JPH04227821A - 水溶性液体からアンモニュームを分離する方法と装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、輸送膜を経由して陽
イオンを含む水溶性の液体からアンモニュームを分離し
、アクセプター側で選択的に消去する方法、およびこの
方法に適した装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】アンモニューム・イオンは、多くの醗酵
プロセスで成長や生産性を阻害する働きがある。これは
、特に哺乳類の細胞を培養する場合に大切である。それ
故、生物量の濃度と生産性を高めるため、醗酵溶液中の
アンモニューム濃度を低下させると効果的である。

【０００３】このような溶液のアンニューム濃度を低下
させる方法は既に開発されている。この方法は上記培養
液のアンモニュームとアンモニヤのバランスに基づくも
ので、これは培養液中に少量含まれている（ＧＢＦの科
学結果報告，１９８５，　ｐｐ．　２０　−２２）　。 即ち、この報告によれば、アンモニヤは多孔質の隔膜（
ポリプロピレンホース）を経由して拡散によって分離さ
れ、この隔膜の二次側で酸性媒体によって吸収され、そ
の場合に形成されたアンモニューム・イオンがイオン交
換により除去される。この方法に関しては、Ｓｏｅｔｅ
ｒｓ　等も”Ａｄｖａｎｃｅ　ｉｎ　Ａｍｍｏｎｉａ　
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｅｎｃ
ｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ”　６９（１９８８）　５３４
　−　４２中に報告している。

【０００４】Ｂｕｓｓｅ　等によって、Ｊ．　Ｈｅｐａ
ｔｏｌｏｇｙ　１ｔｏ　Ｖｏｌ．　４　（１９８７）　
ｐ．　１０中に脂質中空繊維隔膜の反応塔によってアン
モニュームを除去することが記載されている。 ここではドナー側のアンモニューム・イオンがアンモニ
ヤとして脂肪親和性の中空繊維隔膜を通過して拡散し、
アクセプター側で依然として　ｐＨ　のずれた、あるい
は酵素的にαケト・グルタラートと　ＮＡＤＨ　でグル
タミン酸に変換され、輸送バランスが崩れる。

【０００５】Ｔ．　Ｐｕｌｔａｒ　等は　Ｄｅｃｈｅｍ
ａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅｓ　３　−　ＶＣＨ　Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌ−ｌ
ｓｈａｆｔ　１９８９，　Ｓ．　５６７　−　７１で、
アンモニューム・イオンが燐酸カルシュームと付加反応
を起こすことによって、アンモニューム・イオンを培養
液から除去すること開示している。しかし、この除去は
不完全なものと見なされている。それ故、アクセプター
側を酸性溶液で満たした多孔質の隔膜を通過する前記の
アンモニヤ拡散が好ましい。

【０００６】アンモニューム濃度を低下させる他の方法
は、Ｉｉｏ　等によって　Ｒ．　Ｍｕｒａｋａｍｉ（編
集）”Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｃｉａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｅ
ｎｖｉｒｏｍｅｎｔ”　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ｖｅｒｌａ
ｇ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８４，　ｐ．　４３７　
−　４２に発表されている。ここでは、透析パイプの熱
水で発生したアンモニュームシリケイト　ＺＣＰ　−　
５０　の懸濁液によるアンモニュームの吸収が利用され
ている。

【０００７】Ｔ．　Ｅ．　Ｈａｓｓｅｌｌ　等によって
、Ｓｐｉｅｒ　と　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　（編集）　の
　”Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ａｎ
ｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　Ｂｕｔ
ｔｈｅｒｗｏｒｔｈｓ，　Ｌｏｎｄｏｎ　１９８７，　
Ｓ．　２４５　−６３中にグルタミンをグルタラートま
たは２オキソグルタレートで置換してアンモニュームを
低減させることが示してある。

