JPH04223258A - 酵素センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酵素センサ−に関し、さ
らに詳しくは、被測定検体中の生化学物質、例えばグル
コースの濃度を測定する際に、良好な応答性と高い感度
と安定性とを発揮することのできるアンペロメトリック
型の酵素センサーに関する。

【０００２】

【従来の技術】試料溶液中のグルコース濃度を測定する
酵素センサーとして、従来、アンペロメトリック型の酵
素センサー（過酸化水素電極方式）がある。この酵素セ
ンサーは、作用電極と絶縁体を介して設けられた対象電
極とを備える。そしてその作用電極は、基本的に、グル
コースに作用する酵素を固定した高分子膜を備える。前
記酵素としては、グルコースオキシダーゼがしばしば用
いられている。

【０００３】このような酵素センサーによる測定では、
まず、試料溶液中に前記作用電極と対照電極とを浸漬す
ると、試料溶液中のグルコースが前記高分子膜中の酸化
型グルコースオキシダーゼにより酵素反応を受け、グル
コノラクトンと水素イオンに変化する。

【０００４】これにより酸化型グルコースオキシダーゼ
は還元型グルコースオキシダーゼに変わる。次に、この
還元型グルコースオキシダーゼは酸素により酸化型グル
コースオキシダーゼに変わり、この酸素は先に生成した
水素イオンと反応して過酸化水素を生成する。

【０００５】その結果、作用電極と対照電極との間に過
酸化水素濃度に比例した電流が流れ、この電流値によっ
て間接的にグルコース濃度が決定される。

【０００６】しかしながら、上述した従来の酵素センサ
ーでは、反応が試料溶液中の酸素濃度に依存するので、
酸素濃度が変動する場合には、出力電流値が変動する。

【０００７】すなわち、酸素濃度が低い状態にあるとき
は、出力電流値が変動したり出力低下が著しく、またグ
ルコース濃度に対する出力電流の直線性も維持すること
ができず、出力電流の変動が大きい。

【０００８】一方、特開昭６２−２３５５５７号公報に
は、高分子膜中にグルコースに作用する酵素とこの酵素
反応に伴って酸化もしくは還元される酸化還元物質とを
固定した作用電極と、この作用電極とは絶縁材を介して
設けられ、作用電極とともに試料溶液中に浸漬される対
照電極とを備えた酵素センサー（メディエータ方式）が
開示されている。

【０００９】しかし、この公報に記載された酵素センサ
ーの作用電極においては、酸化還元物質等が単に高分子
膜中に分散しているだけなので、測定中にそれらの一部
が試料溶液中に溶出する。

【００１０】このため、性能が経時的に変化するので、
安定性に欠けると言う問題がある。◇本発明は上記事情
を改善するためになされたものである。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、被測
定検体中の生化学物質、たとえばグルコースの濃度を測
定する際、酸素濃度が変動する場合でも安定した性能を
発揮することができ、同時に酸化還元物質の溶出による
不安定性の問題をも解決したアンペロメトリック型の酵
素センサ−を提供することにある。

【００１２】

【前記課題を解決するための手段】前記目的を達成する
ための本願発明は、対照電極と作用電極とを備えた酵素
センサーにおいて、前記作用電極の表面に下記Ａ〜Ｃか
ら選ばれる高分子膜状物を備えてなることを特徴とする
アンペロメトリック型の酵素センサーである。

【００１３】Ａ：高分子担体に酸化還元物質を共有結合
してなる固定高分子担体と酵素とを有する高分子膜状物
。

【００１４】Ｂ：高分子担体に酸化還元物質および酵素
を共有結合してなる固定高分子担体を有する高分子膜状
物。

【００１５】Ｃ：高分子担体に酸化還元物質を共有結合
してなる固定高分子担体と、高分子担体に酵素を共有結
合してなる固定高分子担体とを有する高分子膜状物。

【００１６】本発明の酵素センサーにおいては、前記酵
素がグルコースオキシダーゼであるのが好適であり、前
記酸化還元物質がフェロセンまたはその誘導体であるの
が好ましく、前記高分子担体がポリビニルアルコールで
あるのが好ましく、前記高分子膜状物が導電性であるの
が好ましい。

