JPH041737B2

JPH041737B2 -

Info

Publication number: JPH041737B2
Application number: JP59099648A
Authority: JP
Inventors: Daburyuu Rasunitsuku Deebitsudo
Original assignee: PUROTOTETSUKU Inc
Current assignee: PUROTOTETSUKU Inc
Priority date: 1983-05-19
Filing date: 1984-05-17
Publication date: 1992-01-14
Also published as: JPS6034938A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般にフルオロケトンに関し、より詳
細にはα−アミノフルオロケトンに関する。プロテアーゼは重要な種類の酵素であり、多く
の病気、たとえばこれに限定されるものではない
が肺気腫と関連を有する：Mitmen，C.編（1972
年），Pulmonary Emphysema and
Proteolysis，Academic Press，New York；
Turino，G.M.，Rodriguez，J.R.，Greenbaum，
L.M.，及びMandl，I.（1974年）．Am.J.Med.57，
493；及びHance，Ａ，J.，及びCrystal，R.G.
（1975），Am.R.Resp.Disease112，657を参照。
白血球エラスターゼは肺気腫における組織破壊の
大部分に関与すると信じられている。種々のプロ
テアーゼが同一もしくは類似の病変に関与してい
る。他のプロテアーゼ、カテプシンＧは肺に存在
し、エラスチン線維を消化する能力を有する。プロテアーゼ阻害物質（天然に存在するものお
よび合成のものを含む）は、プロテアーゼの反応
性部位に作用してその酵素活性を阻害する。近年、研究者らにより、多くの合成阻害剤の合
成が報告されている。ペプチド・クロロメチル・
ケトン（α−アミノ−クロロメチル−ケトン）類
が合成され、そしてこれら化合物のあるものは豚
膵臓エラスターゼ、カテプシンＧおよびヒト白血
球エラスターゼを阻害することが見出されてい
る。Thompson，R.C.，及びBlout，E.R.（1973
年），Biochemistry12，44；Thompson，R.C.
（1973年），Biochemistry12，47；Powers，J.C.，
Gupton，B.F.，Harley，A.D.，Nishimoto，N.
及びWitley，R.J.（1977年），Biochem.Biophys.
Acta.525，156；Lively，M.O.，及びPowers，J.
C.（1978年），Biochem.Biophys.Acta.525，171；
Yoshimura，T.，Barber，L.N.，及びPowers，
J.C.（1982年），J.Biol.Chem.257，5077；及び
Teshima，T.，Griffin，J.C.，及びPowers，J.
C.（1982年），J.Biol.Chem.257，5085参照。 α−アミノ・クロロメチル・ケトン類も合成さ
れ、エラスターゼの生理学的ならびに病理学的役
割を研究するため使用されている。Janoff，A.，
Blondin，J.，Sandhaus，R.A.，Mosser，A.，
およびMalemud，C.（1975年），Proteases and
Biological Control（Reich，E.，Rifkin，D.B.，
およびShaw，E.共編），603−620頁、Cold
Spring Harbor Laboratory，New York参照。 α−アミノ・クロロメチル・ケトンは、阻害剤
としては病気治療に見込みがないことが示され
た。これらは強親電子的であり、生体内条件下に
て存在する標的以外の分子を非選択的にアルキル
化してしまう。このような非選択的アルキル化を生じない阻害
剤の開発が強く望まれている。フルオロケトンが
所望の弱いアルキル化作用を有するであろうとい
うことは予想されていた。種々の転換反応におけ
るＦ／Cl比に関する検討は、Hudlicky，M.
（1971年）、Organic Fluorine Chemistry，
Plenum Press，New Yorkにて行なわれてい
る。 α−アミノフルオロケトンを合成する試みは、
従来不成功に終つている：Powers，J.C.（1977
年），Chemistry and Biochemistry of Amino
