミ
ノ基、あるいは燐酸基を有する化合物として、上記のメ
ルカプト化合物に加えて、２−メルカプトフェノール、
アミノアルコール、Ｐ−ヒドロキシフェニル燐酸を、ヒ
ドロキシル基を有する化合物としてはエチレングリコー
ル、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、
レゾルシン、ハイドロキノン、α−ヒドロキシメチル−
Ｐ−クレゾール等の多価アルコールを挙げることができ
る。

【００２３】これらの化合物の使用量は、固定しようと
する核酸の量、あるいは脱水縮合剤の量によって変える
ことができるが、必ずしも全ての核酸分子がリンカーを
介して固定される必要はなく、また、核酸１分子が複数
箇所で固定される場合もあることから、核酸、脱水縮合
剤の各々の量に対して、０．０１ないし１００のモル比
の範囲内で使用される。好ましくは０．０１ないし１０
のモル比、より好ましくは１ないし５のモル比で使用さ
れる。 ４．使用する溶媒 上述したように、核酸を膜に固定する操作においては、
この核酸が溶液であることが好ましく、核酸が溶解し易
い溶媒即ち水を上記処理に使用するのが好ましいが、リ
ンカーの溶解度を高めることを目的として他の溶媒を併
せて使用することもできる。

【００２４】これらの溶媒としては、メタノール、エタ
ノールなどのアルコール類、トリエチルアミンなどのア
ミン類、酢酸などのカルボン酸類を挙げることができる
。これらの溶媒は使用する膜を変性させない範囲の種類
及び濃度で使用することができる。

【００２５】固定操作においては、溶液に浸しておくな
ど膜を湿った状態に保っておいても、あるいは乾燥した
状態においても、核酸を固定することができる。 ５．固定化処理の方法 上記試剤等を使用して核酸を膜に固定する方法を説明す
る。

【００２６】先ず、核酸など反応試剤を膜に付着させる
。本発明に使用する核酸としては、ＤＮＡ（デオキシリ
ボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）のいずれも使用すること
が可能であり、核酸の種類による制限はない。

【００２７】固定する上では、鎖長による制限は無く、
１塩基長から使用することが可能であるが、ハイブリダ
イゼーションに使用することを前提とするのであれば数
塩基から数千塩基長までの長さの核酸が使用されること
が望ましい。

【００２８】核酸を膜に付着させる方法としては、連続
した微細気孔を有する多孔質の膜を使用し、膜の反対側
から吸引しながら核酸溶液を滴下する方法が一般的であ
るが、この方法では核酸が短鎖長の場合には核酸が膜に
付着されずに膜を通過してしまうことがあり、所定量を
膜に付着させるには必ずしも好適な方法とは言えない。

【００２９】したがって抜け出ないように調整しながら
核酸溶液を滴下し、無駄の無いようにする方法が本方法
では望ましい。具体的にはピペット様器具を使用し、核
酸溶液１μｌ程度の極少量を膜に滴下しスポットを形成
し、そのスポットが乾燥してから再度核酸溶液を極少量
滴下する操作が好ましい。

【００３０】核酸などの反応試剤を膜に付着させる際に
は、核酸、脱水縮合剤および必要であればリンカーの溶
液を別々に膜に付着させる方法、またこれらの内２種を
混合し付着させた後残りの１種の溶液を付着させる方法
、さらに３種をすべて混合した後付着させる方法のいず
れの方法も採用できる。これらの方法の中では、先ず膜
に核酸溶液あるいは核酸とリンカーの溶液を膜に付着さ
せ、しかる後に脱水縮合剤溶液を付着させる方法が好ま
しい。

【００３１】このようにして反応試剤を付着させると、
大気中、室温においても縮合反応は進行するが、好まし
くは２０℃ないし１００℃、より好ましくは２０℃ない
し８０℃の温度範囲において固定される。この際に、使
用する膜が熱により変性するのを防止するためには高温
度範囲よりも室温付近を使用するのがより好ましい。

