JPH04267892A - 唾液α−アミラーゼの選択的分離法および膵α−アミラーゼ検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】本発明は唾液α−アミラーゼの選択的除去
法、および膵α−アミラーゼの検定法に関する。 【０００２】ヒト膵臓はいくつかの消化酵素、例えばア
ミラーゼ、リパーゼ、およびトリプシンなどを含んでい
る。例えば急性もしくは慢性膵炎の場合のようなこの器
官の炎症は、このような酵素の血流中への放出の原因と
なり、血流中でその増大した活性が検出され得る。 【０００３】血清α−アミラーゼは、膵臓の炎症あるい
は損傷の臨床治療用の指標として最も広く使用されてい
る。これは急性膵炎が原因となり得る急性の腹痛の鑑別
診断において特に価値をもつ。 【０００４】アミラーゼは通常、分光光度計で測定でき
る産物を生成する基質を分解するその能力によって決定
される。このような検定法は、膵由来の膵臓型アミラー
ゼだけでなく、唾液腺、睾丸、卵巣、ファロピオ管、横
紋筋、肺および脂肪組織を含むいくつかの組織中に認め
られる唾液型アミラーゼをも測定する。したがって、非
膵臓疾患は総血清アミラーゼ活性の上昇をもたらし得る
。 【０００５】本発明の目的は、必要に応じて残存膵アミ
ラーゼの測定が可能になるように、唾液α−アミラーゼ
の、両α−アミラーゼアイソザイムを含有する試料から
の選択的物理的な除去を提供することである。 【０００６】この唾液および膵酵素は共に、１，４−α
−グルコシド結合の加水分解によって１，４−Ｄ−グル
コシド結合オリゴ糖および多糖を分解してマルトースお
よびマルトオリゴ糖を生成させるα−アミラーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．２．１．１．）である。現在のところ、その作
用様式、基質特異性、あるいは最終産物に基づいてこれ
らのアイソザイムを識別する効果的な方法はない。この
２つのアイソザイムの一次構造は極めて類似しているが
、例えば電気泳動、カラムクロマトグラフィー、等電点
電気泳動、および放射免疫検定法などによって分離でき
る。しかしこれらの方法は、実施するには遅くまた複雑
である。 【０００７】唾液および膵アミラーゼが、あるコムギ麦
芽レクチンによって弁別的に阻害されることが知られて
いる。レクチン濃度に気を付けて使用すれば、膵アミラ
ーゼ活性の大部分には影響を与えず、唾液アミラーゼ活
性のより大きな部分を阻害することができる。しかしこ
の方法は特異性を欠いているので、広範囲にわたっては
使用されていない。 【０００８】もう１つの既知の阻害法は、唾液アミラー
ゼを阻害するために２つの単クローン抗体を“相助作用
的に”使用する。この方法の主な制約は、このキットの
抗体を含有するバイアルが着色産物の生成に必要なα−
グルコシダーゼをも含有しているので、総アミラーゼお
よび膵アミラーゼの両者を同じキットを使用して測定す
ることができないという点である。急性膵炎の初期診断
を膵アミラーゼを利用して行い、この疾患の進行を総血
清アミラーゼの測定によって追跡することが提案されて
いる（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＦｒａｓｅｒ、Ａｎｎ　
Ｃｌｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６（４）：３３５−３４
０；１９８９）。２つの異なる試薬系を使用することは
試薬の無駄であり、また使用者にとって不要に高価であ
ると一般的には考えられる。 【０００９】膵特異的検定を行うための任意工程に加え
て、現在研究室にあるα−アミラーゼ検出法を使用し得
る方法が望まれた。 【００１０】従来の抽出検定法は強固に結合する分子、
例えば除去したい分子種に対して生じる抗体などを利用
するであろう。これらは一般に固相に結合され、時間を
消費する手作業である工程（例えばカラムクロマトグラ
フィー）を必要とするであろう。あるいは、抗体を沈殿
性の分子種、例えばプロテインＡもしくは二次抗体など
と組み合わせることもできるが、この場合、遊離溶液中
の分析しようとする分子種から不要な結合分子種を分離
するために遠心分離機を使用することが含まれるであろ
