JPH0431680B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は水産業、食品産業、分析機器産業、分
析試薬産業等の分野で利用される。 従来技術 魚介類の“生き”のよさの測定に関する先駆的
研究は斉藤ら〔日本水産学会誌、24巻、749−750
（1959）〕により、また続いて内山、江平ら〔日本
水産学会誌、36巻、177−187，977−992（1970）〕
により詳細におこなわれている。 また、内山、江平らは、魚介類の鮮度簡易判定
法を発案し、特許化している〔特公昭48−30519、
昭和44年３月13日（1969）出願特許第722480号参
照〕 内山らの発明は、上記斉藤らによる、魚介類が
魚獲後死に至ると筋肉中に貯えられていたエネル
ギー貯蔵物質アデノシン３リン酸ATPは、 ATP→アデノシン２リン酸（ADP）→アデニ
ール酸（AMP）→イノシン酸（IMP）→イノシ
ン（HxR）→ヒポキサンチン（Hx）に至る一定
の分解様式に従つて分解することから、出発物質
のATP含量の多いもの程“生き”が良く、HxR
やHxの多いものほど“生き”が悪いと判断でき
るとの示唆によつたものである。なお、イカのよ
うな軟体動物では、上記分解様式中で、IMPの
代りにアデノシン（AdR）を経過する。 当時、上記したATP関連物質の定量に斉藤ら
が用いた方法はカラムクロマトグラフイーであ
り、成分の分画に２〜３日の長時間を要し、操作
も煩雑で一般的に用いることは不可能であつたこ
とから、酵素を利用して、定量時間の短縮をはか
つた点に内山らの発明の特長がみられるものであ
る。即ち、内山らは魚肉抽出液の250mμの核酸系
成分の吸光度Ａを測定し、別のフラクシヨンにヌ
クレオシドホスホリラーゼ（NP）とキサンチン
オキシダーゼ（XO）の両酵素を作用させること
により、HxRおよびHx〔(1)式の分子の成分〕を
夫々尿酸に変化させ、生成した尿酸（UA）の量
をUV計を用い293mμの吸光度から求め、さら
に、こうして得た尿酸の吸光度に換算係数を乗じ
た値Ｂを求め(3)式により、鮮度を算出する方法で
ある。 ATP分解率（％）＝Ｂ／Ａ×100 ……(3) なお、Ｂを求めるための係数は魚介類によつて
異なり、HxR蓄積性の魚介類には0.938、Hx蓄
積性のものには0.815を用いるものである。 又、抽出のさいに用いる蛋白変性剤にはUV吸
収測定を妨害しない点から、取扱い注意を要する
劇薬の過塩素酸（PCA）が特に用いられている。 (3)式における（分子）Ｂは、(1)式の分子の成分
の濃度、又Ａは(1)式の分母の成分の濃度に相当す
るものであるが、測定方法が異なつており、特に
魚種により計算法が異なるなどのため、分析操作
及び計算が煩雑であり、又吸光度Ａの中には、
ATP関連物質以外の測定対象外の成分が含まれ
る可能性もあることから定量精度上の問題点のあ
る方法と考えられるものである。 発明の目的又は発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、従来法よりさらに迅速、正
確、簡易な鮮度測定法を提供することであり、特
に酵素反応時間を大巾に短縮すること、紫外分光
光度計のような高価な測定器を用いないで安価な
分析器で実施できる経済的方法を提供すること；
魚類に関係なく一定の計算式で鮮度恒数を求め得
る方法を提供すること；紫外部吸光度の測定に影
響があつても取扱いに便利な蛋白変性剤を利用可
能にして抽出液調製を簡易化すること等である。 発明の構成又は問題点を解決するための手段 本発明は魚介類の鮮度判定恒数Ｋ値の測定にお
いて、計算式Ｋ（％）＝（HxR＋Hx）／（ATP＋
ADP＋AMP＋IMP＋HxR＋Hx）×100……(1)、
（但し式中の分子式はその物質のモル濃度をあら
