JPH04211392A - モノクローナル抗体、抗体特性を有する蛋白質、ハイブリドーマ細胞系及びモノクローナル抗体の作製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト細胞上の膜蛋白質
に対するモノクローナル抗体、抗体特性を有する蛋白質
、ハイブリドーマ細胞系、モノクローナル抗体の作製法
、及びこの抗体を含む癌、炎症、免疫系疾患、ショック
状態及びエイズ等の治療薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍−壊死−因子α（ＴＮＦα、カケク
チン）及び腫瘍−壊死−因子β（ＴＮＦβ、リンホトキ
シン）は、１つの細胞から他の細胞に信号を伝送するポ
リペプチド−伝達物質の１グループであるサイトカイン
の系統群に属する。サイトカインは本質的に生体の炎症
−及び免疫反応の分子情報ベース（これは生体の各防御
反応を相互に調和する信号の複合回路網を形成する）に
関与する。

【０００３】腫瘍−壊死−因子は炎症−又は免疫反応の
極めて早い時期に放出され、多くの他のポリペプチドを
形成するため免疫細胞を刺激する。

【０００４】ヒトＴＮＦαは、アミノ酸数７６のＮ−末
端ポリペプチド配列を含む、アミノ酸の鎖長１５７の蛋
白質として分泌され、従って純粋なＴＮＦαは１７ｋＤ
の相対分子量を有する（Ｂｅｕｔｌｅｒ及びＣｅｒａｍ
ｉ著、“Ｎａｔｕｒｅ”、３２０（１９８６）、５８４
〜５８８）。ヒトＴＮＦβは、強いグリコシル化が存在
しまた内部ジスルフィド橋が欠落していることによって
、ＴＮＦαとは構造的に異なるが、ＴＮＦαに対するア
ミノ酸−平面上に２８％の相同体を有する。両サイトカ
インの合成は相対的に異なるスチムリン（Ｓｔｉｍｕｌ
ｉ）によって行われるにもかかわらず、生物学的活性に
関して著しく一致するスペクトルを有し、共通の受容体
に結合する（Ａｇｇａｒｗａｌその他著、“Ｎａｔｕｒ
ｅ”、３１８（１９８５）、６６５〜６６７）。ＴＮＦ
α及びＴＮＦβに対する暗号づけ遺伝子はヒトの場合（
Ｎｅｄｗｉｎその他、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ
　　Ｒｅｓ．”、１３（１９８３）、６３６１〜６３７
３）にもまたマウスの場合（Ｎｅｄｏｓｐａｓｏｖその
他、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．”、
１４（１９８６）、７７１３〜７７２５）にも染色体の
極めて狭い近隣位にある。

【０００５】ＴＮＦ−受容体は赤血球以外の生体のすべ
ての体細胞上に見られる。この受容体の数は特定の細胞
上の数１００コピーから他の細胞上における２０，００
０コピーにまで達する。しかしこの受容体の数はたいて
いの場合、細胞の感受性とは無関係である。多くの場合
例えばＴ−リンパ球の場合、受容体は休止細胞（又は不
活性形）中には存在しないが、第一次能動化によって誘
導することができる（Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈその他、“Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、１３８（１９８７）、１７８６
〜１７９０）。受容体は、約１×１０１０Ｍ−１の解離
定数を有する、配位子に対する高い親和性を有する（Ｓ
ｃｈｅｕｒｉｃｈその他、“Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
”、（１９８６）３８、１２７〜１３３）。ゲル濾過実
験によればＴＮＦ−受容体は相対分子量約３００ｋＤの
多数の異なる蛋白質からなる複合体であると思われる（
Ｓｍｉｔｈその他、“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”、２
６１（１９８６）、１４８７１〜１４８７４）。由来の
異なる細胞にあっては受容体の優性配位子結合サブユニ
ットは約８０〜９０ｋＤの分子量を有し、上皮組織から
の細胞では付加的に免疫学的にこれと交叉反応しない約
６０ｋＤのサブユニットが存在すると思われる（Ｈｏｈ
ｍａｎｎその他、“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”、２６
４（１９８９）、１４９２７〜１４９３４）。従ってＴ
ＮＦ−受容体には明らかに少なくとも２種のタイプが存
在すると考えられる。ＴＮＦが受容体に結合した後にお
ける信号伝達の正確な特性はいまだ解明されていないが
、この信号への応答が種々の組織で著しく異なることは
判明している。

【０００６】ＴＮＦを投与することにより生物体を細菌
感染及び高放射線量から保護することができる。

【０００７】ＴＮＦでの処置はまた腫瘍を死滅させるこ
とができる。この場合、血流を腫瘍内に生じさせ、次い
でこれを乾燥し、死滅させる。更にＴＮＦは明らかに細
菌感染に対する生体の反応例えば発熱の媒介に決定的に
関与し、感染を克服する助けとなる。従ってＴＮＦは単
独でまた他のサイトカインと組み合せて、極めて重要な
治療可能性を有する。

【０００８】他方ＴＮＦは一連の病的状態例えば悪液質
、組織損傷、細菌性内毒素によるグラム陰性敗血性ショ
ック及びマラリアによる脳炎を誘発する可能性を有する
。更にＨＩＶで感染した細胞でＴＮＦの細胞傷害作用が
判明した（Ｍａｔｓｕｙａｍａその他、“Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．”、６３（１９８９）、２５０４〜２５０９）。 またモルベースでＴＮＦの毒性は多くの形態でシアニド
の毒性に比して約１００，０００倍高い（Ｂｅｕｔｌｅ
ｒ及びＣｅｒａｍｉ著、“Ｎａｔｕｒｅ”、３２０（１
９８６）、５８４〜５８８）。