Acids，Peptides and Proteins（Weinstein，B.
編），Vol.4，65−178頁，Marcel Dekker.New
York参照。そのような、合成法は、一般にα−アミノクロ
ロメチルケトンのClをＦに置き換える慣用の置換
反応によつて試みられた。その結果はアミンまた
はペプチド部分が破壊され失敗であつた。ある合
成例においては、KFおよび18−クラウン−６−
エーテル（Aldrich Chemical Company，
Milwaukee，Wisconsin）により、ペプチドクロ
ロメチルケトン上のClをＦで置換するために、小
過剰量のKFを用い、溶液を10ないし12時間還流
する方法が試みられたが、置換は生じなかつた。 α−アミノクロロメチルケトンの合成において
は、アミノジアゾメチルケトンが所望の最終生成
物を合成するためにHClで処理される。この方法
によりアミノフルオロメチルケトンを合成する試
みは（HClの代りにHFを用いる試み）、不成功に
終ることが判明した。従つて、ペプチドα−アミ
ノフルオロケトンの存在は従来知られていなかつ
た。そのような種類の化合物を提供することは、
技術進歩に資するものである。本発明の目的は、新規種類の化合物であるα−
アミノフルオロケトンを提供するものである。本発明の他の目的は、α−アミノフルオロメチ
ルケトンを提供することである。さらに別の目的は、単一のアミノ酸残基または
１ないし６個のアミノ酸のペプチド残基を有する
α−アミノフルオロケトンを提供するものであ
る。さらに別の目的は、α−アミノフルオロケトン
の合成方法を提供することである。さらに別の目的は、セリンプロテアーゼまたは
システインプロテアーゼを非可逆的に阻害する方
法を提供することである。さらに別の目的は、セリンプロテアーゼを非可
逆的に阻害する方法を提供することである。上記目的およびその他の目的を達成するため、
本明細書に実施態様として並びにより広い範囲で
説明する本発明の方法においては、本発明のα−
アミノフルオロケトンは、次式(a)、(b)、(c)
または(d)：（式中、R₁およびR₂は各々独立して、水素原
子、炭素原子数１ないし６のアルキル基、炭素原
子数１ないし６の置換アルキル基、アリール基、
アルキル部分の炭素原子数が１ないし４のアルキ
ルアリール基よりなる群から選ばれ、ｎは１ない
し４の整数を表わし、Ｘはペプチド末端のブロツ
キング基を表わし、そしてＹはアミノ酸残基もし
くは１ないし６個のアミノ酸のペプチド鎖残基を
表わす）で表わされる。本発明の別の観点によれば、式(a)−(d)で表
わされるα−アミノフルオロケトンは、Ｎ−アシ
ルアミノ酸またはそのペプチド誘導体を、約２当
量の無水フルオロ酢酸とともに、不活性溶媒に懸
濁させて合成される。この溶媒は、Ｎ−アシルア
ミノ酸またはそのペプチド誘導体の大体の重量に
対して等しい量で添加される。次に第三アミンを
Ｎ−アシルアミノ酸またはペプチド誘導体の約２
当量相当量添加し、約０℃の温度に冷却する。そ
の後、触媒量の置換４−ジアルキルアミノピリジ
ン触媒を添加して目的ケトンを合成する。本発明の別の観点によれば、プロテアーゼを含
有する試料を、プロテアーゼ阻害条件下において
式(a)、(b)、(c)または(d)で表わされる前記
化合物と、該プロテアーゼを阻害するに十分な量
で接触させることよりなる、プロテアーゼ阻害方
法が提供される。本発明のα−アミノフルオロケトンは、システ
インプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼを非
可逆的に阻害する。本発明のケトンは強い電子親
和性は有しておらず、このため、生体内または生
体外の各条件において非標的分子を無差別にアル
キル化することがない。本発明のα−アミノフル
オロケトンは治療に有効なプロテアーゼ阻害剤の
製造に適用可能である。より具体的には、本発明
のα−アミノフルオロケトンは、カテプシンＢ，
Ｈ，Ｃ，Ｇ，Ｒ；エラスターゼ；トリプシン；血
漿カリクレイン；腺カリクレイン；プラスミン；
プラスミノーゲンアクテイベーター；その他のセ
リンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼ
を阻害するために有用であるが、これらに限定さ
れるものではない。本発明は、新規α−アミノフルオロケトン、そ
の合成法およびプロテアーゼを非可逆的に阻害す
る方法を提供する。本明細書において、阻害とは
阻害剤（α−アミノフルオロケトン）がプロテア
ーゼの認識部位に最初に結合し、次いで酵素の活
性部位にα−フルオロメチルケトンが非可逆的に
共有結合することと定義される。下記第１表に、本明細書中で用いる略号の意味
を示す。