【００１７】

【作用】本発明の酵素センサーは、対照電極とこれとは
絶縁体を介して設けられる作用電極とを備えたアンペロ
メトリック型の酵素センサーである。

【００１８】そして、その作用電極の表面には、（Ａ）
高分子担体に酸化還元物質を共有結合してなる固定高分
子担体と酵素とを有する高分子膜状物、（Ｂ）高分子担
体に酵素および酸化還元物質を共有結合してなる固定高
分子担体を有する高分子膜状物、および（Ｃ）高分子担
体に酸化還元物質を共有結合してなる固定高分子担体と
高分子担体に酵素を共有結合してなる固定高分子担体と
を有する高分子膜状物のいずれかが被覆されている。

【００１９】かかる酵素センサーによる測定（メディエ
ータ方式）では、まず、被測定検体中の生化学物質、た
とえば試料溶液中のグルコースが前記高分子膜中の酸化
型の酵素（たとえばグルコースオキシダーゼ）により酵
素反応を受け、グルコノラクトンと水素イオンに変化す
る。これにより酵素は還元型酵素に変わる。

【００２０】次に、この還元型酵素は酸化型の酸化還元
物質（メディエータ）と反応して、再び酸化型酵素に変
化する一方、酸化型の酸化還元物質は還元型に変化する
。この還元型の酸化還元物質は作用電極に電子を放出し
、ふたたび酸化型に変化する。その結果、作用電極と対
照電極との間にグルコース濃度に比例した電流が流れ、
この電流値によって間接的にグルコース濃度が決定され
る。

【００２１】そして、本発明においては、（Ａ）高分子
担体に酸化還元物質を共有結合してなる固定高分子担体
と酵素とを有する高分子膜状物を備えることが、重要な
一態様である。この態様の場合、酸化還元物質が高分子
担体に固定化されているので、酸化還元物質の流出がな
く、経時的な感度の低下がないので、感度の安定性が保
証される。一方、酵素は高分子担体に共有結合してはい
ないけれども、固定高分子担体中に物理的に捕捉された
状態になっているので、自由度が大きく、また、固定化
後に予想される酵素活性の低下もほとんどない。ただし
、この場合、外側の少量の酵素は遊離して出る可能性は
あるので、好ましくは、高分子膜状物の外側を酢酸セル
ロース膜、ポリウレタン膜等の蛋白質を透過させないよ
うな高分子膜で被覆しておくのが良い。

【００２２】さらに、本発明においては、（Ｂ）高分子
担体に酸化還元物質および酵素を共有結合してなる固定
高分子担体を有する高分子膜状物を備えることも重要な
一態様である。この態様の場合、同じ高分子担体に酸化
還元物質と酵素とを同時に共有結合により固定化したも
ので、性能上は上記（Ａ）の態様と変わるところはない
が、上記（Ａ）の態様におけるような酵素の遊離は全く
ない。

【００２３】また、本発明においては、（Ｃ）高分子担
体に酸化還元物質を共有結合してなる固定高分子担体と
、高分子担体に酵素を共有結合してなる固定高分子担体
とを有する高分子膜状物を備えることも、また重要な一
態様である。この態様においては、酸化還元物質と酵素
とをそれぞれ別の高分子担体に固定化したものを混合し
て用いるけれども、性能上は上記（Ｂ）と余り違わない
が、酸化還元物質と酵素との相対比率を容易に決定する
ことができるという利点を有する。

【００２４】以上に説明した（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ
）の三態様は、それぞれ若干の構造上の相違はあるもの
の、いずれも有効な態様であることには変わりがない。

【００２５】

【実施例】次に実施例に基いて本発明をさらに具体的に
説明する。

【００２６】第１図は本発明の酵素センサーの基本構造
を示す。表面を高分子膜状物４で被覆した作用電極１と
、これとは絶縁体２を介して設けられる対照電極３とを
備えている。

【００２７】高分子膜状物４としては、以下の三態様が
ある。すなわち、それらは、高分子担体に酵素および酸
化還元物質を共有結合してなる固定高分子担体を有する
第一の態様、高分子担体に酸化還元物質を共有結合して
なる固定高分子担体と酵素（高分子担体に結合しない）
とを有する第二の態様、および高分子担体に酵素を共有
結合してなる固定高分子担体と、高分子担体に酸化還元
物質を共有結合してなる固定高分子担体とを有する第三
の態様である。

【００２８】これらの中でも、高分子担体に酵素および
／または酸化還元物質とが共有結合している場合は、共
有結合を切断するに十分なエネルギーを与えない限り、
高分子担体からの酵素および／または酸化還元物質の分
離は皆無である。