【０００９】従って生物体内の濃度はＴＮＦの作用にと
って決定的であることは明白である。生体内で形成され
る他の多くの因子の場合におけるようにＴＮＦにあって
も有効と有害との間には狭い範囲があるにすぎないもの
と思われる。すなわち有効成分は多量に又は誤った箇所
に投与された場合には極めて毒性になり得る。ＴＮＦの
この高い毒性は例えば腫瘍疾病での治療薬としてこれを
使用した場合大きな問題を提供する。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の課題は
、ＴＮＦの法外に高い内生によってか又は特に高投与量
での局所使用が必要な場合におけるＴＮＦでの治療に起
因する、生体に非生理学的に多量のＴＮＦが含まれてい
る場合に、ＴＮＦの病的症状、特に組織損傷及びショッ
ク状態の発生を減少又は阻止することのできる薬剤を開
発することにあった。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明のこの課題は、Ｔ
ＮＦ−受容体を有するヒト細胞に結合した際ＴＮＦα又
は／及びＴＮＦβの公知作用を少なくとも十分に中和す
る、ヒト細胞上の膜蛋白質に対するモノクローナル抗体
によって解決される。

【００１２】本発明による抗体は、ＴＮＦ−受容体複合
体の一成分である、６０ｋＤのヒト細胞の表面蛋白質に
向けられている。競合研究は、本発明による抗体が種々
の細胞系において、その受容体へのＴＮＦ結合で種々異
なる強度で干渉することを示す（第１表）。しかし驚く
べきことには本発明による抗体の結合によって、種々の
組織に由来するすべての被検細胞系（リンパ系−、骨髄
性−、上皮−及び線維芽一細胞）で、ＴＮＦへの細胞反
応の完全な抑制がＴＮＦ結合との競合規模とは関係なく
生じることが判明した。この発見により本発明による抗
体が恐らく著しく異なるＴＮＦ−応答の信号伝達にとっ
て本質的な受容体蛋白質を認識し、これを機能的に遮断
することを、推知することができる。

【００１３】本発明による抗体は、組織培養でのヒト細
胞に対するＴＮＦの観察された細胞停止／細胞傷害作用
を、まったく完全に中和することができる（Ｐｆｉｚｅ
ｎｍａｉｅｒその他、“Ｂｌｕｔ”、５５、１〜１０（
１９８７ａ））。本発明による抗体の拮抗作用を３種の
ヒト細胞系で検査した。すべての系においてＴＮＦαの
細胞傷害又は細胞停止効果は付加的にインターフェロン
−γ又は蛋白質合成−抑制剤（例えばシクロヘキシミド
）の存在によって強化されたが、ＩＦＮ−γ又は蛋白質
合成−抑制剤はそれ自体単独では使用した条件下に、測
定された細胞反応に対してまったく影響力を有さない。 本発明による抗体の結合は、検査した３種のすべてのヒ
ト細胞系におけるＴＮＦの細胞傷害／細胞停止作用を完
全に中和することが確認された。同様に本発明による抗
体はＴＮＦβ及びネズミのＴＮＦα（これはヒト細胞に
おけると同様に有効である）の作用をも中和する。

【００１４】更に本発明による抗体はＨＬＡ−遺伝子の
、ＴＮＦで誘発される発現の拮抗体としても作用する。 ＨＬＡ−遺伝子の、ＴＮＦで誘導された変調を骨髄から
のヒト細胞系（Ｋ５６２）でまた上皮癌腫細胞系（Ｃｏ
ｌｏ　　２０５）で検査した。双方の系で付加的にＴＮ
Ｆαの同時刺激作用をインターフェロン−γと共に実施
して、その都度の反応を起こさせた（Ｐｆｉｚｅｎｍａ
ｉｅｒその他、“Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、１３８、９
７５〜９８０（１９８７ｂ））。本発明による抗体の存
在により双方の系の場合にＴＮＦ−作用を完全に抑制す
ることができる。

【００１５】最後に本発明による抗体はＴＮＦにより伝
達された免疫刺激の拮抗体としても作用する。すなわち
Ｔ−リンパ球への及びいわゆるナチュラルキラー細胞（
ＮＫ−細胞）へのインターロイキン−２−受容体−発現
の刺激作用（Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈその他、前記文献、１
９８７）は、本発明による抗体の結合によって完全に阻
止することができる。

【００１６】本発明の特に優れた対象は公知のＴＮＦ−
作用を完全に中和する能力を有する特殊抗体Ｈ３９８で
あり、これはアイソタイプＩｇＧ２ａの免疫グロブリン
で、ブダペスター・フェアラーグ（Ｂｕｄａｐｅｓｔｅ
ｒ　　Ｖｅｒｌａｇ）により寄託されたハイブリドーマ
細胞系ＥＣＡＣＣ９００２１６１７（又はＨ３９８．６
．１）により表現される。

【００１７】更に本発明の対象は、本発明によるモノク
ローナル抗体と同じ結合特異性を有する、抗体特性を有
する蛋白質である。この意味で特に優れているのは、実
際に本発明によるモノクローナル抗体Ｈ３９８と同じ抗
原−結合部位を有する、抗体特性を有する蛋白質である
。