【０００８】細胞培養液からアンモニューム濃度を低減
させる上記の技術は、完全に満足のいくものではないよ
うに見える。特に、長時間にわたるアンモニヤの拡散に
よる非常に好ましい分離は、多孔質構造の変化と塞がり
のため、問題を引き起こす。更に、隔膜を通過して達成
される輸送速度は低いので、非常に広い隔膜面積が必要
になる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】それ故、この発明の課
題は、水溶性液体、特に細胞培養液中のアンモニューム
量を低下させるため、問題なく行え、効率の良い方法、
およびこの方法を実行する装置を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の課題は、この発明
により、冒頭に述べた種類の方法の場合、隔膜として陽
イオン交換膜を使用し、アクセプター側をドナー側より
高い　ｐＨ　値に設定して、アンモンニュームとアンモ
ニヤの間の平衡により、膜に対して垂直にＮＨ４　＋　
の濃度勾配が存在し、アンモニヤがアクセプター側の溶
液から除去され、ＮＨ４　＋　とは異なる陽イオン量が
ドナー側の溶液の陽イオン量と一致する、および／また
は隔膜を経由して交換に寄与する体積がドナー側の全液
体体積の高々　１０　％になることによって解決されて
いる。

【００１１】更に、上記の課題は、この発明により、冒
頭に述べた種類の装置の場合、バイパス通路に結合する
貫通区間に、同時にアクセプター室の仕切壁である陽イ
オン交換仕切隔膜を備え、アクセプター室が直接　ｐＨ
　制御と　ＮＨ３の除去を行う装置を保有するか、ある
いはそのような装置の一部を有する貫通区間であること
によって解決されている。

【００１２】この発明による他の有利な構成は特許請求
の範囲の従属請求項に記載されている。

【００１３】

【作用】この発明によれば、アンモニューム除去の選択
度が、従来のように、疎水性の隔膜を通過する　ＮＨ３
の拡散によって達成されるのでなく、ドナー側とアクセ
プター側の陽イオン量を一致させ、陽イオン交換膜を通
して　ＮＨ４＋　を運び、アクセプター側に向けて強化
された　ＮＨ４＋　の濃度勾配によって達成される。こ
の場合、中性点のまわりの　ｐＨ　値を有する生体系の
で　ＮＨ３の濃度に比べて非常に高い　ＮＨ３＋　濃度
（図６参照）がアクセプター側への強化されたアンニュ
ーム輸送用の「駆動体」として利用されている。ここで
は、　ｐＨ　値を上げることによって、　ＮＨ３に対す
るバランスのため陽イオン化で低　ＮＨ４＋　濃度が生
じる。この拡散供給されたアクセプター側の　ＮＨ４＋
　の低下は、更にアクセプター側の系からＮＨ３を除去
して強化される（図７参照）。上昇した濃度勾配と共に
隔膜を横切って増加する　ＮＨ４＋　の輸送速度を図８
から理解できる。

【００１４】アクセプター側の溶液からアンモニヤを除
去することは、専ら気体を減圧するか、あるいは引き込
むことによって行われる（実施態様Ａ）。しかし、アン
モニュームを二次側で陽イオン化する多孔質の隔膜を通
してアンモニヤを拡散させるそれ自体公知の方法が使用
される（実施態様Ｂ）。包括して、以下の過程が進行す
る。即ち、

【００１５】

【外１】

【００１６】

【外２】 基本的には、不活性ガスを特に設備を通して減圧するか
、あるいは引き込んで連続的にアンモニヤを除去する滞
留アクセプター溶液を用いて作業することもできる。 しかし、アクセプター側で連続的にアクセプター溶液の
流れを隔膜を経由して　ＮＨ３　　除去装置に誘導する
と有利である。

【００１７】実際の醗酵溶液では、アンモニヤ以外に多
数の他の陽イオンが存在する。これ等の陽イオンは限ら
れた陽イオン交換膜を通して多少均等にしてアンモニヤ
に運ぶことが行われる。この場合、僅かなイオンはその
移動性が早いため、特に早く膜を通過する。著しい陽イ
オン損失とそれによるドナー溶液中の陽イオン濃度の低
下を防止するため、種々の方法が可能で、特に以下の方
法で行われる。