わす。以下同じ。なお、イカのような軟体動物の
場合はIMPはAdRで代用される。）の分子の成分
の濃度をヌクレオシドホスホリラーゼNPとキサ
ンチンオキシダーゼXOの両酵素を被験液に作用
させて生じる溶存酸素の減少量又は過酸化水素の
生成量の電気化学的信号d₁から求め；分母の成分
の濃度を粗アルカリホスフアターゼ（粗AP），
NP，XOの３酵素の作用による電気化学的信号
d₂から求め、Ｋ値（％）＝d₁／d₂×100……(2)の計
算式によりＫ値を簡易に測定する方法を提供す
る。 又、内山法では酵素作用により生じた尿酸を測
定するに対し、本発明では酵素反応過程の酸素吸
収量から定量するものである。 本発明は(1)式の分子の部分のHxR及びHxの測
定に酵素NP及びXOを用いる点では内山法と同
じであるが、測定に光学的方法は使用せず、電気
化学センサーを用いる点で全く相違するものであ
る。 本発明に用いるセンサーにはポーラログラフ式
あるいはガルバニ電池式酸素センサー及びポーラ
ログラフ式過酸化水素H₂O₂センサー等公知のも
のが用いられる。 即ち、本発明では上記(4)式に示されるように、
HxR及びHx各１分子が酸化されて尿酸（UA）
に至る過程でそれぞれ２分子のO₂を吸収し、同
時にH₂O₂を生じることに基づいてこれらの量を
電気化学センサーでとらえることを骨子とするも
のである。センサーの出力信号は測定成分のモル
濃度の２倍に比例する電流であるため、測定成分
の標準液なしで定量することができるのみでな
く、試料液中に紫外線吸収性の物質や、色や濁り
があつても、測定に何等支障を生じない。 又、本発明に用いる装置は、小型軽量で取扱い
も容易なため、実験室以外の生産現場や野外で使
用することも可能である。 第１図は、本発明に用いる反応槽及び装置系統
図である。すなわち図中１は反応槽で、その容積
は１〜２ml程度の小さいものが酵素、試薬の節約
上有利である。２は反応槽の密栓でその中心に液
注入用の例えば直径１mm程度の細い穴３が備えら
れている。４は気密用Ｏ−リング（無くてもよ
い）、５はマグネチツクスターラーの攪拌子、６
は温度制御用ジヤケツトで外部の恒温水７を循環
させるためのものである。反応槽の形状は特に限
定はないが、反応液の混合攪拌ができて反応温度
の制御、試薬の注入に便利で、特に外界からの酸
素が反応液に溶け込まない構造であることが必須
条件である。センサー８は前記したもののうちの
任意のものが用いられる。９は増幅器である。１
０は市販の任意のmVレコーダで10mVフルスケ
ールで分単位のスピードでの記録可能なものが用
いられる。１１は電算機である。 次に、前記内山法では(1)式の分母の成分の定量
を250mμのUV吸収の測定によりおこなつたのに
対し、本発明の方法では、例えば検液に仔ウシ腸
から抽出された粗アルカリホスフアターゼ（粗
AP）をこの酵素作用に適したPH約10.5で作用さ
せた後、NP及びXOを作用させると第２〜７図
のように各成分１分子当り、２分子のO₂吸収と
H₂O₂発生をみるので、全成分をO₂又はH₂O₂の変
換量としてとらえることができる。なおアルカリ
ホスフアターゼ（AP）には高純度のものがある
が、これらはIMPをHxRに変換するのみで、
ATP，ADP，AMP，AdRには作用しないので、
本発明には用いられない。本発明に用いられる粗
アルカリフオスフアターゼとは、仔ウシ小腸から
得られる粗酵素でアルカリフホスフアターゼ、ア
デニル酸キナーゼ、AMPデアミナーゼ及びアデ
ノシンデアミナーゼを含む抽出物が好適に用いら
れる。 第８図及び９図は本発明に用いる粗AP酵素と
他のAP酵素との反応性の相異を明確に説明する
DO減少曲線である。この実験に用いた試薬、酵