【００１８】抗体特性を有する蛋白質とは、組換えＤＮ
Ａ−技術により修飾された抗体を意味する。ＴＮＦの作
用を少なくとも十分に中和するには、この修飾蛋白質が
本発明によるモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有
することが必要である。すなわちこの蛋白質はＴＮＦ−
受容体複合体の一成分である、ヒト細胞上の６０ｋＤ膜
蛋白質に結合しなければならず、また治療において代表
的な濃度範囲でＴＮＦα又は／及びＴＮＦβの公知作用
を少なくとも十分に中和する状態になければならない。 この基準を満足するため、抗体特性を有する修飾蛋白質
は、本発明によるモノクローナル抗体と実質的に同じ抗
原−結合部位を有する必要がある。免疫学分野の当業者
には、結合特異性が抗体のまったく特定の領域、すなわ
ち高頻度可変領域によって特徴づけられていることは公
知である。従って抗体特性を有する修飾蛋白質を製造す
るために本発明による抗体を変更する場合、抗体の高頻
度可変領域内で、結合特異性を変える修飾が生じないこ
とが重要である。これに対し抗体の結合特徴を本質的に
変えることなく、修飾蛋白質に一定の所望特性を付与す
るために、抗体の他の領域（不変部領域又は／及び可変
領域の非高頻度可変部）を変更することは可能である。 従って本発明は修飾蛋白質例えば抗体−部分断片（例え
ばＦ（ａｂ）２）、単鎖抗体又はキメラ化、特にヒト化
抗体（結合に関与しない抗体領域をヒト抗体の配列によ
って代えた）を含む。この意味で、本質的に抗体Ｈ３９
８と同じ抗原−結合領域を有する、抗体特性を有する蛋
白質は特に好ましい。

【００１９】更に本発明の対象は、常法で骨髄腫細胞を
、予めヒトＰ６０抗原−正細胞例えばＨＬ−６０（ＡＴ
ＣＣ　　Ｎｏ．　　ＣＣＬ２４０）からのアフィニティ
精製されたＴＮＦ−受容体物質で超免疫化されたマウス
の脾臓細胞又はＴ−リンパ球と融合させることよりなる
、本発明によるモノクローナル抗体の作製法である。

【００２０】ＴＮＦ−受容体を精製するためまず細胞膜
を調製し、引続き可溶化し、ＴＮＦ−アフィニティカラ
ムを介して精製する。細胞膜の調製はガラス／ガラス−
ホモジナイザー中で均一化することによって有利に行わ
れ、その際場合によっては低張培地で前処理してもよい
。次いでまず細胞核及びなお無傷の細胞を脱離し、次い
で細胞膜を遠心分離によりペレット化する。ＴＮＦ−受
容体−蛋白質の可溶化は本発明によれば非イオン界面活
性剤、有利には約１％のトリトンＸ−１００を含む緩衝
液で行う。可溶化緩衝液は付加的にロイペプチン、アプ
ロチニン及びプロテアーゼ阻害物質ジ−イソプロピルフ
ルオルホスフェート（ＤＦＰ）を含んでいてもよい。 この場合ＴＮＦ−アフィニティカラムはＴＮＦ、有利に
は組換えヒトＴＮＦαを適当な担体物質、有利にはアフ
ィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）−１５にカップリングするこ
とによって製造される。結合した受容体の溶離はｐＨ３
．０の酸性範囲で行う。引続き更にもう１つの精製行程
アセトン降下を行うこともできる。このため試料にアセ
トン約３部を加え、十分に低い温度で十分な時間、有利
には−８０℃で１４時間保存する。受容体−蛋白質を含
む生じた沈殿を遠心分離し、再度適当な緩衝液に取る。

【００２１】こうして作製された受容体物質でのマウス
の超免疫化は有利には３行程で行う。第１行程（標識１
）で受容体蛋白質１μｇを完全フロイントアジュバント
と共に腹腔内に投与し、第２行程（標識４０）で同様に
受容体蛋白質１μｇを不完全フロイントアジュバントと
共に腹腔内に投与し、第３行程（標識５５）で受容体蛋
白質２μｇをアジュバントなしに投与する。脾臓の摘出
は無菌条件で第５８標識で行うのが有利である。ハイブ
リドーマ細胞系の作製は常法で行う。しかしＴＮＦ−受
容体に対する十分に高い抗体含有量を得るためのマウス
の免疫化は、当業者に公知の他の適当な免疫化プロトコ
ルによっても可能である。

【００２２】ＴＮＦ−受容体蛋白質で超免疫化されたマ
ウスの脾臓細胞の融合は、常法で行うことができる。得
られるハイブリドーマクローンを、ＴＮＦ−受容体−正
ヒト白血病細胞系ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．　　
ＣＣＬ　　２４０）でのＴＮＦ−結合能の変調につきテ
ストした。

【００２３】４１３の検査したハイブリドーマクローン
からこの方法で、本発明による抗体を分泌するハイブリ
ドーマ細胞系を得ることができた。

【００２４】更に本発明の対象は、本発明によるモノク
ローナル抗体又は／及び本発明による抗体特性を有する
蛋白質を有効成分として、場合によっては常用の担持剤
、助剤又は／及び填料と共に含む薬剤である。

【００２５】ＴＮＦα及びＴＮＦβの生物学的作用にと
って高いアフィニティを有する特異性細胞膜−受容体へ
の結合は必要条件である（Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒその
他、前記文献、１９８７ａ）。従って本発明による抗体
は、細胞のＴＮＦ−受容体を検出し、種々の組織／器官
内の潜在ＴＮＦ−反応細胞を同定するのに、診断的に利
用することができる。更に上記の抗体は血清及び他の体
液中の分泌受容体断片を検出するのに適している。