【００１８】アクセプター溶液としては、成長に必要な
全ての陽イオン物質を有し、細胞を含まない醗酵培養液
（しかし、　ｐＨ　値は高い）が使用される。この培養
液は必要な全ての陽イオンを同じ濃度で含み、ドナー側
での濃度の減少が防止される。

【００１９】醗酵溶液、つまりドナー溶液中の生体物質
の成長に大切な陽イオンは、両側で平衡濃度になってい
る。醗酵溶液からのはみ出しは行われない。しかし、ア
クセプター溶液には生体系が存在しないので、アンモニ
ュームは発生しない。即ち、ドナー溶液からアンモニュ
ームを除去するために必要な濃度勾配が存在する。この
アクセプター溶液は隔膜のところ連続的に通過できるの
で、常時ドナー側で形成され、隔膜は通過するアンモニ
ュームが、　ｐＨ　の急変によってアンモニヤとして捕
捉される。

【００２０】代わりに、あるいは付加的に、アクセプタ
ー溶液はドナー溶液に比べて狭い体積を保有し、連続的
には交換できない。こうして、狭い体積のため、ドナー
溶液とアクセプター溶液の間の平衡濃度が急激に生じる
。この濃度の値はドナー溶液の元の値に近い、つまり、
この場合、平衡を保つためドーナー溶液から少ない陽イ
オンが引き出される。アンモニュームの濃度も同じよう
に急激に平衡値になる。この値は陽イオン化によって生
じるアンモニヤのアクセプター溶液への溶解度で定まる
。それ故、アンモニヤは輸送に必要な濃度勾配を維持す
るため、アクセプター溶液から除去する必要がある。

【００２１】これには、アクセプター溶液を脱ガスする
ため、アクセプター溶液にヘリュームを通すことができ
る。この目的には、僅かに減圧状態に設定すると良い。 重要なことは、隔膜に垂直な濃度勾配に従ってアンモニ
ューム・イオンをドナー溶液からアクセプター溶液に連
続的に輸送できるため、溶解しているアンモニヤをアク
セプタ溶液からこの溶液の上の気体相にして常時除去す
ることにある。前記の勾配はアンモニュームを更にアン
モニヤに反応させることによってアルカリ性のアクセプ
ター溶液に維持している。

【００２２】しかし、アンモニヤは多孔質の隔膜を通過
する拡散によって分離されると特に有利である。既に上
で説明したように、滞留しているアクセプター溶液に対
する制限が可能である。しかし、アクセプターの循環回
路を設けると有利である。この回路は陽イオン交換膜の
アクセプター側を経由しても、また多孔質　ＮＨ３拡散
膜の一次側を経由しても案内される。この拡散膜の二次
側は簡単に捨てることのできる酸性の陽イオン溶液の流
れによって洗浄される。

【００２３】この発明による方法を実行する装置は、実
質上陽イオン交換・制限膜を有し、バイパス通路に導入
できる貫通区間を保有する。前記のイオン交換・制限膜
は同時にアクセプター室の仕切壁である。前記貫通区間
は、直接　ｐＨ調節および　ＮＨ３除去を行う装置を含
むか、そのような装置の一部を含む貫通区間である。

【００２４】

【実施例】この発明を、以下に、実施例を示す図面に基
づきより詳しく説明する。

【００２５】図１の透析装置が使用される。醗酵室２の
バイパス通路１には、透析モジュール３が組み込んであ
る。このモジュールには、陽イオン交換膜４（例えば、
ポリスチロール・スルフォネート　”Ｐｅｒｍｉｏｎ　
４０４０”　ＳＥＲＶＡ　社、膜面積　１３．４　ｃｍ
２）がドナーの流れ５をアクセプターの流れ６から分離
している。このアクセプターの流れ６は、循環回路中で
、アンモニヤをガス状の　ＮＨ３　　にして追い出す反
応容器７を経由して案内されている。