【表】

【表】本発明のα−アミノフルオロケトンは、次式
(a)〜(d)：（式中、R₁およびR₂は各々独立して、水素原
子、炭素原子数１ないし６のアルキル基、炭素原
子数１ないし６の置換アルキル基、アリール基、
アルキル部分の炭素原子数が１ないし４のアルキ
ルアリール基よりなる群から選ばれ、ｎは１ない
し４の整数を表わし、Ｘはペプチド末端のブロツ
キング基を表わし、そしてＹはアミノ酸残基もし
くは１ないし６個のアミノ酸のペプチド鎖残基を
表わす）で表わされる。本明細書中、置換アルキル基とは、水酸基、ア
ミノ基、グアニジノ基、カルボキシル基またはメ
ルカプト基が炭素原子数１ないし６のアルキル基
に結合した基である。適当なペプチド末端ブロツキング基（Ｘ）、即
ち、ペプチド保護基は、当技術分野で公知であ
る。ペプチド末端ブロツキング基とは、本明細書
において、アミノ酸に結合していてもよく、ペプ
チド鎖に結合していてもよい。適当なペプチド末
端ブロツキング基は、The Peptides，
Synthesis，Biology（Gross，E.および
Meienhofer.J.，共編），Vol.3（1981年），
Academic Press，New Yorkに列挙されてい
る。Ｘは好ましくは、アセチル基、ベンゾイル基、
カルボベンゾキシ基、グルタリル基、ｔ−ブトキ
シカルボニル基、スクシニル基、メトキシスクシ
ニル基、Ｄ−Pro、Ｄ−Val、Ｄ−Ala、Ｄ−Phe
である。より好ましくは、Ｘはベンゾイル基、ｔ−ブト
キシカルボニル基、メトキシスクシニル基または
カルボベンゾキシ基から選ばれる。 R₂は好ましくは水素原子である。Ｙは好ましくはアミノ酸またはアミノ酸１ない
し４個のペプチド鎖の残基である。上記式(c)および(d)で表わされる化合物が好
ましい。本発明のα−アミノフルオロケトンは、Ｃ−Ｃ
結合の形成により合成され、Ｃ−Ｆ結合の形成に
より合成されるものではない。一態様において、式(a)ないし(d)のα−アミ
ノフルオロケトンは、Ｎ−アシルアミノ酸または
そのペプチド誘導体を、約２モル当量の無水フル
オロ酢酸とともに、前記Ｎ−アシルアミノ酸また
はそのペプチド誘導体の重量と約同重量の量の不
活性溶媒中に懸濁させて合成される。適当な溶媒
の非限定的具体例は、ベンゼン、トルエン、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルム、ジ
クロロメタン、酢酸エチル等である。好ましい溶
媒はベンゼンである。次いで、２当量の第三アミ
ンを添加して溶液とするが、その際約０℃に冷却
しながらオキサゾロンの形成速度を調節する。第
三アミンの非限定的例示として、トリエチルアミ
ン、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチレンジアミ
ン等が挙げられる。好ましいものは、トリエチル
アミンである。触媒量の４−ジアルキルアミノピ
リジン触媒を添加し、冷却を終了する。４−ジア
ルキルアミノピリジンの非限定的例示として４−
ジメチルアミノピリジンおよび４−ピロリジノピ
リジンがあげられる。４−ジメチルアミノピリジ
ンが好ましい。激しい炭酸ガス発生が起る。得ら
れた溶液を室温で約２時間攪拌し、次に水不混和
性溶媒を加えて約10倍に希釈する。溶媒の非限定
的例示として、ベンゼン、トルエン、クロロホル
ム、ジクロロメタン、酢酸エチル等があげられ
る。好ましい溶媒はベンゼンである。生成した有
機溶液を希酸で洗浄し、続いて希塩基で洗浄し、
さらに飽和NaClで洗浄し、ひき続き例えば
MgSO₄で乾燥して、α−アミノフルオロケトン
を不純物から分離する。溶媒を留去し、α−アミ
ノフルオロケトンを精製する。式(a)および式(b)のα−アミノフルオロケト