う。 【００１１】抗体を巨大粒子あるいは磁性粒子に固定化
すれば、クロマトグラフィーあるいは遠心分離を必要と
せず、緊急の検定の際に迅速に実行できる分離系になる
と考えられる。一般的に本発明は、ある系からの１つの
抗原の除去を容易にし、それゆえに有意の妨害を受けず
にもう１つの抗原を測定できるように、物理的に分離可
能な支持体もしくは分離支持体に固定化あるいは結合さ
せた単クローン抗体を使用することに関する。 【００１２】１つの態様において本発明は、物理的に分
離可能な支持体もしくは分離支持体に固定化あるいは結
合されており、唾液α−アミラーゼに対して少なくとも
１ｘ１０７　ｌ／Ｍの結合親和性、および膵α−アミラ
ーゼと１％より小さい交差反応性を示す、唾液α−アミ
ラーゼに対する単クローン抗体を使用することを特徴と
する、唾液α−アミラーゼおよび膵α−アミラーゼを含
有する試料からの唾液α−アミラーゼの選択的除去法を
提供する。 【００１３】唾液α−アミラーゼのこのような物理的除
去は、必要ならば、その後に残存膵α−アミラーゼを測
定することもできるが、もちろんそれ自体が目的になり
得る。 【００１４】この単クローン抗体が唾液α−アミラーゼ
に対して少なくとも１ｘ１０８　　ｌ／Ｍの結合親和性
と、膵α−アミラーゼと０．５％より小さい交差反応性
を示すことが好ましい。より特定的には、その単クロー
ン抗体は５／２６２（ＥＣＡＣＣ９００３１３０２）も
しくは５／３３０（ＥＣＡＣＣ　９００３１３０６）と
同定されるものである。 【００１５】一般にはこの単クローン抗体を、磁力、遠
心分離、もしくは濾過によって分離できる粒子、へら状
物質、もしくは管壁に結合させるか、あるいは膜上もし
くは分離層中に固定化する。 【００１６】別の態様において本発明は、このような単
クローン抗体を含むことを特徴とする、唾液α−アミラ
ーゼ選択的除去用のキットを提供する。本発明のこのよ
うなキットはさらに、膵α−アミラーゼを測定するため
の手段をも含んでいる。もちろんそれは一般に知られて
いる。 【００１７】さらなる態様において本発明は、上に定義
した性質を示す、また好ましくは５／２６２（ＥＣＡＣ
Ｃ　９０　０３１　３０２）もしくは５／３３０（ＥＣ
ＡＣＣ９０　０３１　３０６）と同定されることを特徴
とする、唾液α−アミラーゼに対する単クローン抗体を
提供する。それはまた本発明に従って、固定化された形
態もしくは結合された形態で、試薬もしくは“装置”と
してすら提供され得る。 【００１８】このような抗体の生産およびその適用は一
般に常套的であるが、その選択が重要である。 【００１９】例えば、唾液アミラーゼに対する適切な抗
体は迅速に結合し、それを溶液から除去するので、この
場合には溶液中に残存する膵アミラーゼを測定すること
が可能になるであろう。 【００２０】このような系に不可欠な構成成分は抗体（
高度に特異的で強固に結合する単クローン抗体の開発が
好ましい）であると考えられる。この技術に適した単ク
ローン抗体を得るために、最も強固に結合し、最も低い
交差反応性を有する抗体を産出および選択することを意
図した分析法を使用する方法を計画した。特定の型の単
クローン抗体を産出するために工程が、何千もの株化細
胞をもたらすことはよく知られている。したがって、適
切な株化細胞を選択するための規準はこの産物開発の重
要な部分である。 【００２１】この作業の過程で２００００の株化細胞が
生成した。これらの多くはアミラーゼに対する抗体を産
出するが、唾液アミラーゼに対して特異的ものは２４株
だけであった。放射免疫検定法を使用することによって
、結合親和性およびより正確な交差反応性測定にもとづ
いてさらに選別することが可能になった。 【００２２】まず、唾液アミラーゼに特異的で特に強固
に結合する２つの単クローン抗体（ここでは５／２６２
および５／３３０（それぞれ９００３１３０２、９００
３１３０６）と呼ぶ）を生産した。これらはそれぞれ、
３ｘ１０８　ｌ／Ｍおよび２ｘ１０１０　ｌ／Ｍの対唾
液アミラーゼ結合親和性と、０．５％より小さい、およ
び０．１％より小さい対膵アミラーゼ交差反応性を有し
た。このように抗体５／３３０は結合親和性および特異
性に関してより優れた結果を示した。 【００２３】この２つの抗体を、異なった結合法を用い