【００３２】従来の固定方法においては、核酸を膜に付
着させた後に、核酸を膜に固定するために加熱処理ある
いは紫外線処理が必要である。本発明においては脱水縮
合剤を使用し、室温においても進行する縮合反応によっ
て核酸を膜に固定するので、敢えて加熱処理あるいは紫
外線照射を必要としないが、これらの方法を併用するこ
とにより固定量を増加させ、より確実に固定することが
可能な場合もある。

【００３３】例えば、加熱処理あるいは紫外線照射処理
しながら脱水縮合剤による処理を行う方法、予め膜に核
酸を付着させ加熱処理、紫外線照射処理を行った後に脱
水縮合剤による処理を行う方法、脱水縮合剤処理を行っ
た後に、加熱処理あるいは紫外線照射処理を行う方法を
とることができる。

【００３４】核酸を固定した膜をハイブリダイゼーショ
ンに使用する場合であって、膜に固定する核酸が２本鎖
であるときは、核酸を変性処理しておいてから膜に吸着
させることも可能であり、吸着させてから縮合反応を行
う前に変性させてもよい。

【００３５】核酸を膜に固定した後に、膜をＴｒｉｓ（
トリスヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、ＳＳＣ
緩衝液（コハク酸９０ｍＭ、塩化ナトリウム０．９Ｍ　
　ｐＨ７．０）など適当な緩衝液で洗浄することにより
、残存する脱水縮合剤、リンカーなどを膜から取り除く
ことが可能であるので、固定後に、膜に別の核酸を作用
させてもさらに固定されることはない。 ６．本発明の方法により核酸を固定した膜の使用法（ハ
イブリダイゼーション）前述したように、固定処理後に
膜を洗浄することが可能であるので、固定した核酸以外
の核酸の非特異的な結合を排除する必要のある操作、例
えばハイブリダイゼーションの操作などに、本発明によ
り核酸を固定した膜を使用することができる。

【００３６】従来の焼付けや紫外線照射による固定では
、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）等ハイブリダイゼ
ーションに使用する試薬により、膜からの剥離が起こり
易く、使用困難であったしかし、本発明による固定法を
用いることにより、このような剥離は起こり難くなり、
より確実にハイブリダイゼーション操作を行うことが出
来る。

【００３７】このハイブリダイゼーションの操作は、一
般に行われる操作であって、例えば、Ｔ．　　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓらの方法（Ｔ．　　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２
）　　３８７頁〜３８９頁）に従い、検査しようとする
核酸の塩基長によりハイブリダイゼーションの温度ある
いは使用する緩衝液の塩の濃度を適宜変えて行う。

【００３８】また、ＴＭＡＣ溶液（５０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３Ｍテトラメチルアンモニ
ウムクロライド）、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ、５倍濃度のデ
ンハルト液（１倍濃度は、０．０２Ｗ／Ｖ％フィコール
、０．０２Ｗ／Ｖ％ポリビニルピロリドン、　０．０２
Ｗ／Ｖ％ウシ血清アルブミンを含む水溶液）、０．１％
ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｇ／ｍｌ
変性ＤＮＡの各成分を含む水溶液中において適宜温度を
変えて行われる。

【００３９】本発明の方法によれば、従来一般に行われ
ているように検査の検体となる核酸を膜に固定し、プロ
ーブ核酸をハイブリダイズさせることに加えて、逆にプ
ローブ核酸を膜に固定し、検体となる核酸をハイブリダ
イズさせることも可能となる。

【００４０】また、本発明の方法により核酸を固定した
膜、特にプローブを予め固定した膜を用意しておくこと
により簡便なハイブリダイゼーションの操作が可能にな
る。

【００４１】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。

【００４２】

【実施例１】１μｌのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（デオキシシ
チジン三リン酸）（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅ　　Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製　　１５ＴＢｑ／
ｍｍｏｌ、３７０ＭＢｑ／ｍｌ、購入後約１月の時点で
使用）溶液を１００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）１００μｌに溶解し、こ
の溶液の０．７５μｌを０．６４ｃｍ２のナイロン膜（
ＢＲＬ社製　　ＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜）に滴下した（ス
ポット：直径５ｍｍの円形）。

