JPH04197174A - 硝酸菌培養液及び同菌の高濃度培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は水産動物の畜養・輸送設備、水族館等の閉鎖系
循環水の浄化に寄与する硝化細菌（硝化菌という）のう
ち硝酸菌を高濃度に培養する方法に関し、廃水、下水お
よびし尿処理設備などの活性汚泥、土壌、海水および河
川水など自然界に広く分布する硝酸菌を高濃度に培養す
る際にも利用できる方法に関する。

〔従来の技術〕

硝化菌はアンモニアまたは亜硝酸を亜硝酸または硝酸に
酸化し、二酸化炭素を唯一の炭素源として菌体成分を合
成する独立栄養細菌であり、有機物が共存すると硝化菌
の増殖と硝化作用は阻害されるといわれてきた。

硝化菌にはアンモニアを酸化して亜硝酸塩にするアンモ
ニア酸化細菌（以下「亜硝酸菌」という）と、亜硝酸塩
を酸化して硝酸塩にする亜硝酸酸化菌（以下「硝酸菌」
という）の２つの細菌群からなる。それぞれの硝化反応
はつぎの式で表される。

（ａ）　　亜硝酸菌のアンモニア酸化反応ＮＨ４”＋　
３／　２０２−　’ＮＯ２−＋　２８”＋　８２０＋　
３９．５ｋｃａｌ（ｂ）　　硝酸菌の亜硝酸酸化反応 ＮＯ２−＋　１／２０２−　Ｎ（１３−＋　２１．６ｋ
ｃａｌ硝化菌を廃水などの浄化に利用するためには、そ
れらの硝化性能を発揮させるだけの菌量をまず得なけれ
ばならない。水産動物の畜養・輸送設備、水族館等の閉
鎖系循環水、廃水、下水およびし尿処理などの場合は、
それらの水中に硝化菌が微量ながらも存在しており、ア
ンモニア（ＮＨ，＋）とそれに見合ったリン（ＰＯ，−
’）および酸素（口、）があって、適当な水温に保てば
硝化菌は自然に増殖してくる。　　　。

しかしこの方法によると、硝化性能が十分に発揮できる
硝化菌量に達するまで（この期間を「馴致期間」という
）に通常３〜６か月も要する。硝化装置の馴致期間を短
縮するために、硝化性能が十分に発揮できる硝化菌量に
達した他の硝化装置から硝化菌を植種する方法がある。

この場合でも馴致期間は通常１〜３か月も要する。

〔発明が解決しようとする課題〕

（１）　　アンモニア含有水硝化装置の馴致期間が、有
機物廃水の浄化装置に比べて極めて長い（硝化装置では
１〜３か月、有機物廃水浄化装置では１０〜２０日）。

その原因は次のとおりである。

有機物含有廃水浄化装置などの従属栄養細菌は有機化合
物を資化して増殖する。その場合除去された有機化合物
単位重量あたりの増菌重量すなわち菌体収率（または余
剰汚泥発生率ともいう）は、化合物の種類によって異な
るが概ね０．３〜０．６ｇ菌／ｇ有機物である。

それに比べてアンモニア含有水硝化装置などに含まれる
亜硝酸菌の菌体収率は０．０６〜０、１３　ｇ亜硝酸菌
／ｇ除去ＮＨ，−Ｎと低く、特に硝酸菌の菌体収率は０
．０２〜０．０７　ｇ硝酸菌／ｇ除去Ｎ０２−Ｎとはる
かに低い。

また硝化菌は従属栄養細菌に比べて増殖が遅い。たとえ
ば平均世代時間（１個の菌が２個の菌に分裂するのにか
かる平均的な時間）は、従属栄養細菌では１５〜３０分
間に対し、硝化菌では１２〜２４時間以上である。その
ため硝化装置内で硝化性能を十分に発揮するだけの硝化
菌量が増えるのに長時間を要する。

特に硝酸菌は増殖が遅いため、馴致初期の処理水には亜
硝酸イオン（ＮＯ２−）が増加する。

亜硝酸イオン（ＮＯ２−）はアンモニアに劣らず生物に
対して毒性が高く、できるだけその発生を抑制しなけれ
ばならない。

（２）硝化装置からの亜硝酸イオン（Ｎｏｗ−）の発生
をおさえ、馴致期間を短縮するためには、硝化性能を十
分に発揮するだけの亜硝酸菌と特に硝酸菌量をあらかじ
め準備しておき、起動時の装置に投入すればよい。因み
に従来の廃水などの硝化装置の場合は、すでに硝化性能
が十分に発現している別の設備の活性汚泥を起動時の装
置に投入し馴致期間の短縮を図っていた。

水産動物の畜養・輸送設備、水族館等の閉鎖系循環水浄
化のための硝化菌を馴致する場合、食用魚の魚病や食中
毒の発生などを避けるために、廃水およびし尿の硝化装
置活性汚泥をそのまま用いることはできないので、他の
水産動物の畜養設備または廃水もしくはし尿の硝化装置
活性汚泥から単離した（魚病や食中毒を引き起こす細菌
を含まないように単離した）硝化菌を用いる必要がある
。