【００２６】本発明による抗体の一層大きな意義は、そ
の特性においてＴＮＦα及びＴＮＦβの公知生物学的作
用を少なくとも十分に抑制することにある。試験管内で
のＴＮＦ中和作用に関しては、抗体をサイトカインと一
緒に投与した場合十分であり、従って試験管内では抗−
受容体−抗体でのインキュベート前処理は不要である。 　　種々の試験管内実験モデルでのこの顕著な拮抗特性
により、この種の抗体には極めて大きな潜在的治療意義
がある。本発明による抗体は、血清及び／又は他の体液
中に病的に高められたＴＮＦα／ＴＮＦβ−含有量を伴
って現れる病気及びＴＮＦα／ＴＮＦβが病因であると
認められたか又は判断されるすべての疾病において使用
することができる（Ｏｌｄ著、“Ｎａｔｕｒｅ”、３２
６（１９８７）、３３０〜３３１；Ｗａｒｒｅｎその他
、“Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．”、１（１９８８）、２４
４〜２４７；Ｂｅｕｔｌｅｒ及びＣｅｒａｍｉ著、“Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．”、５７（１９８９）
、５０５〜５１８、Ｇｒａｕその他、“Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｒｅｖ．”、１１２、４９〜７０（１９８９））。こ
れには自己免疫疾患例えば変形関節炎及び、悪性細胞そ
れ自体（例えば骨髄腫）の又は免疫系（例えば慢性Ｂ−
リンパ性白血病でのＣＤ４＋−細胞；Ｂ−ＣＬＬ）の脱
調節ＴＮＦα／ＴＮＦβ−生成を共なって現われる癌疾
病が含まれる。特に本発明による抗体の治療使用は、Ｔ
ＮＦ−伝達の急速に生命を脅かす症状経過の場合、すな
わち例えば細菌感染による敗血病性ショック（髄膜炎敗
血症）並びに脳性マラリアにおいてである。これらの場
合、抗体での処置後短時間で症状経過は有利に影響され
ることが期待できる。慢性疾患の場合にも本発明による
抗体又は修飾抗体（例えばマウスの不変部領域をヒトの
不変部領域で置き換えることによって）での治療は可能
である。

【００２７】本抗体のもう１つの潜在使用分野はエイズ
疾患の共同治療にある。ＨＩＶ、すなわちエイズ病原体
の増殖はＴＮＦによって刺激され、従ってＴＮＦは潜伏
病状から急性病状への進行要因の１つと見做される（Ｍ
ａｔｓｕｙａｍａその他、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、（１
９８９）、２５０４〜２５０９）ことから、抗体Ｈ３９
８は、すでに本質的に高められたＴＮＦ−含有量が確認
されている（Ｌａｈｄｅｖｉｒｔａその他、“Ａｍ．Ｊ
．Ｍｅｄ．”、８５（１９８９）、２８９〜２９１）か
又は外因性の免疫刺激手段（例えば比活性免疫化）によ
ってＴＮＦ−生成が誘発され得るような（Ｍａｔｓｕｙ
ａｍａその他、前記文献、１９８９）エイズ患者に、抗
ウイルス性有効成分として使用することができる。本発
明による抗体Ｈ３９８は試験管内で、レトロウイルス遺
伝子の転写を制御するＨＩＶ−プロモータのＴＮＦ−刺
激活性に対し抑制的に作用することから、本発明による
抗体を使用することによって、ＴＮＦで誘発されたウイ
ルス転写及びこれによる感染性ウイルスの増殖は押える
ことができる。

【００２８】ＴＮＦの望ましくない副作用を阻止するた
めに本発明による抗体を配量する処理は個々のケースに
依って異なるが、ＴＮＦを投与する場合、有利なのは１
人当り０．１〜１００ｍｇである。

【００２９】

【実施例】次に本発明を以下の実施例に基づき図１〜図
３と共に詳述する。

【００３０】 例　　１ ＴＮＦ−受容体蛋白質の精製 １．１　　細胞膜の調製 緩衝液Ａ：１２５ｍＭ　　スクロース ７．５ｍＭ　　トリス／ＨＣｌ　　ｐＨ７．４２ｍＭ　
　ＥＤＴＡ 緩衝液Ｂ：１００ｍＭ　　トリス／ＨＣｌ　　ｐＨ７．
４１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ　　ＣａＣｌ２ ２％小牛胎児血清［セラメード（Ｓｅｒａｍｅｄ），Ｂ
ｉｏｃｈｒｏｍ　　ＫＧ社製、Ｂｅｒｌｉｎ在］その都
度調製標識で緩衝液Ａ及びＢにフェニルメチルスルホニ
ルフルオリド（ＰＭＳＦ）１ｍＭを加えた。新たに収集
した細胞をガラス／ガラス−ホモジナイザーで均一化す
る前に細胞密度１・１０８／ｍｌで緩衝液Ａに３０分間
インキュベートした。低張培地でのこの前処理は次の３
０乳棒での１０００Ｕｐｍによる均一化を容易にした。 ホモジネートを同容量の緩衝液Ａで稀釈し、１０分間５
０ｘｇで遠心分離して、核及びなお無傷の細胞を脱離さ
せた。沈降物を同容量の緩衝液Ａで１回洗浄し、精製し
た上澄みを３０分間１２０００ｘｇで遠心分離した。引
続きペレット化した膜を緩衝液Ｂで２回洗浄した。すべ
ての調製行程は４℃で実施した。