素及び緩衝液は第１〜３表に示す通りである。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 即ち、第４表−１最左行に示したようにHx，
HxR，IMPの混合標準液を調製し、これを基礎
液として、AMP，ADP，ATRを順次添加した
標準液１，２，３，４について下記の操作条件で
各AP酵素についての反応性をDOの減少曲線で
検討した。 又、精製度の異なるAP酵素については第４表
−2A〜Ｄに示すような標準液を用い同様に検討
した。そのDO減少曲線を第９図に示す。 反応条件 (1) 反応温度：37℃ (2) 反応槽容積：2000μ (3) 検液量第４表−1S₁25μ S₂：50μ （AP反応、２倍希釈された液） 第４表−２ S₂100μ （AP反応させた液） (4) G.B. 180μ (5) A.P. 20μ（28U） (6) NP 2μ（シグマー）（0.22u） XO 10μ（0.04u） (7) 反応手順： 別容器に検液200μ、G.B.180μ、AP20μ
（7U）を混合し、37℃で反応させる。酵素の反応
性を調べるため、反応時間を30分としたが、AP
予 備反応は数分間で充分である。 空気飽和したP.B.を充填した反応槽（第１図
１）に密栓２をする。密栓の細穴３に入つた液は
水封効果つまり外気からのO₂の侵入を防ぐ役割
を果たす。この細穴より検液S₁25μをマイクロ
シリンジで注入した後、XO，NP混合酵素液
（XO：NP＝５：１）12μを注入すると、ただ
ちにDOの減少が生起し、レコーダー上にHxR＋
Hxに由来するDO減少曲線が記録される。この
減少幅d₁を測定する記録紙を見てDO減少の停止
を確認したら、AP予備反応させた検液S₂50μ
を注入し、ATP＋ADP＋AMP＋IMP＋HxR＋
Hxに由来するDO減少曲線を得、減少幅d₂を測定
する。（第８図参照。なお、イカのような軟体動
物では、この式中のIMPがAdRで置換される。）
この２度目の反応においては、反応液のPHが中性
付近にコントロールされているため、検液S₂に含
まれるAPの作用は阻害され、XO，NPのみが作
用するのである。 第４表−２に示すＡ〜Ｄの標準液にはHxR，
Hxが含まれないので、上記と同様にAP予備反応
に行つた検液S100μを反応槽に注入した後、
XO，NP混合酵素液12μを注入してDO減少d₂
を測定する（第９図参照）。 空気飽和したP.B.を満たした反応槽に0.5Mの
Na₂SO₃溶液に微量の塩化コバルトを添加したも
の100μを注入し、DO飽和からDOゼロになる
減少曲線を得て、減少幅d₀を求める。この長さが
37℃におけるO₂飽和量0.214μmo／mlに対応す
る。 (8) 計算 d₁，d₂から下記(5)式により濃度を求めた結果を
前記第４表に示す。 Ｃ＝ｄ・Co₂・Ｖ／do・２・V_s ……(5) 但し(5)式において、 Ｃ：定量成分の濃度（μmo／ml） ｄ：定量成分についてのDO減少幅（cm） do：空気飽和水についてのDO減少幅（cm） Co₂：空気飽和水の酸素濃度（μmo／ml）37
℃では0.214（μmo／ml） ２：酸素当量数（第２〜７図の関係より） Ｖ：反応槽の容積（μ） Vs：被検液（S₁，S₂）の容積（μ） 第４表から分るように、粗AP（ベーリンガー
APGradeロツト番号1272123）を用いた場合の
み成分全濃度にレスポンスした信号が得られる。
他のAP酵素液ではAMP，ADP，ATPにレスポ
ンスする信号は得られない。念のためロツトの異
なる粗AP（ロツト番号1231123）について検討し
たところ、前のものと全く同じ反応性が再現され
ており、この粗酵素剤の持つ基本的特性と判断さ
れる。 なお、精製したAP（ベーリンガーAPGrade
）の蛋白１mg当りのAP活性が2500I.U.である
のに対し、粗APのそれは前者の5.6％に当る140I.