ていくつかの固相支持体に結合させた。驚くべきことに
、直接比較を行ったそれぞれの場合において、遊離溶液
中ではより弱い結合親和性を有する抗体が、固相に結合
した場合にはより高い唾液アミラーゼ除去能を示した。 膵アミラーゼに対する交差反応性もまた予期しない様式
で挙動した。最も低い交差反応性を有する抗体が、固定
化した場合には膵アミラーゼをより結合した。 【００２４】血清から唾液アミラーゼを除去するために
抗体を結合したビーズを使用した場合、例えば消泡剤、
静菌剤、および非特異的結合を減少させるための試薬な
どを添加することによって、結果がさらに改善されるこ
とがわかった。このような操作は当業者の能力の範囲内
に十分含まれる。 【００２５】以下の記述は本発明を例示するものである
。 【００２６】実施例１ 単クローン抗体の開発 Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫精製した唾液アミラーゼ（ア
アルトバイオリエージェンツ（Ａａｌｔｏ　Ｂｉｏｒｅ
ａｇｅｎｔｓ）、ダブリン、エールより購入）で免疫化
した。フロインド完全アジュバント中のこの成分５０μ
ｇを腹腔内経路でマウスに注入した。３、６および９週
間後にこの注入を繰り返した。ただしこの場合にはフロ
インド不完全アジュバンドを使用した。１１週後に、食
塩水中の本抗原５０μｇを静脈内に注入した。さらに３
日後、この動物を殺し、脾臓を摘出した。 【００２７】基本的にＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
７３：３−４６；１９８１）が記述したようにして、細
胞融合を行った。免疫化した動物の脾臓を摘出し、すべ
ての細胞が膜から解離するまで穏やかにホモジネートし
た。この脾臓細胞懸濁液を、Ｌ−グルタミン、ペニシリ
ン／ストレプトマイシン、および１０％胎児ウシ血清（
ＦＣＳ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）中で３回洗浄した。既知の体積中に再懸濁させた
後、メチルバイオレットクエン酸染色を用いる血球計中
で細胞を計数した。 【００２８】使用した骨髄腫株化細胞は、ケンブリッジ
（ＵＫ）のメディカルリサーチカウンシルラボラトリー
オブモレキュラーバイオロジーから入手したＮＳＯ（非
クローン）である。対数増殖期にあるこの骨髄腫細胞を
ＤＭＥＭ中で洗浄し、位相差顕微鏡を用いる血球計中で
計数した。 【００２９】脾臓細胞（１ｘ１０８）を骨髄腫細胞（７
ｘ１０７）と混合し、遠心分離して液体を除去した。得
られた細胞ペレットを３７℃の水浴中に置いた。塩類Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液中（ｐＨ７．５）の５０％（ｗ／ｖ）ポ
リエチレングリコール１５００（ＰＥＧ）溶液１ｍｌを
１分間にわたって添加し、この混合物を１．５分間緩や
かに撹拌した。血清を含まないＤＭＥＭ５０ｍｌを５分
間にわたって添加した後、遠心分離した。上清を捨て、
細胞ペレットを１８％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１０ｍｌ中
に再懸濁させた。得られた細胞懸濁液を、１ウェルあた
り１０μｌの量で、標準マルチウェル組織培養プレート
の９６０ウェルのそれぞれに入れた。各ウェルは、標準
ＨＡＴ培地（ハイポキサンチン、アミノプテリン、およ
びチミジン）２ｍｌ、および１ウェルあたり５ｘ１０４
マクロファージの濃度でＢａｌｂ／ｃマクロファージの
供給細胞層を含んでいる。このウェルを、湿度約９０％
、９％ＣＯ２−空気の雰囲気下で３７℃で維持した。 【００３０】単クローン抗体産出のスクリーニングは、
固相免疫検定法によった。精製唾液アミラーゼおよび膵
アミラーゼ（アアルトバイオリエージェンツ）をヌンク
マキシソープ（Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）微量滴定
プレート上に高ｐＨ緩衝液中で吸着させた。このプレー
トをウシ血清アルブミンで遮断した後、洗浄した。マウ
ス抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合