ンは、さらに第三ブチルフルオロアセテートまた
はベンジルフルオロアセテートのエノレート
（enolate）を、活性化Ｎ−ウレタン保護アミノ酸
と、非親核溶媒中、約−10ないし０℃で約１時間
反応させて合成することができる。活性化アミノ
酸とは、アシル化剤であると定義される。反応混
合物を約０℃で希酸処理して分解し、次いで水不
混和性溶媒で抽出し、希塩基、次いで水により洗
浄する。得られた有機溶液を乾燥し、溶媒を留去
し、α−アミノフルオロケトンを精製する。こう
して製造されたケトンは、式(c)および(d)のα
−アミノフルオロケトンの前駆体とすることもで
きる。好ましいエノレートの非限定的例示として、第
三ブチルフルオロアセテートの、およびベンジル
フルオロアセテートのエノレート誘導体が含まれ
る。エノレートは、不活性溶媒中で、カリウム第
三ブトキシドおよび水素化ナトリウムのような強
塩基で処理する慣用法で製造できる。アミノ酸を
活性化する好ましい方法は、混合無水カルボン酸
法、対称無水物法、カルボジアミド法、カルボニ
ルジイミダゾール法等があるが、これらに限定さ
れるものではない。本発明のα−アミノフルオロケトンは、システ
インおよびセリンプロテアーゼの非可逆的阻害に
有用である。プロテアーゼの非限定的具体例は、
カテプシンＢ，Ｈ，Ｌ，Ｇ，Ｒ；エラスターゼ、
トリプシン、血漿カリクレイン、腺カリクレイ
ン、プラスミン、プラスミノーゲンアクテイベー
ターおよびその他がある。本発明のα−アミノフルオロケトンは、インビ
トロ条件でプロテアーゼ阻害条件下に接触させる
と、フツ素原子の親核置換によつて、阻害剤とし
てプロテアーゼとの間に共有結合を形成する。こ
の共有結合は、プロテアーゼの活性部分において
形成される。この酵素活性部位には、該プロテア
ーゼの共有結合性活性化に先だつて可逆的な酵素
−阻害剤複合体が形成される。各場合に、プロテ
アーゼの活性部位はアルキル化される。システインプロテアーゼおよびセリンプロテア
ーゼの各々は異なる幾何学構造を有するが、プロ
テアーゼの反応性部位（阻害剤によりアルキル化
される部位）は実質上同じである。このプロテア
ーゼ反応性部位において、α−アミノフルオロケ
トンのＦの置換が生ずるのである。本発明のケト
ンは一つのアミノ酸のものであつても、ペプチド
鎖のものであつてもよい。したがつて、ケトンの
幾何学構造が、プロテアーゼの幾何学構造に適合
しうるように、その構造を変えることができる。
しかしながら、各々の場合において、ケトンとプ
ロテアーゼの反応性部位は同一である。本発明のシステインプロテアーゼまたはセリン
プロテアーゼを阻害する方法は、上記式(a)−
(d)のα−アミノフルオロケトンを、プロテアーゼ
の反応性部位を阻害するに十分な量で、プロテア
ーゼ阻害条件下においてプロテアーゼと接触させ
ることよりなる。プロテアーゼ阻害条件とは、約
４−10のPH、好ましくは約６−９のPH、最も好ま
しくは約６−８のPHにおいて、該プロテアーゼお
よびα−アミノフルオロケトンを、α−アミノフ
ルオロケトンとプロテアーゼの相対濃度を当量比
で約１：１ないし約60：１にして、約20−37℃、
好ましくは約25℃の温度でインキユベートするこ
とをいう。ケトン阻害剤とプロテアーゼとの相対
比は、阻害が生ずるための時間ならびに特定のプ
ロテアーゼ／ケトンの組合せにより異なる。プロ
テアーゼは精製状態、分析試料中またはホモジナ
イズ組織の試料中に存在する状態であつてよい。以下の実施例により、本発明の種々の態様を示
すが、本発明の範囲は特許請求の範囲の記載によ
り定まるものであつて、これら実施例のみには限
定されるものでない。第２表に、実施例１−21で合成した式(a)−
(d)のα−アミノフルオロケトンの置換基をまとめ
て示す。