【００４３】次に同所に更に塩酸１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの２０重量
％水溶液（以下、塩酸ＥＤＣ水溶液という。）を１．５
μ１滴下した。このようにして得た膜を６０℃で２．５
時間加熱処理した。

【００４４】加熱処理終了後、この膜を６倍濃度のＳＳ
Ｃ溶液５ｍｌに浸し、溶液を交換することによる膜の洗
浄を室温下で浸透しつつ５分間づつ３回行った。

【００４５】洗浄前と洗浄後の膜上の放射活性をサーベ
イメータ（アロカ社製、β（γ）サーベイメータ、ＴＧ
Ｓ−１３６型）により測定した。その結果、洗浄前は４
０００ｃｐｍ、洗浄後は５０ｃｐｍであった。この値か
らバックグラウンド値５０ｃｐｍを差し引くと、放射活
性は５％残存していることが明かとなった。

【００４６】

【実施例２】実施例１において塩酸ＥＤＣ水溶液を加え
た後、同所にさらに２−メルカプトエタノールの２体積
％水溶液を１．５μ１滴下した以外は、実施例１と同様
に処理し、同様に残存放射活性を調べた。

【００４７】その結果１０％の放射活性が残存していた
。

【００４８】

【実施例３】実施例１において塩酸ＥＤＣ水溶液を加え
た後、１８ｍｇ／ｍｌのジチオスレイトール水溶液を更
に１．５μ１滴下した以外は、実施例１と同様に処理し
、同様に残存放射活性を調べた。その結果１０％の放射
活性が残存していた。

【００４９】

【実施例４】実施例１において塩酸ＥＤＣ水溶液を加え
た後、２４ｍｇ／ｍｌこはく酸水溶液を更に１．５μ１
滴下した以外は、実施例１と同様に処理し、同様に残存
放射活性を調べた。その結果６％の放射活性が残存して
いた。

【００５０】

【比較例１】実施例１において塩酸ＥＤＣ水溶液を滴下
しない以外は、実施例１と同様に処理し、同様に残存放
射活性を調べた。その結果０．０１％の放射活性が残存
していた。

【００５１】

【実施例５】膜としてＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜を使用する
代わりにＨｙｂｏｎｄ　　Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製
、ナイロン製）を使用した以外は実施例１と同様に処理
し、膜上の放射活性を調べた。

【００５２】その結果、残存放射活性は５％であった。

【００５３】

【実施例６】膜としてＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜を使用する
代わりにＨｙｂｏｎｄ　　Ｎ膜を使用した以外は実施例
２と同様に処理し、膜上の放射活性を調べた。

【００５４】その結果、残存放射活性は５％であった。

【００５５】

【実施例７】膜としてＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜を使用する
代わりにＨｙｂｏｎｄ　　Ｎ膜を使用した以外は実施例
３と同様に処理し、膜上の放射活性を調べた。

【００５６】その結果、残存放射活性は５％であった。

【００５７】

【比較例２】実施例５において塩酸ＥＤＣ水溶液を滴下
しない以外は、実施例５と同様に処理し、同様に放射活
性を調べた。その結果０．０１％が残存していた。

【００５８】以上の結果から、脱水縮合剤の使用により
、１塩基長（ヌクレオチド）であっても膜に結合される
ことがわかった。また、リンカーとしてメルカプト基を
有する化合物を使用すると結合率が増大することがわか
った。

【００５９】

【実施例８】膜としてＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜を使用する
代わりに、セルロース膜（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製濾紙、
Ｎｏ．５Ａ）を使用し、加熱処理の代わりに温度１８℃
で、２時間放置した以外は実施例１と同様に処理し、膜
上の放射活性を調べた。