しかし硝化菌、特に硝酸菌は上記のとおり菌体収率が低
く増殖が遅いため、長時間培養しても低濃度の菌液しか
得られないという欠点があった。そのため大量の菌液を
運搬するしかなく実現は難しかった。

また低濃度で大容量の硝化菌液を、凝集沈殿または遠心
分離により高濃度にする方法があるが、この方法は経済
性に問題がある。

（３）硝化装置の馴致が完了し定常運転に入ってからも
、系内のなんらかの原因により硝化菌がダメージを受は
硝化性能が低下することがある。特に硝酸菌がダメージ
を受けた場合・処理水には亜硝酸イオン（ＮＯ２−）が
リークし問題が生ずる。その場合性能回復に要する時間
は、有機物廃水浄化装置などに比べて長時間を要する。

これも硝酸菌の菌体収率が低く増殖が遅いことによる。

性能回復に要する時間を短縮するためには、硝化性能を
十分に回復するだけの高濃度の硝化菌を系内に再度供給
すればよいが、従来低濃度の菌液しか得られなかったた
め、その実現は難しかった。

本発明は以上の問題点を解決するために、硝化菌のうら
硝酸菌の高濃度培養液を得る方法を提供しようとするも
のである。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明は硝酸菌を培養し増菌させる方法において、 （１）　　ピルビン酸もしくはその塩、クエン酸もしく
はその塩、オキサル酢酸もしくはその塩、イソクエン酸
もしくはその塩、２−オキソグルタル酸もしくはその塩
、コハク酸もしくはその塩、フマル酸もしくはその塩、
リンゴ酸もしくはその塩、グリオキシル酸もしくはその
塩、酢酸もしくはその塩、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ
）もしくはその塩、 （２）　Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、α−Ｌ−
ラムノース、 （３）　　α−Ｌ−ラムノース１分子、Ｄ−グルクロン
酸１分子およびＤ−グルコース２分子を１ユニットとし
、該ユニットが直鎖状に重合した高分子多糖類 のうち少なくとも１種類以上の有機化合物を含む培養液
で硝酸菌を培養することを特徴とする硝酸菌の高濃度培
養方法である。

〔作　用〕

（１）高能力の硝酸菌をあらかじめ単離しておくことに
より、下記の特定有機化合物を添加して硝酸菌のみを高
濃度に増殖させられる。

（２）特定有機化合物によって硝酸菌の増殖能力が促進
され、従来の方法では得られなかった高濃度の硝酸菌液
が比較的短時間で得られる。

なお特定の有機化合物による硝酸菌増殖促進のメカニズ
ムはまだ不明≠ある。おそらくこれらの特定有機化合物
は従属栄養細菌では他の有機化合物から容易に生合成さ
れるが、硝酸菌では代謝経路の違いからその生合成られ
るのに相当の時間を要する有機化合物ではないかと考え
られる。

〔実施例１〕 以下に硝酸菌の代表菌株（Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ａ
ｇｉ−１ｉｓ　ＡＴＣＣ１４１２３）を例にとって、本
発明の一実施例を説明する。

なお実施例での硝酸菌の培養は第１表に示す高圧滅菌し
た培地１）（以下「Ｐ改培地」という）を用いて、すべ
て無菌的に操作した。

注１）下記のレープイスおよびプレイマーの亜硝酸菌培
地組成を参考にした。Ｌｅｗ　ｉｓ。

Ｒ，Ｆ、ａｎｄ　Ｄ、Ｐｒａｍｅｒ、　１９５８．　”
ｌ５ｏｌａｔｉｏｎｏｆ　Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　
ｉｎ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　”　。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１９．　７６、　５２４−５２８
第　　１　　表 ＮａＮＬ　　　　１．０　ｇ ＫＨ２ＰＯ１０，７ｇ ＮａＪＰ［］、”　１２ＬＩｌ）　　３４．５ｇＭｇ５
Ｏ４−７Ｈ２０’５０　ｍｇ ＣａＣｌ・２ＬＤ　　　５．０　ｍｇ ＮａＣｌ　　　　３００　ｍｇ ＭｎＳＯｌ”４Ｈｚ０　　２　ｍｇ ＥＤＴＡ−Ｐｅ（１３，８％）　　１　ｍｇ蒸留水　　
　　　　　１１ ｐ８　　　　　　　　　７．５ 培地（第１表）であらかじめ３日間前培養しておいた硝
酸菌液１０ｍ１！を新鮮培地１００ｄｌこ加え、三角７
ラスク（２００ｍｌ容）に２０１ｄを分注した。

ついで添加濃度が１ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭとなる
ようにろ過滅菌したピルビン酸ナトリウム溶液を加え、
温度３０℃、回転数１２　Ｏｒｐｍで９７時間回転培養
した。

これらの培養液について培養開始時と終了時における菌
濃度を測定した。なお菌濃度はペトロフハウザー菌数計
数盤による直接計数法によった。

添加物質がオキサロ酢酸、クエン酸三ナトリウム２水塩
、イソクエン酸三ナトリウム永和物、２−オキソグルタ
ル酸、コハク酸ナトリウム６水和物、フマル酸−ナトリ
ウム、Ｌ−リンゴ酸二ナトリウム永和物およびグリオキ
シル酸−水和物の場合も、上記と同様に各種濃度に設定
し試験を行った。