【表】
ル
実施例１ Bz−AlaCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−ベンゾイルアミノ）−１−フルオロ
−２−ブタノン〕Ｎ−ベンゾイルアラニン（8.25ｇ、42.8mmol）
および無水フルオロ酢酸（11.8ｇ、85.6mmol）
を混合し、ベンゼン10mlで処理した。トリエチル
アミン（11.9ml、85.6mmol）を加えて溶液を得、
氷浴で冷却した。４−ジメチルアミノピリジン
（0.26ｇ、2.15mmol）を添加し、氷浴を取り除い
た。直ちに激しいCO₂の発生が起つた。溶液を室
温で２時間攪拌した。ベンゼン（100ml）を加え
た。有機溶液を1NHCl（２×50ml）で洗浄し、飽
和NaHCO₃（２×50ml）で洗浄して、無水MgSO₄
で乾燥した。溶媒を留去し、生じた油状物をシリ
カゲル（60メツシユ）のカラム（2.5×80cm）に
通した。Bz−AlaCH₂Fをクロロホルムで溶離し
た。クロロホルムを留去し、残渣を石油エーテル
で粉砕処理して67ないし69℃で融解する固体を得
た。 ¹H NMR（CDCl₃）によれば、TMSからシフ
トするピークは次のとおりであつた：δ1.51（3H，
d.−CH₃），5.07（2H，ｄ，J_HF＝47.4Hz，−
CH₂F），5.09（1H，ｍ，−CH−），6.88（1H，ブロ
ードｓ，NH），7.52（3H，ｍ，芳香族）、7.74
（2H，ｍ，芳香族）。 ¹³C NMR（CDCl₃）によれば、TMSからシフ
トするピークは次のとおりであつた：δ16.9（−
CH₃，51.7，

【式】），83.7（−CH₂F J_CF＝ 18.4.3Hz），127.2（芳香族），128.6（芳香族），130.
2
（芳香族），132.1（芳香族）。対照を用いずに行つた¹⁹F NMR（CDCl₃）によ
れば、トリプレツトを示した；J_HF＝47.4Hz。IR
（KBrペレツト）によれば1751cm^-1（ケトンカルボ
ニル）および1632cm^-1（アミドカルボニル）の吸
収ピークを示した。分析値 C₁₁H₁₂FNO₂に対して、計算値 C63.15，H5.78，N6.69，F9.08 測定値 C62.42，H5.80，N6.52，F9.37 実施例２Ｚ−Phe−AlaCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルフエニ
ルアラニルアミド）−１−フルオロ−２−ブタノ
ン〕Ｎ−ベンジルオキシカルボニルフエニルアラニ
ル−アラニン（3.0ｇ、8.11mmol）および無水フ
ルオロ酢酸（2.24ｇ，16.22mmol）を混合し、ベ
ンゼン（30ml）で処理した。室温でトリエチルア
ミン（1.64ml，16.22mmol）を添加して溶液を得
た。４−ジメチルアミノピリジン（50mg，
0.41mmol）を添加した。溶液を室温で２時間攪
拌した。ベンゼン（100ml）を添加した。有機溶
液を1NHCl（２×50ml），飽和NaHCO₃（２×50
ml），飽和NaCl（２×50ml）で洗浄し、無水
MgSO₄で乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリ
カゲル（60メツシユ）の2.5×60cmのカラムに通
した。Ｚ−Phe−AlaCH₂Fをクロロホルム中の
２％メタノールで溶離した。溶媒を留去し、残渣
をエーテルから結晶化させて融点129−131℃の生
成物0.24ｇを得た。 ¹H NMR（CDCl₃）のTMSからシフトピー
ク：δ1.24（3H，ｄ ofd，