的に結合させたヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した
。オルトフェニレンジアミンをこのペルオキシダーゼの
基質として使用した。 【００３１】目標抗原に対して特異的な抗体を産出する
細胞を含むこれらのウェルから細胞を抜き出し、従来の
希釈クローニング法によってクローニングした。各段階
において、酵素免疫検定法によって抗体活性を監視した
。 【００３２】さらに抗体結合を放射免疫検定法によって
評価した。唾液アミラーゼをクロラミンＴ法によって、
１２５Ｉで比活性７０μＣｉ／μｇに標識した。検定で
は、抗体に結合したトレーサーを遊離のトレーサーから
、セルロースビーズ固相に結合させたロバ抗マウス抗体
によって分離した。放射免疫検定によって、膵アミラー
ゼ活性との交差反応性率が得られ、スカッチャード（Ｓ
ｃａｔｃｈａｒｄ）分析の後、その抗体の結合親和性を
決定した。 【００３３】２つの株化細胞が、唾液アミラーゼに特異
的で強固に結合する単クローン抗体を産出することがわ
かり、これらを５／２６２および５／３３０と命名した
。唾液アミラーゼに対するその結合親和性はそれぞれ、
３ｘ１０８　ｌ／Ｍおよび２ｘ１０１０　ｌ／Ｍである
ことがわかった。したがって、遊離溶液中では抗体５／
３３０がはるかに優れた唾液アミラーゼ結合親和性を有
する。これら２つの抗体の膵アミラーゼに対する交差反
応性はそれぞれ、０．５％より小さく、また０．１％よ
り小さかった。 【００３４】この抗体を精製するために、組織培養液を
まず０．２μｍフィルターに通した。抗体を分離するた
めに、この液を固定化プロテインＡのカラム上に送り込
んだ。ｐＨ３．５のグリシン緩衝液を用いて溶出させた
後、抗体をリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）中に透析
した。 【００３５】実施例２ 抗体の６．４ｍｍポリスチレンビーズへの結合ヒドラジ
ド基で被覆された直径６．４ｍｍのポリスチレンビーズ
をライフサイエンスラボラトリーズ（ＵＫ）リミテッド
から購入した。 【００３６】２５ビーズを、０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）中の１２．５％グルタルアルデヒ
ド５ｍｌと共に、室温で２時間撹拌した。次いでこのビ
ーズをブフナー漏斗中で、脱イオン水１００ｍｌで洗浄
し、次いで０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）５０ｍｌで洗浄した。このグルタルアルデヒド活性
化ビーズを、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５ｍｌ中の抗
体２．５ｍｇに加えた後、シアノホウ水素化ナトリウム
約１ｍｇを添加した。室温で終夜穏やかに混合した後、
抗体結合ビーズをリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍ
ｌで洗浄し、次いで０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム５０ｍ
ｌで洗浄した。さらにこのビーズを、ホウ水素化ナトリ
ウム約１ｍｇを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム５．０
ｍｌと穏やかに混合した。０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム
１００ｍｌおよび脱イオン水１００ｍｌで最終的に洗浄
した後、このビーズを乾燥し、使用に先立って４℃で保
存した。 【００３７】抗体５／２６２と結合したポリスチレンビ
ーズと、抗体５／３３０と結合したポリスチレンビーズ
を、１ビーズを活性１０００ｕ／ｌの唾液アミラーゼあ
るいは膵アミラーゼ１００μｌと共にインキュベートす
ることによって比較した。このインキュベーションは室
温で１時間行った。これが終了したときに、標準的な方
法によって、残存液の内の２０μｌ試料のアミラーゼ活
性を検定した。 【００３８】抗体５／２６２と結合したビーズは、溶液