【００２６】この装置では、モデル実験として生体物質
でなく、ドナー側で　１００　ｍＭ　の　ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ　７），　１００　ｍＭ　の　ＮａＣｌ　お
よび　１００　ｍＭ　の塩化アンモニュームから成る水
溶性溶液がアプセクター側で　１００　ｍＭ　の　ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ　８），　１００　ｍＭ　の　Ｎａ
Ｃｌ　から成る溶液に対して透析される。脱ガスと陽イ
オン化によって生じるアンモニヤの除去がアクセプター
溶液を緩やかに通過するヘリュームの流れの気泡によっ
て行われる。　１０　分の時間間隔で、ドナー側とアク
セプター側のサンプルがそのアンモニューム含有量に関
して検査される（図３参照）。ドナー側で平衡値までア
ンモニューム濃度の直線的な低下が生じている。ドナー
側でのアンモニューム濃度のこの低下から、物質の移動
速度が計算できる。その値は、この実施例の場合、１平
方メートルの隔膜表面に対して　５．５　ｍｏｌ／ｈで
あった。

【００２７】アクセプター溶液の　ｐＨ　に依存する物
質の移動速度を検査すると、　ｐＨ　の上昇と共に移動
速度も上昇する（図４参照）。ドナー側でその都度生じ
るアンモニュームの平衡濃度は、残り成分（初期濃度に
対する平衡濃度）表現できるが、明らかにアクセプター
溶液の　ｐＨ　に無関係で（図５参照）、アクセプター
溶液へのアンモニヤの溶解度によってのみ定まる。

【００２８】図２には、図１の透析装置の好適実施例が
示してある。醗酵室２のバイパス通路１には、透析モジ
ュール３が導入されている。このモジュールでは、陽イ
オン交換膜４（例えば、ポリスチロール・スルフォネー
ト　”Ｐｅｒｍｉｏｎ　４０４０”　ＳＥＲＶＡ　社、
膜面積　１３．４　ｃｍ２）がドナーの流れ５をアクセ
プターの流れ６に対して分離している。前記アクセプタ
ーの流れ６は、循環回路中で第二の透析モジュール７に
通過して案内される。この第二のモジュールは微細な多
孔質の隔膜８を二次流れの分離境界として保有している
。前記（酸性の）二次流れ９は多孔質の隔膜８の近くを
通り過ぎ、この隔膜を通過した後、捨てられると有効で
ある。

【００２９】二つの実施例にして模式的に示す実験室装
置は以下のように構成され、運転される。

【００３０】１）透析モジュール 透析モジュールは平たい膜を受け入れるために発案され
ている。この膜はモジュールの半分の両方の間に装備さ
れる。両半分のネジ止めは、シリコンパッキングを介し
て膜とモジュールの半分の間の気密封止を与える。モジ
ュールの半分の各々には、液体を導入および排出する二
つの接続端子がある。液体の流れは、高いオーバーフロ
ー速度にするため、狭い断面にして膜の近くを接線方向
導入される。必要なオバーフロー表面はミアンダ状の流
れ誘導によって得られる。材料としては、オートクレー
ブ特性のため、特殊鋼が推奨される。この特殊鋼は、モ
ジュールを通過する生体物質を傷つけないため、プロセ
ス液体との接触面で最低の粗さを有する。モジュールの
大きさは、対応するアンモニュームの量を分離するに必
要な膜面に合わせる。このれは物質の移動データから算
出される。

【００３１】２）ドナー循環回路 ドナー循環回路は醗酵系の回りのバイパス通路として設
置される。つまり、ドナー循環回路中では、モジュール
を通過した後に醗酵系に戻される醗酵液体が循環してい
る。循環ポンプとしては、生体系に直接接続することを
考慮して、オートクレーブで使用できるポンプホースを
備えた剪断応力のないホースポンプが使用される。

【００３２】３）アクセプター循環回路この循環回路は
、醗酵より少なくとも１　ｐＨ　単位程高く　ｐＨ　を
設定され、アクセプター溶液から　ＮＨ３を除去する装
置を保有する。この装置は、先ず第一に静止し、圧力に
安定で、熱安定化された反応容器で構成されている。 この中では、滅菌したヘリュームを導入するか、あるい
は同様に減圧を滅菌して加えて　ＮＨ３を除去する。他
方、この装置は第二の透析モジュール（中空繊維の膜あ
るいは平坦な膜としてどちらか）で構成されている。こ
の第二透析モジュールはアクセプター溶液を微細な多孔
質隔膜の助けによって二次流れから分離している。二次
流れは、　ＮＨ３を陽イオン化し、多孔質の膜を通過す
る場合の定常的なアンモニヤ勾配を保証するため、７よ
り低い　ｐＨ　値に設定されている。