【式】），3.06 （2H，ｄ，Ph−CH ₂−Ｃ），4.51（2H，ｍ，

【式】），4.91（2H，ｄ of ｄ，J_HF ＝47.4Hz，−CH₂F），5.09（2H，ｓ，Ph−CH ₂−
Ｏ），7.23（5H，ｓ，C₆ Ｈ ₅−CH₂−Ｃ），7.32
（5H，ｓ，C₆ Ｈ ₅−CH₂−Ｏ）。 ¹³C NMR（CDCl₃）のTMSからのシフトピー
ク：δ16.6（CH₃），38.7（Ph−ＣH₂−Ｃ），51.1（Ｎ
−ＣＨ−CH₃），56.4

【式】 67.2（Ph−ＣH₂O），83.6（ｄ，J_CF＝185.6Hz，
CH₂F），126.9（ｄ，芳香族），128.1（ｄ，芳香
族），128.6（ｄ，芳香族，129.4（芳香族），136.4
（芳香族）。実施例３ Boc−ProCHFCO₂Etの合成〔２−（2′−エトキシカルボニル−2′−フルオ
ロアセチル）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルピロ
リジン〕フルオロ酢酸エチル（2.0ｇ，18.9mmol）のエ
ーテル（25ml）中の溶液を、攪拌下にエーテル
（20ml）中のNaH（50％オイル分散物）（0.91ｇ，
18.9mmol）の懸濁液中に滴加した。反応混合物
を室温で３時間攪拌し、次に−15゜に冷却した。
Boc−Pro−OHの混合無水物〔Ｎ−メチルモル
ホリン（2.1ml，18.9mmol）を含有するTHF（50
ml）中で、Boc−Prc−OH（4.1ｇ，18.9mmol）
から、−15゜でイソブチルクロロホルメート（2.45
ml，18.9mmol）を添加して５分間攪拌すること
により製造した〕を、冷却したエノレート懸濁液
中に瀘し入れ、−15゜で10分間攪拌した。反応物を
次いで１時間室温に加温した。溶液を
2.5NH₂SO₄を含有する氷中に注加した。有機溶
媒を留去し、水層を酢酸エチルで抽出した。酢酸
エチル溶液を飽和NaHCO₃，飽和NaClで洗浄
し、無水MgSO₄で乾燥した。酢酸エチルを留去
し、残渣をシリカゲルカラム中に通した。生成物
をクロロホルムで溶離した。溶媒を留去し、油状
物1.08ｇを得た。 ¹H NMR（CDCl₃）のTMSからのシフトピー
ク：δ1.45（12H，ｍ，−Ｃ（ＣＨ ₃）₃＋−CH₂CＨ ₃），
2.05（4H，ｍ，

【式】）．3.51（2H，ｍ，

【式】），4.33（3H，Ｍ，

【式】），5.44（1H，ｄ ofd，− CHF−，J_HF＝46.9Hz）。 ¹³C NMR（CDCl₃）のTMSからのシフトピー
ク：δ14.1（CH₂ ＣH₃），23.6（