中に８％の唾液アミラーゼおよび８９％の膵アミラーゼ
を残していた。これに比べて５／３３０結合ビーズは、
２１％の唾液アミラーゼおよび８９％の膵アミラーゼを
インキュベーション後に残した。 【００３９】実施例３ 抗体のダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２８０
への結合ダイナビーズＭ−２８０トシル活性化体は直径
２．８μｍの均一な超常磁性ポリスチレンビーズである
。これらのビーズの表面は、ｐ−トルエンスルフォニル
クロリド処理によってあらかじめ活性化されている。こ
の素材はダイナル（Ｄｙｎａｌ）（ＵＫ）リミテッドか
ら購入した。 【００４０】１０ｍｇ／ｍｌビーズ懸濁液１ｍｌを、リ
ン酸緩衝化食塩水で３回洗浄した。この洗浄および以下
の洗浄はすべて、洗浄剤と混合し、ビーズを磁力によっ
て集め、上清を捨てて、そのペレットをより多量の洗浄
緩衝液で再懸濁させることによって行った。 【００４１】この最後の洗浄の後に、そのペレットを５
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍｌで再懸濁
させた。５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）中に濃度
８００μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製し、その５００μｌ
を再懸濁したビーズと混合した。この混合物を室温で４
８時間激しく撹拌した。 【００４２】この抗体被覆ビーズを、０．１％ウシ血清
アルブミンを含むリン酸緩衝化食塩水で各１０分間、３
回洗浄した。さらに３０分間洗浄した後、ビーズを再度
同じ洗浄緩衝液中で、終夜４℃で最終的に放置洗浄した
。この被覆ビーズを試験する前に同緩衝液中に４℃で保
存した。 【００４３】抗体５／２６２で被覆したビーズと、抗体
５／３３０で被覆したビーズを、溶液から唾液アミラー
ゼおよび膵アミラーゼを除去するその能力に関して比較
した。２０ｍｇ／ｍｌ懸濁液２０μｌを活性１０００ｕ
／ｌの唾液アミラーゼもしくは膵アミラーゼ１００μｌ
と混合した。５分間放置した後、この懸濁液を含む管を
磁石上に２分間置いた。この操作によってビーズが下方
に引き寄せられてペレットを形成し、上部に透明な上清
が残った。この上清の内２０μｌを残存アミラーゼ活性
測定のために採取した。 【００４４】抗体５／２６２と結合したダイナビーズは
、上清中に、６％の唾液アミラーゼおよび８５％の膵ア
ミラーゼを残したことがわかった。しかし抗体５／３３
０被覆ビーズは、非結合分画中に、１２％の唾液酵素よ
び７６％の膵酵素を残した。 【００４５】実施例４ 抗体５／２６２のバイオマグ（Ｂｉｏｍａｇ）４１００
粒子への好ましい結合 バイオマグ磁性ビーズは、立体化学的に障害のない官能
基を提供するために重合性シランで被覆した、鉄オキシ
ドの超常磁性粒子である。バイオマグ４１００粒子はア
ドバンスドマグネティックス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａ
ｇｎｅｔｉｃｓ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ、
アメリカ合衆国）から入手可能であり、ＵＳ−Ａ−４５
５４０８８に、より詳細に記述されている。 【００４６】５０ｍｇ／ｍｌ粒子懸濁液３００ｍｌを０
．０１Ｍピリジンで４回洗浄した。この洗浄および以下
の洗浄はすべて、洗浄剤と混合し、磁力によってビーズ
を集め、上清を捨てて、次の溶液中にそのペレットを再
懸濁させることによって行った。 【００４７】再懸濁した粒子ペレットに、５％（ｖ／ｖ
）グルタルアルデヒド６００ｍｌを加えて、１ｌプラス
チック瓶に移した。これを回転混合機上で室温で３時間
混合した。 【００４８】この活性化したビーズを、０．０１Ｍピリ
ジン（ｐＨ６．０）各５００ｍｌで４回洗浄した。 【００４９】０．０１Ｍピリジン（ｐＨ６．０）中の抗
体１５０ｍｇをこのビーズと混合して総体積を１５０ｍ
ｌにした。これを室温で終夜混合した。この粒子を０．
０１Ｍピリジン（ｐＨ６．０）各５００ｍｌで２回洗浄
した。 【００５０】未反応の基を遮蔽するために、この粒子を