【００６０】その結果、７％が残存していた。

【００６１】

【比較例３】実施例８において塩酸ＥＤＣ水溶液を滴下
しない以外は、実施例８と同様に処理し、同様に放射活
性を調べた。その結果０．０１％が残存していた。

【００６２】以上の結果から、膜の素材としてセルロー
スを使用した場合でもナイロンと同様に核酸を固定でき
ることがわかった。また室温においても固定できること
がわかった。

【００６３】

【実施例９】ＤＣＣを２５０ｍｇ溶解したジクロロメタ
ン溶液１ｍｌに０．６４ｃｍ２のＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜
を完全に浸し、さらにメルカプトエタノールを１００μ
１添加して、室温下で攪拌しつつ１５時間処理した。反
応溶液からＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜を取り出し、ジクロロ
メタンおよびテトラヒドロフラン各々２ｍｌを用いて洗
浄して、風乾した。この膜を実施例１のＰｈｏｔｏＧｅ
ｎｅ膜の代わりに用いた以外は実施例１と同様に処理し
、膜上の放射活性を調べた。

【００６４】その結果５％が残存していた。

【００６５】

【実施例１０】実施例９においてメルカプトエタノール
の代わりに１１０ｍｇ／ｍｌのジチオスレイトールを使
用した以外は実施例９と同様に処理し、６×ＳＳＣ溶液
による洗浄前後の放射活性を調べた結果５％が残存して
いた。

【００６６】

【比較例４】実施例９においてＤＣＣおよびメルカプト
エタノールによる処理を行わなかった以外は実施例９と
同様に処理し、６×ＳＳＣ溶液による洗浄前後の放射活
性を調べた結果０．０１％が残存していた。

【００６７】

【実施例１１】実施例９においてＰｈｏｔｏＧｅｎｅ膜
を使用する代わりにＨｙｂｏｎｄ　　Ｎ膜を使用した以
外は実施例９と同様に処理し、６×ＳＳＣ溶液による洗
浄前後の放射活性を調べた結果５％が残存していた。

【００６８】

【実施例１２】実施例１０においてＰｈｏｔｏＧｅｎｅ
膜を使用する代わりにＨｙｂｏｎｄＮ膜を使用した以外
は実施例９と同様に処理し、６×ＳＳＣ溶液による洗浄
前後の放射活性を調べた結果５％が残存していた。

【００６９】

【比較例５】実施例１１においてＤＣＣおよびメルカプ
トエタノールによる処理を行わなかった以外は実施例１
１と同様に処理し、６×ＳＳＣ溶液による洗浄前後の放
射活性を調べた結果０．０１％が残存していた。

【００７０】以上の結果から、有機溶媒とリンカーを使
用すればＤＣＣも縮合剤として使用可能であることがわ
かった。

【００７１】

【実施例１３】実施例１において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりにα３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１２〜１８を１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解
した液を使用し、加熱処理の代わりに１８℃で２時間放
置した以外は実施例１と同様に処理した。ｄ（Ｔ）１２
〜１８の５’側ＯＨの３２Ｐラベルは、ｄ（Ｔ）１２〜
１８を１μｇ、酵素にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
宝酒造製品）を、ラベル化剤にγ−ＡＴＰ（ＮＥＮ　　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いて
Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（前掲書３９６頁〜３
９７頁）に従い、行った。

【００７２】洗浄前後の放射活性を調べた結果、６０％
が残存していた。

【００７３】

【実施例１４】実施例２において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりにα３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１２〜１８を１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解
した液を使用し、加熱処理の代わりに１８℃で２時間放
置した以外は実施例２と同様に処理した。洗浄前後の放
射活性を調べた結果、２０％が残存していた。

【００７４】

【実施例１５】実施例３において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりにα３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１２〜１８を１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解
した液を使用し、加熱処理の代わりに１８℃で２時間放
置した以外は実施例３と同様に処理した。洗浄前後の放
射活性を調べた結果、７４％が残存していた。