U.に過ぎない。このことから、粗APの蛋白中に
はAP以外の酵素蛋白質等が大量に残存している
といえる。その酵素群の中にATP→ADP→
AMP→IMPのターンオーバーに関与するアデニ
ル酸キナーゼ（ミオキナーゼ）、AMPおよび
AdRデアミナーゼ等が充分量存在するため初め
て本発明の作用効果がえられるものと推定され
る。 なお、ATP，ADP，AMPに対し、ミオキナ
ーゼやアピラーゼ等の脱リン酵素とデアミナーゼ
を併用する方法によつても上記した効果を生じ得
るものであるが、本発明の方法は３酵素剤のみで
全成分を電気化学的に検知・定量できる利点を有
するものである。 さらに、DO減少曲線から分るように、本発明
の方法では、約３分程度のごく短時間で検出する
ことができるものであり、(1)式で示されるＫ値を
求めるだけの目的の際は、記録紙上で測定した
DO減少スパン（cm）を濃度単位に換算する必要
がないので、Ｋ値の計算も従来の光学密度による
方法に比較して簡易、迅速に行うことができる。 第５表は本法の測定値の変動係数C.V.を検討
した例である。ここで用いた検液はATP，
AMP，IMP，HxR各1mM，Hx0.5mM、全濃度
4.5mMの標準液で前記の方法に従い、S₁＝10μ
S₂＝20μとして測定したものである。第５表
より本法はＫ値の実用目的に十分答え得る精度を
有するものであるといえる。

【表】 なお、d₀＝16.81であり、濃度を求めると、
HxR＋Hxが1.37μmo／ml（理論値1.50）、全濃
度4.61μmo／ml（理論値4.50）となつた。 本法では測定成分を試料から抽出する際の蛋白
変性剤として、従来用いられたPCAの外に、実
施例で示すようにTCA（トリクロル酢酸）を用い
ることができる。TCAはUV吸収性のため、従来
の光学的測定原理の方法では使用できなかつたの
であるが、PCAに比較して取扱い上の安全性が
高いこと、中和剤のKOHも少量で済むことの外
に、中和に伴う沈殿の生成がない（PCAの場合
大量の沈殿が生成するので過が必要）ため検液
の調製操作の省力化とスピードアツプを図れる利
点がある。 なお、抽出残渣の分離は遠心分離機でおこなえ
るが、粗目の紙での自然過で充分である。
又、フイルター付注射器で採液すれば過を省略
することができる。 本発明法の実施中、DOの減少曲線の再上昇
（H₂O₂曲線の再降下）に遭遇し、これによつて
d₁，d₂の測定精度が低下することがある。この原
因は使用する酵素や検体中にH₂O₂を分解するカ
タラーゼが存在するためであり、若干の影響は外
挿法で補正することも可能であるが、望ましくは
カタラーゼ作用を阻害することであり、その方法
としては反応液中にアジ化ナトリウムN_aN₃を
1μmo／ml程度添加することが有効である。第
１０図にその例を示す。カタラーゼによる測定妨
害がおこつたので(a)アジ化ナトリウムを添加して
再測定したところ、カタラーゼによるDO増加は
なくなつた(b)。 実施例１：イカのＫ値測定 試料：佐渡両津港土産物店にて急速冷凍品を購入
し、これを断熱容器に氷詰にして新幹線で東京
に持ち帰つたもの。 保存条件：冷蔵庫（４℃） 試料調製：皮をむいたイカの胴10ｇを細かく切つ
て10％濃度のTCA10〜15mlを加え乳鉢ですり
つぶして過し、液に10NのKOHを加えブ
ロムチモールブルーを指示薬に用いて中和し、
これを純水で25mlにメスアツプしたものを試料
として用いる。 分析操作：前述の方法に従つて測定を行つた。試
料S₁50μを反応槽に注入し、XO，NP混合酵