１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）７００ｍｌと室温
で３時間混合した。非共有結合的に結合している抗体の
完全な除去を確かなものにするために、粒子をストリン
ジェント（厳密度）洗浄法に供した。粒子をまず５０ｍ
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）各５００ｍｌで４回
洗浄し、次いで１Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０１％（ｗ／
ｖ）ブロノポールで洗浄した。 【００５１】翌日、粒子をグリシンＮａＣｌ緩衝液で２
回再洗浄した後、同緩衝液と３時間混合した。１Ｍエタ
ノールアミン（ｐＨ８．０）で４回洗浄した後、粒子を
このエタノールアミン中で終夜混合した。次いでこの粒
子を、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロノポールおよび０．１
％（ｗ／ｖ）ポリプロピレングリコールを含むリン酸緩
衝化食塩水で４回洗浄した後、同緩衝混合液中に５ｍｇ
／ｍｌの割合で再懸濁させた。 【００５２】このビーズをリン酸緩衝化食塩水中に、以
下の試薬の一部として組み込んだ： ５ｇ／ｌ　　　　　　　　　　　　　ビーズ０．０１％
（ｗ／ｖ）　　ブロノポール０．１％（ｗ／ｖ）　　　
　ポリプロピレングリコール１．２Ｍ　　　　　　　　
　　　　　　尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　。 【００５３】ブロノポールは細菌の生育を阻害するため
に、またポリプロピレングリコールは試料と混合する際
に泡立つのを防ぐために、さらに尿素は非特異的結合を
減じることによって膵アミラーゼの回収率を増大させる
ために使用した。 【００５４】粒子懸濁液１００μｌと、１％ＢＳＡを含
むリン酸緩衝化食塩水中の１０００ｕ／ｌ唾液アミラー
ゼ１００μｌを、１．５ｍｌ管中で混合することによっ
て、磁力による分離時間を決定した。室温に１０分間放
置した後、この管を、ネオジム鉄およびホウ素でできた
磁石を含む棚中に様々な時間置いた。上清のアミラーゼ
活性の分析によって決定した場合、１分間で９８％より
多くの唾液アミラーゼが除去された。これは、速度論的
微量滴定プレート分析機を用いて、ベンジリジン遮蔽し
たマルトヘプタオシドパラニトロフェニル基質を使用し
て行った。 【００５５】室温におけるインキュベーション時間の効
果を、上述の試薬を用いて決定した。１０００ｕ／ｌ唾
液アミラーゼ１００μｌ、および１０００ｕ／ｌ膵アミ
ラーゼ１００μｌの被験溶液を試薬１００μｌと混合し
て種々の時間放置した後、１分間磁力分離を行った。そ
の上清の膵および唾液アミラーゼ活性を分析した。３分
後、この試薬によって９７．６％の唾液アミラーゼが除
去され、５分間インキュベーションではこれが９８．２
％に増大した。６０分間のインキュベーション後には、
さらに９８．９％まで除去率がわずかながら増大した。 ３分、５分、および６０分後における膵アミラーゼの回
収率は８８％であった。 【００５６】種々の活性の唾液アミラーゼあるいは膵ア
ミラーゼ１００μｌを試薬１００μｌと共にインキュベ
ートすることによって、この試薬系の適用可能範囲を試
験した。インキュベーション時間を５分間、分離時間を
１分間とした。各アイソザイム活性１０００ｕ／ｌ、２
０００ｕ／ｌ、および３０００ｕ／ｌにおいて、唾液ア
ミラーゼの除去率はそれぞれ、９８．０％、９７．２％
、および９６．７％であり、また膵アミラーゼの回収率
はそれぞれ、８８％、８９％、および８８％であった。 【００５７】バッチ内およびバッチ間精度をヒト血清を
用いて、またバッチ間実験には純度制御血清プレシノー
ム（Ｐｒｅｃｉｎｏｒｍ）およびプレシパス（Ｐｒｅｃ
ｉｐａｔｈ）をも用いて試験した。結果を以下の表に示
す。 【００５８】 【表１】 　　バッチ内精度 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　最小（Ｕ／Ｌ）　　　　　　　　最
大（Ｕ／Ｌ）　　　　　　　ｎ　　　　　　　　ＣＶ　
　　　高プール　　　　　　１４２２　　　　　　　　