【式】）， 28.3（−Ｃ（ＣH₃）₃），31.0（

【式】46.5 （

【式】），58.9（

【式】），62.5（Ｃ H₂CH₃），77.1（ｄ，J_CF＝168.5Hz，（−CHF−）。実施例４ MeOSuc−Phe−Ala−Phe−Phe−Val−
LeuCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−メトキシスクシニルフエニルアラ
ニルアラニルアラニルフエニルアラニルフエニル
アラニルバリルアミド）−１−フルオロ−５−メ
チル−２−ヘキサノン〕Ｎ−メチルモリホリン（0.13ml，1.14mmol）
を含有する−10゜のテトラヒドロフラン（10ml）
中のMeOSuc−Phe−Ala−Ala−Phe−Phe−
OH（0.82ｇ，1.14mM）中に、イソブチルクロロ
ホルメート（0.15ml，1.14mmol）を添加した。
混合物を−10゜で２分間攪拌し、次いでジメチル
ホルムアミド（５ml）中の予冷したHCl−Val−
LeuCH₂F（0.33ｇ，1.14mmol）の溶液を加え、
さらにＮ−メチルモルホリン（0.13ml，
1.14mmol）を加えた。混合物を−10゜で１時間攪
拌し、次いで室温で一夜攪拌した。混合物を過
し、溶媒を留去した。残渣を2.5×45cmのシリカ
ゲル（60メツシユ）のカラムに通し、生成物をク
ロロホルム中の２％メタノールで溶離した。溶媒
を留去し、残渣をエーテルで粉砕処理し、固体物
質を24％の収率で得た。実施例５ HCl・ProCH₂Fの合成〔２−フルオロアセチルピロリジン塩酸塩〕２−（2′−ｔ−ブトキシカルボニル−2′−フル
オロアセチル）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルピ
ロリジン（1.4ｇ，4.2mmol）をジクロロメタン
（20ml）に溶解し、室温で１時間ジオキサン（20
ml）中の5.5N HClで処理した。溶液をエーテル
（200ml）に注加した。固形分を過して集め、エ
ーテルで洗浄して真空乾燥した。¹H NMRはｔ−
ブチル基の不存在および5.22（J_HF＝47.3Hz）に−
CH₂Fダブレツトのリテンシヨンを示した。実施例６ Boc−AlaCHFCO₂−ｔ−ブチルの合成〔３−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）−１−フ
ルオロ−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−ブタ
ノン〕 0゜のTHF（25ml）中のカリウム第三ブトキシド
（1.19ｇ，10.6mmol）中に、THF5ml中の第三ブ
チルフルオロアセテート（1.42ｇ，10.6mmol）
を滴加した。氷浴を外し、この黄色溶液を室温で
20分間攪拌した。溶液を次いで−10゜に冷却し、
この間にBoc−Ala−OH（２ｇ，10.6mmol）の
混合無水物を調製した。この混合無水物反応混合
物を過して、冷却エノレート溶液中に加えた。
得られた溶液を室温で１時間攪拌し、その後
2.5NH₂SO₄を含んだ砕氷に注加した。THFを留
去し、水性残渣を酢酸エチル（２×50ml）で抽出
した。、有機層を飽和NaHCO₃およびブラインで
洗浄し、次いでMgSO₄で乾燥した。溶媒を留去
し、残渣をシリカゲルでクロマトグラフイーに付
した。生成物をクロロホルム中の２％酢酸エチル
で溶離して、油状物2.4ｇ（78％）を得た。 ¹H NMR（CDCl₃）はδ5.39にｄ，ｄを示した
（−CHF−，J_HＦ＝46.9Hz）。 ¹³C NMR（CDCl₃）はδ77.1にｄを示した（−
CHF−，J_CF＝172.1Hz）。実施例７ TFA Ｌ−AlaCH₂Fの合成〔Ｌ−１−フルオロ−３−アミノ−２−ブタノ
ントリフルオロアセテート塩〕 Boc−AlaCHFCO₂−ｔ−ブチル（１ｇ，
2.46mmol）をトリフルオロ酢酸で12時間処理し
た。溶媒を留去し、残渣をエーテル−石油エーテ
ルで粉砕処理して固体物質（0.35ｇ，65％）を得
た。 ¹H NMR（D₂O）はδ5.48にｄを示した（−
CH₂F，J_HF＝46.4Hz）。実施例８ MeOSuc−Ala−Ala−Pro−AlaCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−メトキシスクシニルアラニルアラ
ニルプロリルアミド）−１−フルオロ−２−ブタ
ノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにMeOSuc−Ala−Ala−Pro−Ala−
OHを用いて、MeOSuc−Ala−Ala−Pro−
AlaCH₂Fを合成した。実施例９Ｚ−Ala−PheCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニ
ルアミド）−１−フルオロ−３−フエニル−２−
ブタノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにＺ−Ala−Phe−OHを用いて、Ｚ