また比較のだ約、これと並行して添加物質を含まない亜
硝酸菌のみの培養液（コントロール）についても増殖試
験を行った。

その結果を第２表に示す。

いずれの添加物質も適当な濃度に設定すれば、硝酸菌濃
度がコントロールに比べて著しく高くなり、硝酸菌の増
殖促進効果が認められた。

第２表 第　２　表（続き） 注）表中の添加物質名はすべて略名である。

〔実施例２〕 酢酸ナトリウム１ｒｎＭ、５ｍＭおよび１０ｒｎＭ、ア
デノシン三すン酸ニナトリウム３水和物（ＡＴＰ）が５
ｍｇ／ｉ！、　　２５ｍｇ／ｉ’および５０ｍｇ／Ｉｌ
となるように添加した培地について、前培養３日間の硝
酸菌を増殖し、実施例１と同様にして７２時間培養した
。

この結果を第３表に示す。

注）表中の添加物質名はすべて略名である。

〔実施例３〕 Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースおよびα−Ｌ〜ラム
ノースがそれぞれ１ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭとなる
ように添加した培地について、前培養３日間の硝酸菌を
植種し、実施例１と同様にして７２時間培養を行った。

この結果を第４表に示す。

第　　４　　表 注）表中の添加物質名はすべて略名である。

〔実施例４〕 Ｐｓｅｕｄｏｍｏ６ａｓ　ｅｌｏｄｅａ（ＡＴＣＣ３１
４６１）が産生ずる粘液物質を脱アセチル化し精製して
得られた高分子多糖類（和光純薬製商品名ニゲランガム
）を用いて硝酸菌の増殖試験を行った。この物質は高分
子多糖類は、α−Ｌ−ラムノース１分子、Ｄ−グルクロ
ン酸１分子およびＤ−グルコース２分子を１ユニットと
し、該ユニットが直鎖状に重合した高分子多糖類（平均
重量分子量は６５万）である。この物質が０．１．０．
２．０゜５および１．０％となるように加えた培地（第
１表）に前培養３日間の硝酸菌を植種し、実施例１と同
様にして２時間培養した。その結果を第５表に示す。

これよりゲランガムがいずれの濃度のときでも、硝酸菌
濃度がコントロールよりも高かった。

なおこの高分子多糖類を７５％エタノールで殺菌し、上
記と同様にして培地に加えて培養したところ、第５表と
ほぼ同じ結果が得られた。

第　　５　　表 〔発明の効果〕 （１）　　従来の無機化合物（アンモニア）による硝酸
菌の培養では、最終開度が１．１〜４．８×１０　”ｃ
ｅｌｌｓ／　ｍｌとあるのに比べて、本発明では従来と
同じ培養時間で４，８Ｘ１０’〜２．０×１０″’ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｊ！と従来の２〜１８倍も高い菌濃度が得ら
れる。

（２）従来と同じ培養時間で高濃度の硝酸菌液が得られ
るため、従来と同じ硝化菌数であっても凝集沈殿または
遠心分離処理をすることなく、より小容量の硝酸菌液を
起動時またはダメージを受けた時の硝化装置に供給する
ことが可能となる。また従−来よりも小容量であっても
、はるかに大量の菌数を該硝化装置に供給することも可
能となる。

そのため起動時の硝化装置の馴致期間が２、〜３週間、
ダメージをうけた硝化装置の能力回復は１〜２週間と著
しく短縮される。

（３）従来では水産動物の畜養・輸送設備等の閉鎖系循
環水からあらかじ約硝化能力が高い硝酸菌の優占種を培
養して増菌するのに通常６〜１２か月を要した。

しかし本発明を利用すれば、単離・培養に要する時間は
２０〜３０日間に短縮できる。

（４）高濃度で小容量の硝酸菌液だから、スペースをと
らずに低温で保存することが可能となる。それによって
従来と（ま比較にならないほど、設備の起動および硝化
菌のダメージ回復に迅速に対応することが可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 硝酸菌を培養し増菌させる方法において、 （１）ピルビン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはそ
   の塩、オキサル酢酸もしくはその塩、イソクエン酸もし
   くはその塩、２−オキソグルタル酸もしくはその塩、コ
   ハク酸もしくはその塩、フマル酸もしくはその塩、リン
   ゴ酸もしくはその塩、グリオキシル酸もしくはその塩、
   酢酸もしくはその塩、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）も
   しくはその塩、 （２）Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、α−Ｌ−ラ
   ムノース、 （３）α−Ｌ−ラムノース１分子、Ｄ−グルクロン酸１
   分子およびＤ−グルコース２分子を１ユニットとし、該
   ユニットが直鎖状に重合した高分子多糖類 のうち少なくとも１種類以上の有機化合物を含む培養液
   で硝酸菌を培養することを特徴とする硝酸菌の高濃度培
   養方法。