【００３１】 １．２　　ＴＮＦ−受容体の可溶化 可溶化緩衝液：２０ｍＭ　　トリス／ＨＣｌ　　ｐＨ７
．４２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ　　ＣａＣｌ２ １％トリトンＸ−１００ １０　　μｇ／ｍｌ　　ロイペプチン １０００　　ＫＩＥ／ｍｌ　　アプロチニン０．５　　
μｌ／ｍｌ　　ＤＥＰ プロテアーゼ阻害物質ＤＦＰ（ジイソプロピル−フルオ
ロホスフェート（シグマ））をそれぞれ新たに緩衝液に
加えた。膜ペレットを氷冷可溶化緩衝液に、使用した細
胞５×１０８当り１ｍｌで懸濁させ、１０００Ｕｐｍで
ガラス／ガラス−ホモジナイザー中の１０乳棒で均一化
した。氷上で１時間インキュベートした後、バッチを１
００，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、清澄な上澄み
のみを更に使用した。

【００３２】 １．３　　ＴＮＦ−アフィニティカラムの製造ＴＮＦ−
アフィニティカラムを製造するため、精製し、組換えた
ヒトＴＮＦα５ｍｇをアフィゲル１５（Ａｆｆｉｇｅｌ
　　１５）１ｍｌにカップリングさせた（製造社（Ｂｉ
ｏｒａｄ）の処方書に基づき）。予めＴＮＦをカップリ
ング緩衝液（０．１Ｍ　　ＭＯＰＳ／ＨＣｌ　　ｐＨ７
．５）に対し適当な透析管中で２４時間透析した。アフ
ィゲルを蒸留水で３回洗浄し、透析したＴＮＦα−溶液
で４時間烈しく振った。次いでアフィゲルの未反応基を
、１時間に１Ｍトリス／ＨＣｌｐＨ７．４（最終濃度５
０ｍＭ）を加えることによって飽和させた。引続きＴＮ
Ｆ−アフィゲルを洗浄懸濁液ｐＨ７．４（１．４参照）
で２回洗浄し、ＦＰＬＣ−カラム（ＨＲ５／５、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ在）に満たした。 カラムを最初に使用する前に、アフィニティ精製のすべ
ての洗浄−及び溶出プログラムをそこで使用する全緩衝
液を用いて実施した。カラムの全製造は４℃で行った。 同様に４℃でアジドナトリウム２０ｍＭを加えた洗浄緩
衝液ｐＨ７．４中に保存した。

【００３３】 １．４　　アフィニティクロマトグラフィ洗浄緩衝液ｐ
Ｈ７．４：　　１０ｍＭ　　トリス／ＨＣｌ　　ｐＨ７
．４ １５０ｍＭ　　ＮａＣｌ ０．１％　　トリトンＸ−１００ 洗浄緩衝液３Ｄ　　　　　　：　　１０ｍＭ　　トリス
／ＨＣｌ　　ｐＨ７．４ １５０ｍＭ　　ＮａＣｌ １０　　％　　グリセリン １　　％　　デスオキシコール酸ナトリウム０．１％　
　ＳＤＳ ０．１％　　トリトンＸ−１００ 洗浄緩衝液ｐＨ８．６：　　１０ｍＭ　　トリス／ＨＣ
ｌ　　ｐＨ８．６ ５００ｍＭ　　ＫＣｌ ０．５％　　トリトンＸ−１００ 洗浄緩衝液ｐＨ４．５：　　５０ｍＭ　　グリシン／Ｈ
Ｃｌ　　ｐＨ４．５ １５０ｍＭ　　ＮａＣｌ ０．１％　　トリトンＸ−１００ 溶出緩衝液ｐＨ３．０：１５０ｍＭ　　グリシン／ＨＣ
ｌ　　ｐＨ３．０ ０．１％　　トリトンＸ−１００ 可溶化物質の全アフィニティ精製をＦＰＬＣ−装置（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社製、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ在）で４℃で
実施した。プローブ及び緩衝液を装入するため、容量５
０ｍｌの滑路（スーパーループ）を使用した。

【００３４】７・１０１０細胞の膜抽出物を流速０．２
ｍｌ／分でＴＮＦ−アフィニティカラムに装入し、引続
きカラムを流速０．５ｍｌ／分で、各緩衝液を次の順序
で用いて洗浄した： １）　　１０ｍｌ　　洗浄緩衝液　　ｐＨ７．４２）　
　１０ｍｌ　　洗浄緩衝液　　３Ｄ３）　　　　２ｍｌ
　　洗浄緩衝液　　ｐＨ７．４４）　　１０ｍｌ　　洗
浄緩衝液　　ｐＨ８．６５）　　　　２ｍｌ　　洗浄緩
衝液　　ｐＨ７．４６）　　　　５ｍｌ　　洗浄緩衝液
　　ｐＨ４．５受容体を酸性溶出緩衝液（ｐＨ３．０）
により流速０．１ｍｌ／分でカラムから溶出した。その
際溶出液を１０分画で各１ｍｌに集め、１Ｍトリス／Ｈ
Ｃｌ緩衝液ｐＨ７．４（小分留管に配置した）２００μ
ｌにより直ちに中和した。各分画は−２０℃で保存した
。

【００３５】 １．５　　アセトンでの蛋白質降下 集めた溶出液に−８０℃の冷却アセトンをプローブ１部
／アセトン３部の割合で加え、−８０℃で１４時間保存
した。この時間後生じた沈殿を１２０００ｘｇで４５分
間、冷却可能の遠心分離器中で０℃でペレット化した。 引続き上澄みを直ちに吸引濾別し、ペレットを、０．１
％トリトンＸ−１００を加えた２０ｍＭトリス−緩衝液
ｐＨ７．４　　４００μｌに再び溶解させた。ＴＮＦ−
結合調査は、この調製が全部で活性受容体蛋白質４μｇ
を含むことを示した（全蛋白質含有量：８０μｇ）。