【００２９】前記高分子担体としては、熱可塑性樹脂を
はじめ種々の高分子物質を用いることが可能であるが、
中でもポリビニルアルコールが特に好ましい。

【００３０】ポリビニルアルコールが特に好ましい理由
としては、ポリビニルアルコールが親水性で生体適合性
が良好であること、酸化還元物質や酵素を結合させるた
めの水酸基が豊富に含まれていること、分子が長くて酵
素の活性中心と接触し易いこと、重合度（ｎ＝７０〜２
，５００）を容易に調節することができるので目的によ
って使い分けが可能であること、などを挙げることがで
きる。

【００３１】前記酵素としては、たとえばグルコースオ
キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、
コレステロールエステラーゼ、ホスホリパーゼ、ラクテ
ートオキシダーゼなどを挙げることができる。

【００３２】たとえばグルコース濃度の測定には、グル
コースオキシダーゼが好適である。

【００３３】前記酸化還元物質としては、フェロセン、
あるいはフェロセンカルボキシアルデヒド、クロロフェ
ロセン、メチル−トリメチルアミノフェロセン、１，１
−ジメチルフェロセン、１，１’−ジカルボキシフェロ
セン、カルボキシフェロセン、ビニルフェロセン、トリ
メチルアミノフェロセン、トリメチルアミノフェロセン
、１，１’−ジメチルフェロセン、ポリビニルフェロセ
ン、フェロセンモノカルボン酸、ヒドロキシエチルフェ
ロセン、アセトフェロセン、１，１’−ビスヒドロキシ
メチルフェロセンなどを例とするフェロセン誘導体等を
挙げることができる。

【００３４】高分子担体に前記酵素および／または酸化
還元物質を結合させて固定高分子担体を得るためには、
公知の共有結合法を採用することができる。

【００３５】この共有結合法としては、例えばジアゾ法
、ペプチド法、アルキル化法、アセタール化法、架橋試
薬による担体結合法等を挙げることができる。

【００３６】共有結合法により酵素を高分子担体に結合
する方法の一具体例を挙げると、たとえば、ポリビニル
アルコールと１２％の割合でγ−アミノプロピルトリエ
トキシシランを含有するトルエン溶液とを混合して７時
間煮沸還流し、充分に乾燥した後に、５％の割合でグル
タルアルデヒドを含有する水溶液中で１時間反応させ、
しかる後この溶液と酵素のリン酸緩衝液とを混合し、０
℃で２時間反応させる方法を挙げることができる。

【００３７】また、前記酸化還元物質を高分子担体に結
合する一具体例としては、ポリビニルアルコールと１２
％の割合でγ−アミノプロピルトリエトキシシランを含
有するトルエン溶液とを混合して７時間煮沸還流した後
、これを充分に乾燥し、次いで０．１％の割合でフェロ
センカルボキシアルデヒドを含有する水溶液中に入れて
２４時間反応させ、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム
を添加して還元する方法を挙げることができる。

【００３８】さらに、高分子担体に酵素と酸化還元物質
とを結合する一具体例としては、ポリビニルアルコール
と１２％の割合でγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを含有するトルエン溶液とを混合して７時間煮沸還流
した後、充分に乾燥し、次いで０．１％の割合でフェロ
センカルボキンアルデヒドを含有する水溶液中に入れて
２４時間反応させ、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム
を添加して還元した後、さらにこれと５％の割合でグル
タルアルデヒドを含有する水溶液とを混合して４時間反
応させ、この溶液と酵素のリン酸緩衝液とを混合して、
０℃で２時間反応させる方法を挙げることができる。

【００３９】前記高分子担体に酸化還元物質または酵素
を固定化するための相対量比は、使用する高分子担体あ
るいは酸化還元物質の種類、結合残基の数、高分子の重
合度などにより相違する。

【００４０】たとえば、高分子担体として重合度５００
のポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡと略称すること
がある。）酸化還元物質としてフェロセンカルボキシア
ルデヒド（以下、ＦＣＡと略称することがある。）およ
び酵素としてグルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤと
略称することがある。）を用いる場合には、通常、重量
比でＰＶＡ：ＦＣＡ：ＧＯＤが１：０．２〜１．５：１
〜１０であり、好ましくはＰＶＡ：ＦＣＡ：ＧＯＤが１
：０．７〜１．２：３〜７である。酸化還元物質として
のＦＣＡが０．２よりも少なくなると、メディエータと
しての機能が発揮されにくくなり、またＦＣＡが１．５
よりも多くなると、ＧＯＤのＰＶＡに固定化される余地
が少なくなる傾向にある。