素液を注入してDO減少d₁を得た後、AP予備反
応させた試料S₂100μを注入してDO減少d₂を
得る。d₁／d₂×100よりＫ値が求められる。 結果：従来イカのＫ値測定はIMPの生成がなく、
AdRが生成するため、正確な測定が困難であ
つたが、本発明法によれば何の困難もなくＫ値
を求めることができる。またその再現性もよ
く、第６表に示すように経日的な鮮度低下をＫ
値の上昇（44→60％）によりとらえることがで
きた。その理由は本発明の用いる粗AP中に
AdRデアミナーゼ（ADA）が混在するものと
推定され、そのためAdRがHxRに変化するた
めと判断される。

【表】 実施例２：即殺コイのＫ値測定 試料：オリエンタル酵母工業（株）生物科学研究
所生物（水産専門）研究質、実験池より釣り上
げ、同研究所で即殺したもの。これを冷蔵庫保
存し、経時的に肉を切り取つて試料とした。 試料調製：PCA抽出のものとTCA抽出のものを
実施例１に準じて調製した。中和の指示薬には
メチルオレンジを用いた。 分析操作：実施例１に準じて試料S₁50μ、AP
処理した試料100μを注入して行つた。 結果：第１１図に示したように、３尾中最も大き
いコイの即殺直後のものは、NP，XOの添加
で全くDO減少がみられず、HxR，Hx不含と
いう極めて高い鮮度（即ちＫ値＝０）を示し
た。経時的なＫ値の変化が速いようにみられた
が、魚獲直後の魚体の冷却が不十分なことと、
試料採取のために冷蔵庫より出し入れしたこと
によるかと思われる。

【表】 なお上記の測定はH₂O₂センサーを用いても同
様に実施できるものである。 なお、特許請求の範囲に記載した(2)式における
d₁（HxR＋Hx）の値を求めるための酵素の用法
としては、実施例１のように、予め調製した、
XOとNPの混合酵素液を添加する方法が最も簡
便である。 しかし、第１０図や、第１１図に例示したよう
に、先ずXOを添加してヒポキサンチン（Hx）
に由来する信号（d_Hx）を求め、次にNPを添加し
て、イノシン（HxR）に由来する信号（d_HxR）を
求め、その加算値から(6)式のようにしてd₁を求
め、更に(7)及び(8)式を求めることもできる。 d₁＝d_Hx＋d_HxR ……(6) R_Hx（％）＝d_Hx×100／d₂ ……(7) R_HxR（％）＝d_HxＲ×100／d₂ ……(8) こうして得られるR_HxとR_HxRの大きさの傾向は
魚介類の種類により異なるものであり、R_Hx＞
R_HxRの傾向にあればヒポキサンチン蓄積性の魚
種、（マグロがその代表魚と云われている）、又
R_HxR＞R_Hxの傾向にあればイノシン蓄積性の魚種
として分類されるものである。なお、実施例２の
コイは、第１１図からイノシン蓄積性の魚種と判
断することができる。 以上のように、本発明によれば、Ｋ値が容易に
求められるばかりでなく、測定対象魚のATP分
解生成物の蓄積成分の比較により、魚種の要素も
配慮した一層高次元の鮮度の判断をおこなうこと
ができる。 なお、上記のようなXO，NPの逐次添加法を
用いる時の検出時間の増加は約1minに過ぎない
ので、必要に応じて容易に実施できる。 なお、d₂の値を求める反応操作は、検液を２分
しd₁測定用反応槽と別の反応槽で併行しておこな
うこともできる。 これに対し実施例のような反応手順を用いれ
ば、d₁の測定用に添加されたNP，XOが、酵素
活性を失うことなく反応槽中に残存するため、次
の（AP予備反応をさせた）検液S₂における反応
に再利用されて、NP，XOの一検体当りの使用