【００３６】 ２．　　免疫化 生後６週間の雌マウスＢＡＬＢ／Ｃを受容体物質で次の
様式により免疫化した：標識１　　：完全フロイントア
ジュバント（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　　ＡＧ社製、
　　　　　　　　　　ＯＲＥＣ　　２０／２１）（１０
０μｌ）を加えた受容体調製（受容体　　　　　　　　
　　蛋白質１μｇ）１００μｌを腹腔内注射。

【００３７】標識４０：不完全フロイントアジュバント
（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　　ＡＧ社製、ＯＲＥＤ　
　２０／２１）を加えた１００μｌ（受容体蛋白質１μ
ｇ）を腹腔内注射。

【００３８】標識５５：アジュバントなしで２００μｌ
（受容体蛋白質２μｇ）を腹腔内注射。標識５８：無菌
条件下に脾臓を摘出し、骨髄腫細胞との細胞融合を得る
ため脾臓　　　　　　　　　　細胞懸濁液を製造。

【００３９】 ３．　　ハイブリドーマの製造 超免疫化ＢＡＬＢ−Ｃ−マウスの脾臓細胞とＮＳＯ−細
胞との融合を、Ｐｅｔｅｒｓその他の処方（“Ｍｏｎｏ
ｋｌｏｎａｌｅ　　Ａｎｔｉｋｏｅｒｐｅｒ”、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ　　Ｖｅｒｌａｇ出版、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅ
ｉｄｅｌｂｅｒｇ在、１９８５）に正確に合わせて５：
１の比率で実施し、標準選択条件（ＨＡＴ−培地）によ
り培養した。全部で４１３の雑種クローンを分離し、微
量滴定板に移した後、ＴＮＦ−Ｒ−正細胞（ＨＬ−６０
）との反応を調べた。

【００４０】 ４．　　ＴＮＦ−Ｒ−特異性のモノクローナル抗体を同
定する選抜法：ＴＮＦ−結合能の変調 １×１０６ＨＬ−６０細胞を雑種培養上澄み（最終濃度
２０％）と３７℃で２時間インキュベートし、上澄みを
遠心分離後吸引濾別し、細胞を４℃で更に６０分間放射
性ＴＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした
。この細胞の特異的ＴＮＦ−結合を未処理の（ＮＳＯ−
上澄み）対照細胞のそれと比較した。４１３の検査クロ
ーンからの（Ｈ３９８）は２回のサブクローン化後安定
なＩｇＧ生産ハイブリドーマであることが判明し、これ
は再生可能にＴＮＦ−結合を遮断する。

【００４１】 ５．　　抗体Ｈ３９８によるＴＮＦ−受容体ｐ６０の免
疫沈降 ２×１０８ＨＬ６０細胞／群をラクトペルオキシダーゼ
法により表面ヨウ素化し、洗浄し、トリトンＸ−１００
（１％）で可溶化した。トリトンＸ−１００−抽出液か
ら、プロト−Ａ−セファロースを用いて前インキュベー
ト（前清澄化）した後（０℃で２時間）、プロト−Ａ−
セファロースと結合したｍＡＫと共にＨ３９８又はＩｇ
Ｇ−対照抗体（スパーＣ）を免疫沈降させ（０℃、１６
時間）、沈殿をトリス緩衝液（２０ｍＭ）、０．１％ト
リトンＸ−１００、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．８）中で３
回洗浄し、ＳＤＳ−プローブ緩衝液中で１００℃で３分
間インキュベートし、上澄みを７．５％ＰＡＧＥ上で非
還元条件下に分離した。図１は乾燥ゲルを６４時間露出
させた後のオートラジオグラムを示すものである。Ｈ３
９８−免疫沈殿のスパーにのみ６０ｋＤで１つの特異的
帯が認められる。免疫沈降ｐ６０は、ヨウ素標識化ＴＮ
Ｆを有する配位子−ブロット中でのＳＤＳ−ゲル電気泳
動後、ＴＮＦαに対し特異的結合特性を有する。

【００４２】 例　　２ 腫瘍壊死因子の細胞傷害及び細胞停止効果に対する抗体
Ｈ３９８の拮抗作用 １．　　ＨｅＬａ−及びＭＣＦ−７−細胞へのＴＮＦの
細胞傷害作用に対するＴＮＦ−拮抗体としてのＨ３９８
ヒトＨｅＬａ−又はＭＣＦ−７−細胞を微量培養［培地
クリックス（Ｃｌｉｃｋｓ）／ＲＰＭＩ（Ｋａｔ．Ｎｏ
．　　Ｔ１２５）０．２ｍｌ中の３×１０４細胞；５％
小牛胎児血清［２つのセラメート（Ｓｅｒａｍｅｄ）、
Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製、Ｂｅｒｌｉｎ、ＦＲＧ在］］で
１８時間前培養し、次いでシクロヘキシミド５μｇ／ｍ
ｌの存在で７時間ＴＮＦ２ｎｇ／ｍｌ（５０ユニット）
及びＨ３９８の連続希釈液で処理した。その後生存細胞
の数をクリスタルバイオレットで着色することにより定
量化した。図２（灰色カラム）は、Ｈ３９８がＨｅＬａ
−細胞を細胞傷害ＴＮＦ−作用から濃度との関連におい
て保護することを示す。比較可能のデータはＭＣＦ−７
で得られたものである（第１表）。