【００４１】なお、ＦＣＡのみをＰＶＡに、あるいはＧ
ＯＤのみをＰＶＡに固定する場合においても、基本的に
は上記ＰＶＡに対する重量比で用いる。また、ＰＶＡに
ＧＯＤを固定化しない場合には、重量比で前記ＦＣＡ固
定化ＰＶＡ：ＧＯＤが１：１〜１０であり、好ましくは
ＦＣＡ固定化ＰＶＡ：ＧＯＤが１：３〜７で配合するの
が良い。

【００４２】本発明においては、前記高分子膜状物は非
導電性であっても良いが、電子伝達をより一層効率よく
行うためには導電性であることが好ましい。後者の場合
、酸化還元物質または酵素を固定化する高分子担体その
ものが導電性高分子であっても良いし、別に導電性物質
を添加混合しても良い。

【００４３】前記導電性高分子としては、成膜性と導電
性を有するものであれば特に制限はなく、たとえば、リ
チウムやナトリウム等のアルカリ金属を電子供与体とし
てドーピングし、あるいはＩ２　やＡｓＦ５　を電子受
容体としてドーピングした、ポリビニルアルコール、ポ
リアセチレン、ポリパラフェニレン、ポリピロール、ポ
リチオフェン、ポリアニリン等を挙げることができる。 また、側鎖にカルバゾール基を有するポリマーであって
前記ドーピングをしてなるものも導電性高分子として挙
げることができる。

【００４４】前記高分子膜状物に配合する導電性物質と
しては、たとえば金、銀、銅、ニッケル等の金属粒子あ
るいはこれらの金属繊維、炭素繊維、グラファイトなど
が挙げられる。

【００４５】これらは一種単独で用いても良いし、二種
以上を併用しても良い。

【００４６】この導電性物質を混合して高分子膜状物を
調製する場合、導電性物質の高分子膜状物中に占める割
合は、通常６０重量％以下であり、好ましくは３０〜４
０重量％である。

【００４７】導電性物質の割合が６０重量％を超えると
、成膜性とグルコースに対する応答性が悪くなるので好
ましくない。

【００４８】前記高分子膜状物は、前記固定高分子担体
と酵素と（酵素を高分子担体に結合させない場合）、導
電性物質、さらには必要に応じて、酸化還元物質と、酵
素が未固定である高分子担体とから、例えば次のように
して作用電極の表面に成膜することができる。前記未固
定の高分子担体は電極の性能上特に必要ではないが、成
膜性を向上させるために添加するものである。

【００４９】先ず、前記固定高分子担体を適宜の溶媒に
溶解または分散させ、それに酵素を添加し（酵素を高分
子担体に結合させない場合）、導電性物質を添加し、さ
らには適宜の溶媒に溶解させた前記未固定の高分子担体
を添加し、撹拌混合し、その混合物に作用電極の先端を
浸し、あるいは作用電極の先端に前記混合物を塗布する
かし、その後充分に乾燥することにより、作用電極の表
面に高分子膜状物を形成することができる。

【００５０】このようにして得られる高分子膜状物の厚
みは、通常５〜５００μｍ、好ましくは１００〜２００
μｍである。

【００５１】このようにして得られた表面に高分子膜状
物を有する作用電極と、絶縁体と、対照電極とリード線
等とを用いて所定の組み立てを行なうと、本発明の酵素
センサーを得ることができる。

【００５２】（実施例１） 図１に示す高分子膜状物４を作用電極１上に有する酵素
センサーを次のようにして作成した。

【００５３】すなわち、高分子担体としてのポリビニル
アルコール（重合度５００）にグルコースオキシダーゼ
とフェロセンカルボキシアルデヒドとを重量比でそれぞ
れ１：１：５で反応させて得た固定高分子担体１０ｍｇ
を適量の水に分散させ、それにグラファイト粉末を１０
ｍｇ、５％のポリビニルアルコール（未固定）水溶液４
０μｌを添加した後、所定の工程を経て酵素センサーを
作製した。