量を半減する経済効果を生じる。又、本発明にお
いては、第１図に示したような電気化学センサー
付反応槽を用いるため、その槽の容量を小さくし
ても測定精度に影響がない。そのため単位反応容
積当りの酵素量を多くし、比較的高い酵素濃度で
迅速な反応をおこなつても、反応容量が小さいた
め酵素の使用量は少なくできる。 発明の効果 上記説明及び実施例に明らかなように、本発明
は、従来のＫ値測定においては、ATP分解物の
組成分析に数時間を要し、かつ、液体クロマトグ
ラフ分析装置や紫外分光光度計等の分析装置が必
要とされたのに対し、小型で簡便で安価なDO又
はH₂O₂測定装置を応用して数分程度の短時間迅
速分析を可能にしたものである。又、その適用範
囲はＫ値０％代の高鮮度のものや軟体動物（イ
カ、タコ）等にも及ぶもので、その応用範囲は極
めて広い。 そして、測定成分をDOセンサー又はH₂O₂セン
サーで検出可能にするための酵素類の使用量も少
なくきわめて経済的である。 また、記録されたDOの減少値の比から直ちに
鮮度恒数Ｋ値を計算できるため手計算に便利であ
るだけでなく、電算機との連動による自動演算表
示も容易である。このような利点により本発明の
鮮度測定法は特定の設備と人員を要する実験質以
外の生産・流通の現場でも実施容易なため、鮮度
測定の普及に著しい促進効果をもたらし、食品産
業の振興、食品衛生の改善、消費者保護等の目的
を十分に達成し得るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法を実施するのに適した装
置の反応槽のタテ断面図および装置系統図であ
る。第２図はATPの検量線、第３図はADPの検
量線、第４図はAMPの検量線、第５図はIMPの
検量線、第６図はHxRの検量線、第７図はHxの
検量線である。第８図は、Ecoli，Bovine，
Calf、から抽出したAP酵素の酵素活性の差を示
すDO減少曲線である。第９図はCalfから抽出し
た高純度のAP酵素と粗AP酵素の酵素活性の差を
示すDO減少曲線である。第１０図はカタラーゼ
で汚染された酵素によるDO減少曲線の補正を説
明する図である。第１１図は即殺した直後のコイ
のDO減少曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 魚介類の鮮度判定値恒数Ｋ値の測定におい
   て、計算式 Ｋ（％）＝（HxR＋Hx）／（ATP＋ADP＋AMP
   ＋IMP＋HxR＋Hx）×100 ……(1) （但し式中の分子式はその物質のモル濃度をあ
   らわす。以下同じ。イカのような軟体動物の場合
   はIMPはAdRで代用される。）の分子の成分の濃
   度をヌクレオシドホスホリラーゼNPとキサンチ
   ンオキシダーゼXOの両酵素を被験液に作用させ
   て生じる溶存酵素の減少量又は過酸化水素の生成
   量の電気化学的信号d₁から求め；分母の成分の濃
   度を仔ウシ小腸から得られる粗アルカリフオスフ
   アターゼ（粗AP）であつて、アデニル酸キナー
   ゼ、AMPデアミナーゼ及びアデノシンデアミナ
   ーゼも含む抽出物、NPおよびXOの３酵素の作
   用による電気化学的信号d₂から求め、Ｋ値（％）
   ＝d₁／d₂×100 ……(2) の計算式によりＫ値を簡易に測定する方法。 ２ 反応液にナトリウムアザイド（N_aN₃）を存
   在せしめることにより、カタラーゼ混在に由来す
   る測定誤差を防止する特許請求の範囲第１項の方
   法。