　　１５００　　　　　　　　１９　　　　　　１．３
７　　中プール　　　　　　　　４１４　　　　　　　
　　　　　４３２　　　　　　　　２０　　　　　　１
．５５　　低プール　　　　　　　　２７０　　　　　
　　　　　　　２８８　　　　　　　　２０　　　　　
　１．６８　 【表２】 　　バッチ間精度 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　最小（Ｕ／Ｌ）　　　　　　　
　最大（Ｕ／Ｌ）　　　　　　　ｎ　　　　　　　　　
　ＣＶ　　　　　高プール　　　　　　１４４６　　　
　　　　　　　１５９６　　　　　　　　２１　　　　
　　２．４３７　　中プール　　　　　　　　４２０　
　　　　　　　　　　　４７６　　　　　　　　２１　
　　　　　２．９７２　　低プール　　　　　　　　２
５８　　　　　　　　　　　　３０６　　　　　　　　
２１　　　　　　４．２９３　　プレシノーム　　　　
３７５　　　　　　　　　　　　４１１　　　　　　　
　２１　　　　　　２．８０６　　プレシパス　　　　
　　７２０　　　　　　　　　　　　７７４　　　　　
　　　２１　　　　　　２．１３８　 【００５９】上記の試薬を用いて、ベーリンガーマンハ
イムから入手した膵アミラーゼ法（カタログ番号１００
５００６）に対して相関させた。１００人の患者の血清
について得られた相関係数は、回帰分析式ｙ＝１．０７
２ｘ−６０．１において０．９９６であった。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　物理的に分離可能な支持体もしくは分
   離支持体に固定化もしくは結合しており、唾液α−アミ
   ラーゼに対して少なくとも１ｘ１０７　ｌ／Ｍの結合親
   和性を示し、かつ膵α−アミラーゼと１％より小さい交
   差反応性を示す、唾液α−アミラーゼに対する単クロー
   ン抗体を使用することを特徴とする、唾液α−アミラー
   ゼおよび膵α−アミラーゼを含有する試料からの唾液α
   −アミラーゼの選択的除去法。
2. 【請求項２】　　残存膵α−アミラーゼの測定をさらに
   含む請求項１の方法。
3. 【請求項３】　　該単クローン抗体が唾液α−アミラー
   ゼに対して少なくとも１ｘ１０８　ｌ／Ｍの結合親和性
   を示し、かつ膵α−アミラーゼと０．５％より小さい交
   差反応性を示す、請求項１あるいは請求項２の方法。
4. 【請求項４】　　該単クローン抗体が５／２６２（９０
   ０３１３０２）もしくは５／３３０（ＥＣＡＣＣ　９０
   ０３１３０６）と同定される、請求項１から請求項３ま
   でのいづれかの方法。
5. 【請求項５】　　該単クローン抗体が、磁力、遠心分離
   、あるいは濾過によって分離され得る粒子、へら状物質
   、もしくは管壁に結合されているか、あるいは膜上もし
   くは分離層中に固定化されている、請求項１から請求項
   ４までのいづれかの方法。
6. 【請求項６】　　請求項１に定義される単クローン抗体
   を含むことを特徴とする、唾液α−アミラーゼ選択的除
   去キット。
7. 【請求項７】　　膵α−アミラーゼの測定手段をさらに
   含む請求項６のキット。
8. 【請求項８】　　消泡剤および／または静菌剤、および
   ／または非特異的結合を減少させる試薬をも含む、請求
   項６あるいは請求項７のキット。
9. 【請求項９】　　請求項１に定義される性質を示す単ク
   ローン抗体を選択することを特徴とする、唾液α−アミ
   ラーゼに対する単クローン抗体生産法。
10. 【請求項１０】　　請求項１に定義される性質を示す、
    また好ましくは５／２６２（ＥＣＡＣＣ　９００３１３
    ０２）もしくは５／３３０（ＥＣＡＣＣ　９００３１３
    ０６）と同定されることを特徴とする、唾液α−アミラ
    ーゼに対する単クローン抗体。
11. 【請求項１１】　　請求項１０の抗体を固定化された形
    態もしくは結合された形態で含むことを特徴とする試薬
    。
12. 【請求項１２】　　該抗体が５／２６２（ＥＣＡＣＣ　
    ９００３１３０２）と同定され、かつ超常磁性微粒子か
    らなる支持体に結合している、請求項１１の試薬。