【００７５】

【比較例６】実施例１３において、塩酸ＥＤＣ水溶液を
使用しなかった以外は実施例１３と同様に処理した。洗
浄前後の放射活性を調べた結果、２％が残存していた。

【００７６】以上の結果から、本発明に係る方法により
効率よくオリゴヌクレオチドを膜に固定することができ
ることがわかった。

【００７７】

【実施例１６】実施例１において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりに３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１０００を１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解した
液を使用し、加熱処理の代わりに１８℃で２時間放置し
た以外は実施例１と同様に処理した。

【００７８】なお、３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１０００は、先ず
ｄ（Ｔ）１２〜１８を原料に、酵素にターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてｄＴＴＰ
を反応させてｄ（Ｔ）１０００とし、さらに実施例１３
と同様の方法で５’側ＯＨを３２Ｐラベルして得た。

【００７９】また、ｄ（Ｔ）１２〜１８のＴテーリング
は、下記の条件で行った。ｄ（Ｔ）１２〜１８を１００
ｐｍｏｌ使用し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、２
−メルカプトエタノール、カコジル酸ナトリウム、牛血
清アルブミン、塩化コバルト、ｄＴＴＰ、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造製）
の終濃度を、各々２５ｍＭ、１ｍＭ、１００ｍＭ、０．
０２４（Ｗ／Ｖ）％、８ｍＭ、５ｍＭ、０．６ユニット
／μｌとして３７℃で３時間反応させた。反応後、フェ
ノール洗浄、クロロホルム洗浄し、エタノール沈澱して
ｄ（Ｔ）１０００を得た。

【００８０】洗浄前後の放射活性を調べた結果、７８％
が残存していた。

【００８１】

【実施例１７】実施例２において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりに３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１０００を１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解した
液を使用し、加熱処理の代わりに１８℃で２時間放置し
た以外は実施例１と同様に処理した。洗浄前後の放射活
性を調べた結果、８２％が残存していた。

【００８２】

【実施例１８】実施例３において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりに３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１０００を１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解した
液を使用し、加熱処理の代わりに１８℃で２時間放置し
た以外は実施例３と同様に処理した。洗浄前後の放射活
性を調べた結果、８５％が残存していた。

【００８３】

【比較例７】実施例１６において、塩酸ＥＤＣ水溶液を
使用しなかった以外は実施例１６と同様に処理した。洗
浄前後の放射活性を調べた結果、８５％が残存していた
。

【００８４】以上の結果から、本発明に係る方法により
、長鎖の核酸も効率よく膜に固定することが可能である
ことがわかった。

【００８５】

【実施例１９】実施例１において、α３２Ｐ−ｄＣＴＰ
の代わりに３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１２〜１８を使用し、加熱
せずに室温で２時間置いた以外は実施例１と同様に処理
した。

【００８６】このようにして得た膜を６×ＳＳＣ溶液で
洗浄後、０．５％ＳＤＳ、６×ＳＳＣ、６×デンハルト
液（フィコール、ポリビニルピロリドン、牛血清アルブ
ミン各々０．１２（Ｗ／Ｖ）％）、ニシン精子変性ＤＮ
Ａ１００μｇ／ｍｌの溶液中３７℃で３０分処理した。 その後、残存する放射活性を調べた結果、３０％が残存
していた。

【００８７】

【比較例８】実施例１９において、塩酸ＥＤＣ水溶液を
使用しない以外は実施例１９と同様に処理した。残存す
る放射活性を調べた結果、１％が残存していた。

【００８８】以上の結果から、加熱しなくても膜に核酸
を結合することが可能であり、さらにハイブリダイゼー
ションに用いる試薬による処理を行った後にも膜に固定
されていることがわかった。

【００８９】

【実施例２０】実施例１９において、３２Ｐ−ｄ（Ｔ）
１２〜１８の代わりにラジオアイソトープでラベルされ
ていないｄ（Ｔ）１２〜１８を使用した以外は実施例１
９と同様に処理してｄ（Ｔ）１２〜１８を固定した膜に
、３２Ｐ−ｄ（Ａ）１２〜１８（原料にｄ（Ａ）１２〜
１８を使用し、実施例１３と同様の方法によって得た。 ）を、３４℃で６×ＳＳＣ、６×デンハルト液、ニシン
精子変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの溶液中でハイブリダ
イズさせた。