【００３３】

【発明の効果】以上説明したように、この発明の方法お
よびその装置により、細胞培養液中のアンモニューム量
を低下させることが、問題なく、効率の良く行える。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明による装置の模式図である。

【図２】この発明による装置の模式図である。

【図３】この発明による方法を利用した場合のドナーと
アクセプター溶液のアンモニューム濃度の時間依存グラ
フである。

【図４】アンモニューム・イオンの陽イオン交換膜を通
過する移動速度のアクセプター側の　ｐＨ　値依存性を
示すグラフである。

【図５】ドナー側のアンモニューム残留成分（初期濃度
に対する平衡濃度値）のアクセプター　ｐＨ　値依存性
を示すグラフである。

【図６】この発明による方法の原理を説明するためのア
ンモニューム対アンモニヤ比のｐＨ　値依存性を示すグ
ラフである。

【図７】この発明による方法の原理を説明するため、陽
イオン交換膜を経由して透析してアンモニュームを抽出
する方法の模式図である。

【図８】この発明による方法の原理を説明するための濃
度勾配に対するアンモニューム流れを示すグラフである
。

【符号の説明】

１　　　　　　　　バイパス通路 ２　　　　　　　　醗酵室 ３　　　　　　　　透析モジュール ４　　　　　　　　陽イオン交換膜 ５　　　　　　　　ドナー流れ ６　　　　　　　　アクセプター流れ ７　　　　　　　　反応容器 ８　　　　　　　　多孔室隔膜 ９　　　　　　　　二次流れ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　輸送膜を経由して陽イオンを含む水溶
   性の液体からアンモニュームを分離し、アクセプター側
   で選択的に消去する方法において、隔膜として陽イオン
   交換膜を使用し、アクセプター側をドナー側より高い　
   ｐＨ　値に設定して、アンモンニュームとアンモニヤの
   間の平衡により、膜に対して垂直にＮＨ４　＋　の濃度
   勾配が存在し、アンモニヤがアクセプター側の溶液から
   除去され、ＮＨ４　＋　とは異なる陽イオン量がドナー
   側の溶液の陽イオン量と一致する、および／または隔膜
   を経由して交換に寄与する体積がドナー側の全液体体積
   の高々１０　％になることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】　　アクセプター側の溶液からアンモニヤ
   を除去することは、減圧するかおよび／または不活性ガ
   スを導入するか、あるいは酸性の陽イオン化した溶液で
   微細な多孔質の隔膜を経由する選択輸送によって行われ
   ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】　　ドナー側の液体は　ｐＨ　を安定化し
   た醗酵に直接由来していることを特徴とする請求項１ま
   たは２に記載の方法。
4. 【請求項４】　　アクセプター側では、少なくとも１　
   ｐＨ　単位　ｐＨ　値を高めてあることを特徴とする請
   求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】　　アクセプター側では、適当に変更した
   　ｐＨ　値を有する細胞のない培養液が使用されること
   を特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】　　アクセプター側では、より薄い膜厚か
   らの液体の流れが使用されることを特徴とする請求項１
   〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】　　ドナー側とアクセプター側の間の膜を
   越える交換体積の比は２０　より大きいことを特徴とす
   る請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】　　バイパス通路を経由してドナー側に通
   ずる連続的な培養液は陽イオン交換膜に沿って導入され
   ることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の
   方法。
9. 【請求項９】　　請求項１〜８の何れか１項による方法
   を実行する装置において、バイパス通路に結合する貫通
   区間に、同時にアクセプター室の仕切壁である陽イオン
   交換仕切隔膜を備え、アクセプター室が直接　ｐＨ　制
   御と　ＮＨ３の除去を行う装置を保有するか、あるいは
   そのような装置の一部を有する貫通区間であることを特
   徴とする装置。