【００４３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　第　　１　　表　　　　１２５Ｉ−ＴＮＦ結
合を有するＨ３９８の、細胞ＴＮＦ−応答に際しての　
　　　競合及び拮抗作用力の対比 細胞系　　　　　　　　　　　　　　ＴＮＦ−結合の　
　　　　　拮抗作用ＴＮＦ　　　　　　　　テスト系　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　競合阻止（１
）　　　　　　への細胞反応　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　（％）　　　　　　　　　　　　
阻止（２）％Ｕ９３７（ヒト）　　　　　　５０　　　
　　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　
　成長抑制Ｋ５６２（ヒト）　　　　　　２０　　　　
　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　
ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ発現Ｃｏｌｏ２０
５（ヒト） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　
　　　　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　
　　　ＨＬＡ−ＤＲ発　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　現ＨｅＬａ（ヒ
ト）　　　　　　８８　　　　　　　　　　　　　　＞
７７（３）　　　　　　細胞毒性ＭＣＦ７（ヒト）　　
　　　　９６　　　　　　　　　　　　　　＞６６（３
）　　　　　　細胞毒性ＹＴ（ヒト）　　　　　　　　
　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　
　　　　　　　　ＩＬ−２受容体　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　発現
Ｌ９２９（マウス）　　　　　　２　　　　　　　　　
　　　　　＜　　５　　　　　　　　　　　　細胞毒性
（１）　　特異的１２５Ｉ−ＴＮＦ−結合の減少を示す
（１２５Ｉ−ＴＮＲ２０ｎｇ／ｍｌをＨ３９８　　１０
μｇ／ｍｌと混合し、１×１０６細胞／バッチで０℃で
１時間インキュベートした）。特異的ＴＮＦ−結合の測
定は記載されているようにして（Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈそ
の他、１９８７）行った。 （２）　　表示した数値は抗体濃度１０μｇ／ｍｌに相
当する１０−３の、Ｈ３９８腹水希釈液で得られた。

【００４４】（３）　　低い腹水希釈液（＜１０−２）
の非特異的毒性副作用によりこの場合高い抗体濃度を使
用できず、従ってＴＮＦ−応答の完全な阻止は得られな
かった。

【００４５】 ２．　　Ｕ９３７−細胞に対するＴＮＦの成長抑制作用
の遮断 腫瘍−壊死−因子はヒトＵ９３７−細胞系に対してイン
ターフェロン−γとの相乗作用で成長阻止作用を示す（
Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒその他、“Ｂｌｕｔ”、５５（
１９７８）、１〜１０）。この細胞（培地０．２ｍｌ中
に５×１０３）をインターフェロン−γ　　１０ｎｇ／
ｍｌ、ＴＮＦ１ｎｇ／ｍｌ及びＨ３９８の連続希釈液の
存在で４８時間培養した。Ｕ９３７−細胞の増殖力を６
時間にわたる３Ｈ−チミジンパルスによって６時間測定
した。Ｈ３９８（１０μｇ／ｍｌ）の存在ではＴＮＦに
より伝達された毛細管血球塞栓は完全に阻止された（第
１表及び図２、黒色カラム）。同様にＨ３９８はＴＮＦ
β（リホトキシン）に対してもまたマウスＴＮＦ（ヒト
細胞に対しても有効である）に対しても保護する。

【００４６】３．　　Ｈ３９８はマウス細胞には何らの
作用も示さない。

【００４７】Ｈ３９８は種特異的であり、ヒト細胞に対
してはＴＮＦ−受容体を示すが、マウス細胞に対しては
示さない（第１表をも参照）。図２（白色カラム）は、
Ｈ３９８がヒトＴＮＦに対する保護作用をマウス細胞に
対してはまったく有さないことを示す。実験バッチはＨ
３９８−抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在又は不存在でＴ
ＮＦを測定するための標準テスト系に相当する（マウス
Ｌ９２９−細胞をアクチノマイシンＤ１μｇ／ｍｌ、１
ｎｇ／ｍｌ　　ＴＮＦの存在で２４時間培養）。

【００４８】 例　　３ ＴＮＦにより誘発された、ＨＬＡ−遺伝子の発現に対す
る抗体Ｈ３９８の拮抗作用 ＨＬＡ−遺伝子のＴＮＦ誘発変調を骨髄由来の細胞系（
Ｋ５６２）及び上皮癌腫細胞系（Ｃｏｌｏ　　２０５）
で検査した。双方の系においてそれぞれの反応を起こさ
せるために、インターフェロン−γでの同時刺激が必要
である（Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒその他、“Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．”、１３８（１９８７）、９７５〜９８０）
。Ｈ３９８の存在で、双方の系においてＴＮＦ−応答を
完全に阻止することができる（第１表をも参照）。

【００４９】１．　　Ｋ５６２でのＴＮＦで強化される
ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗原発現の拮抗体としてのＨ３９８
Ｋ５６２−細胞をインターフェロンγ　　１０ｎｇ／ｍ
ｌ、ＴＮＦ３ｎｇ／ｍｌ及びＨ３９８の連続希釈液の存
在で２４時間培養した（培地２ｍｌ中５×１０５細胞）
。その後細胞を収集し、ＨＬＡ−抗原発現をＨＬＡ−特
異性モノクローナル抗体を用いて流動細胞蛍光写真法で
の間接免疫蛍光分析により定量化した。結果は図３（灰
色カラム）に表わされており、これはＨ３９８　　１０
μｇ／ｍｌ（Ｈ３９８モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｍ
ｌを有する腹水の１０−３希釈液）で、ＴＮＦにより誘
発されるＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−抗原発現の強化が完全に
中和されることを示す。最高値の半分の阻止率は抗体約
１μｇ／ｍｌで達成される。