【００９０】ハイブリダイゼーション液を除去後、さら
に６×ＳＳＣ溶液中で３６℃で５分間づつ２回洗浄した
。このようにして得た膜を、増感紙（富士写真フィルム
社製、Ｈｉ−Ｓｃｒｅｅｎ　　Ｂ−２）を併用してＸ線
フィルム（富士メディカルシステムズ　　社製、ＲＸ−
Ｈ）に−７８℃で５日間露光させたところ、ｄ（Ｔ）１
２〜１８溶液を滴下した位置に明瞭なシグナルが認めら
れ、本発明に係る方法により核酸を固定した膜を使用し
たハイブリダイゼーションが可能であることがわかった
。

【００９１】

【実施例２１】実施例１３と同様に３２Ｐ−ｄ（Ｔ）１
２〜１８を固定し、６×ＳＳＣ溶液５ｍｌで５分間づつ
室温下で３回洗浄し、放射活性を測定した。その後３２
Ｐ−ｄ（Ｔ）１２〜１８の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｍＭ
　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）２μｌ（放射活性：５０
００ｃｐｓ）をピペットを用いて滴下した。滴下後室温
で２時間放置した。

【００９２】この膜を６×ＳＳＣ溶液５ｍｌで５分間づ
つ２回洗浄し、その後さらに６×ＳＳＣ、６×デンハル
ト液、ニシン精子変性ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの溶液中
で３７℃で３０分間洗浄した。

【００９３】洗浄後の放射活性は１回目の固定、洗浄後
の放射活性と比較して増減はなかった。

【００９４】この結果から、洗浄により脱水縮合剤等を
除去した後に作用させた核酸は膜に固定されないことが
わかった。

【００９５】

【発明の効果】本発明により、短鎖長の核酸を確実に固
定することを可能とするだけでなく、一旦固定された核
酸が膜から剥離することを防止することも可能となるた
め、ハイブリダイゼーションでのデータを従来法以上に
確実に得ることができるようになる。さらに繰り返しハ
イブリダイゼーションを行うことも可能となるため、試
剤の効率的な利用、操作の簡略化を達成できる。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　核酸を膜に固定する方法であって、核
   酸と膜を脱水縮合剤を用いた脱水縮合反応によって結合
   させることを特徴とする核酸の膜への固定法。
2. 【請求項２】　　前記脱水縮合剤が水溶性の脱水縮合剤
   であることを特徴とする請求項１記載の核酸の膜への固
   定法。
3. 【請求項３】　　前記脱水縮合剤が下記式で表される化
   合物、この誘導体、又はこれらのＲＸ付加物（ＲはＨ、
   又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、Ｘはハロゲン原子）で
   あることを特徴とする請求項１または２記載の核酸の膜
   への固定法。 　　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、ｎ
   は１〜６の整数を表す。
4. 【請求項４】　　前記膜がセルロース又はポリアミド系
   合成樹脂を成分として含むことを特徴とする請求項１〜
   ３のいずれか一項に記載の核酸の膜への固定法。
5. 【請求項５】　　前記脱水縮合反応に際し、核酸と膜と
   を脱水縮合により結合し得る官能基を有する他の物質を
   共存させることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一
   項に記載の核酸の膜への固定法。
6. 【請求項６】　　前記核酸と膜とを脱水縮合により結合
   し得る官能基を有する他の物質が、メルカプト基、ヒド
   ロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基
   からなる群から選ばれたいずれか一つあるいは任意の組
   合せの官能基を有することを特徴とする請求項１〜５の
   いずれか一項に記載の核酸の膜への固定法。
7. 【請求項７】　　請求項１〜６のいずれか一項に記載の
   方法により核酸を固定した膜。