【００５４】図２はこの本発明の酵素センサーをリン酸
緩衝溶液に浸漬し、作用電極−対照電極間に０．３〜０
．６Ｖの範囲で一定の電圧を印加して、エージングした
状態で１、２、５日目にグルコース濃度０〜３００ｍｇ
／ｄｌのリン酸緩衝溶液によりセンサーの出力応答を調
べたものである。

【００５５】エージング１〜５日までグルコース濃度に
対する直線性は０〜３００ｍｇ／ｄｌまで保たれており
、また出力の大きさも大きな変動はなく、安定している
。これは、固定化されたフェロセンが溶出しないで機能
していることを示している。

【００５６】（実施例２） 図３は、実施例１と同じ酵素センサーを実施例１と同様
にエージングして、それぞれ１、２、５日目にグルコー
ス濃度２００ｍｇ／ｄｌのリン酸緩衝液に浸漬し、溶液
中の酸素分圧を１４０〜１５０ｍｍＨｇ以下にまで低下
させたときの、センサーの出力電流値の変化を調べたも
のである。

【００５７】エージング１〜５日まで低酸素分圧下でも
出力電流値の変動はなく、安定している。これは、固定
化されたフェロセンが溶出しないで機能していることを
示している。

【００５８】（比較例１） 図４は、酸化還元物質を化学的に固定化しない従来の方
式による酵素センサーを、実施例１と同様にエージング
してセンサーの出力応答を調べて比較したものである。

【００５９】エージング１日目はグルコース濃度に対す
る直線性が０〜３００ｍｇ／ｄｌまで保たれているが、
エージング２日目になると、直線性は不良になり、出力
の変動も大きくなっている。フェロセンのリン酸緩衝溶
液への溶出による機能低下を示している。

【００６０】（比較例２） 図５は、酸化還元物質を化学的に固定化しない従来の方
式による酵素センサーを、比較例１と同様にエージング
して、同様の方法で酸素分圧を低下させたときの出力電
流値の変化を比較したものである。

【００６１】エージング１日目では低酸素分圧下での出
力はあまり低下しないが、エージング２日目になると、
低酸素分圧下での出力低下が大きくなる。フェロセンの
リン酸緩衝溶液への溶出による機能低下を示している。

【００６２】

【発明の効果】本発明の酵素センサーは、酵素および化
学的に固定化された酸化還元物質を含む高分子膜状物が
作用電極の表面に被覆してあるので、被測定検体中の生
化学物質、たとえばグルコースの濃度を測定する際、酸
素濃度が変動する場合でも安定した性能を発揮すること
ができ、同時に酸化還元物質の溶出による不安定性の問
題をも解決することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素センサーの概略的説明図である。

【図２】本発明の酵素センサーにおける出力電流とグル
コース濃度との関係を示す線図である。

【図３】本発明の酵素センサーにおける出力電流と酸素
分圧との関係を示す線図である。

【図４】従来の酵素センサーにおける出力電流とグルコ
ース濃度との関係を示す線図である。

【図５】従来の酵素センサーにおける出力電流と酸素分
圧との関係を示す線図である。

【符合の説明】

１・・・作用電極 ２・・・絶縁体 ３・・・対照電極 ４・・・高分子膜状物。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　対照電極と作用電極とを備えた酵素セ
   ンサーにおいて、前記作用電極の表面に下記Ａ〜Ｃから
   選ばれる高分子膜状物を備えてなることを特徴とするア
   ンペロメトリック型の酵素センサー。 Ａ：高分子担体に酸化還元物質を共有結合してなる固定
   高分子担体と酵素とを有する高分子膜状物。 Ｂ：高分子担体に酸化還元物質および酵素を共有結合し
   てなる固定高分子担体を有する高分子膜状物。 Ｃ：高分子担体に酸化還元物質を共有結合してなる固定
   高分子担体と、高分子担体に酵素を共有結合してなる固
   定高分子担体とを有する高分子膜状物。
2. 【請求項２】　　前記高分子担体がポリビニルアルコー
   ルである請求項１に記載のアンペロメトリック型の酵素
   センサー。
3. 【請求項３】　　前記酸化還元物質がフェロセンまたは
   その誘導体である請求項１に記載のアンペロメトリック
   型の酵素センサー。
4. 【請求項４】　　前記酵素がグルコースオキシダーゼで
   ある請求項１に記載のアンペロメトリック型の酵素セン
   サー。
5. 【請求項５】　　前記高分子膜状物が導電性を備える請
   求項１に記載のアンペロメトリック型の酵素センサー。