【００５０】２．　　Ｃｏｌｏ　　２０５−細胞でのＴ
ＮＦで強化されるＨＬＡ−ＤＲ抗原発現に対するＨ３９
８の拮抗作用 実験バッチは上記のものに類似する（ただし培養時間４
８時間、インターフェロン−γ　　０．０２ｎｇ／ｍｌ
、ＴＮＦ１ｎｇ／ｍｌ）。図３に示したデータは同様に
ＴＮＦで誘発された、ＨＬＡ−ＤＲ−遺伝子発現の強化
がＨ３９８　　１０μｇ／ｍｌで完全に相殺されたこと
を示す。この場合最高値の半分の阻止率はＨ３９８約２
μｇ／ｍｌで達成される。

【００５１】 例　　４ ＴＮＦから伝達された免疫刺激に対する抗体Ｈ３９８の
拮抗作用 ＴＮＦの１つの重要な免疫調節機能はＴ−リンパ球及び
いわゆるナチュラルキラー細胞（ＮＫ−細胞）へのイン
ターロイキン−２受容体発現の刺激である（Ｓｃｈｅｕ
ｒｉｃｈその他、“Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、１３８（
１９８７）、１７８６〜１７９０）。この系においても
Ｈ３９８は拮抗作用を有する。ＮＫ−細胞系ＹＴの５×
１０５細胞を培地２ｍｌ中で２４時間、ＴＮＦ１及び１
０ｎｇ／ｍｌ並びにＨ３９８の連続希釈液の存在で培養
した。評価は抗−インターロイキン−２受容体抗体（抗
Ｔａｃ）を用いて細胞蛍光写真法で行った。第１表に示
した結果はＨ３９８によってこのＴＮＦ応答が完全に阻
止されることを証明する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＬ−６０細胞からの分子量６０ｋＤａを有す
るヨウ素標識された膜蛋白質を沈降させる抗体Ｈ３９８
の比反応を示すグラフ図。

【図２】ＴＮＦに起因する細胞傷害又は細胞停止作用の
、抗体３９８による中和作用を示すグラフ図。

【図３】ＴＮＦにより誘発されたＨＬＡ−遺伝子発現の
、抗体Ｈ３９８による中和作用を示すグラフ図。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヒト細胞上の膜蛋白質に対するモノク
   ローナル抗体において、この抗体がＴＮＦ−受容体を有
   するヒト細胞に結合した際に、ＴＮＦα又は／及びＴＮ
   Ｆβの公知作用を少なくとも十分に中和することを特徴
   とするモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】　　この抗体がＴＮＦα又は／及びＴＮＦ
   βにより刺激された細胞傷害及び細胞停止作用を少なく
   とも十分に中和する請求項１記載のモノクローナル抗体
   。
3. 【請求項３】　　この抗体がＴＮＦα又は／及びＴＮＦ
   βにより刺激された、ＨＬＡ−遺伝子の発現を少なくと
   も十分に中和する請求項１記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】　　この抗体がＴＮＦα又は／及びＴＮＦ
   βにより伝達された、Ｔ−リンパ球及びナチュラルキラ
   ー細胞の免疫刺激を少なくとも十分に中和する請求項１
   記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】　　ハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ９０
   ０２１６１７により表現されるモノクローナル抗体Ｈ３
   ９８。
6. 【請求項６】　　請求項１から５までのいずれか１項記
   載のモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有すること
   を特徴とする抗体特性を有する蛋白質。
7. 【請求項７】　　実際に請求項５記載のモノクローナル
   抗体と同じ抗原−結合部位を有する請求項６記載の抗体
   特性を有する蛋白質。
8. 【請求項８】　　ハイブリドーマ細胞系ＥＣＡＣＣ９０
   ０２１６１７。
9. 【請求項９】　　請求項１から５までのいずれか１項記
   載のモノクローナル抗体を作製する方法において、常法
   で骨髄腫細胞を、予めヒト細胞からのアフィニティ精製
   されたＴＮＦ−受容体物質で超免疫化されたマウスの脾
   臓細胞又はＢ−細胞と融合させることを特徴とする、モ
   ノクローナル抗体の作製法。
10. 【請求項１０】　　ＴＮＦ−受容体物質をアフィニティ
    精製するためまずヒト細胞を均一化し、膜をホモジネー
    トから分離し、次いで非イオン界面活性剤を含む可溶化
    緩衝液で処理する請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】　　非イオン界面活性剤としてトリトン
    Ｘ−１００を使用する請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】　　ＴＮＦ−受容体物質を、固定化され
    たＴＮＦが存在するＴＮＦ−アフィニティカラムを介し
    て精製する請求項９から１１までのいずれか１項記載の
    方法。
13. 【請求項１３】　　組換えヒトＴＮＦαを使用する請求
    項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】　　ＴＮＦ−受容体物質をアフィニティ
    クロマトグラフィ処理後、更にアセトン降下により精製
    する請求項９から１３までのいずれか１項記載の方法。
15. 【請求項１５】　　請求項１から５までのいずれか１項
    記載のモノクローナル抗体又は／及び請求項６又は７に
    記載の抗体特性を有する蛋白質を有効成分として、場合
    によっては常用の担持剤、助剤又は／及び填料と共に含
    むことを特徴とする癌、炎症、免疫系疾患、ショック状
    態及びエイズ治療薬。
16. 【請求項１６】　　個体に対して有効成分０．１〜１０
    ０ｍｇの量で投与する請求項１５記載の治療薬。