−Ala−PheCH₂Fを合成した。実施例 10 Ｚ−Phe−LeuCH₂の合成〔３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルフエニ
ルアラニルアミド）−１−フルオロ−５−メチル
−２−ヘキサノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにＺ−Phe−Leu−OHを使用して、
Ｚ−Phe−LeuCH₂Fを合成した。実施例 11 Boc−Gly−AspCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルグリシル
アミド）−１−フルオロ−４−カルボキシ−２−
ブタノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにBoc−Gly−Ｏ−BzlAsp−OHを使
用し、得られたBoc−Gly−Ｏ−BzlAspCH₂Fを
接触水素化してBoc−Gly−AspCH₂Fを合成し
た。実施例 12 Boc−Ｄ−Val−Leu−ArgCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｄ−バ
リル−Ｌ−ロイシルアミド）−１−フルオロ−６
−グアニジノ−２−ヘキサノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにBoc−Ｄ−Val−Leu−NO₂Arg−
OHを使用し、得られたBoc−Ｄ−Val−Leu−
（NO₂）ArgCH₂Fを接触還元してBoc−Ｄ−Val
−Leu−ArgCH₂Fを合成した。実施例 13 Boc−Pro−NHCH（C₆H₁₁）COCH₂Fの合成〔３−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルプロリル
アミド）−１−フルオロ−３−シクロヘキシル−
２−プロパノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにBoc−Pro−シクロヘキシルグリシ
ンを使用して、Boc−Pro−NHCH（C₆H₁₁）
COCH₂Fを合成した。実施例 14 MeOSuc−Gly−NHCH（C₆H₅）COCOH₂Fの
合成〔３−（Ｎ−メトキシスクシニルグリシルアミ
ド）−１−フルオロ−３−フエニル−２−プロパ
ノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにMeOSuc−Gly−フエニルグリシン
を用い、MeOSuc−Gly−NHCH（C₆H₅）
COCH₂Fを合成した。実施例 15 Ｚ−Ala−NHCH（CH₂CH₂CH₂CH₂C₆H₅）−
COCH₅Fの合成〔３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニ
ルアミド）−１−フルオロ−７−フエニル−２−
ヘプタノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにＺ−Ala−６−フエニルノルロイシ
ンを用いて、Ｚ−Ala−NHCH
（CH₂CH₂CH₂CH₂C₆H₅）−COCH₂Fを合成した。実施例 16 Ｚ−Gly−PipCHFCO₂Etの合成〔２−（2′−エトキシカルボニル−2′−フルオ
ロアセチル）−Ｎ−（N′−ベンジルオキシカルボ
ニルグリシルピペリジン〕実施例３の方法に従がい、Boc−Pro−OHの
代りにＺ−Gly−ピペコリン酸を用いて、Ｚ−
Gly−PipCHFCO₂Etを合成した。実施例 17 Boc−Gly−PheCHFCH₂CH₂CH₂CH（CH₃）₂
の合成〔２−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルグリシル
アミド）−４−フルオロ−８−メチル−１−フエ
ニル−３−ノナノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにBoc−Gly−Phe−OHを使用し、無
水フルオロ酢酸の代りに無水２−フルオロ−６−
メチルヘプタン酸を使用して、Boc−Gly−
PheCHFCH₂CH₂CH₂CH（CH₃）₂を合成した。実施例 18 Ｚ−Phe−AlaCHFC₆H₅の合成〔３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルフエニ
ルアラニルアミド）−１−フルオロ−１−フエニ
ル−２−ブタノン〕実施例２の方法に従がい、無水フルオロ酢酸の
代りに２−フルオロ−２−フエニル酢酸無水物を
使用して、Ｚ−Phe−AlaCHFC₆H₅を合成した。実施例 19 Ｚ−Gly−LeuCHFCH₂CH₂CH₂CH₂C₆H₅の合
成〔７−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシ
ルアミド）−５−フルオロ−９−メチル−１−フ
エニル−６−デカノン〕実施例１の方法に従がい、無水フルオロ酢酸の
代りに無水２−フルオロ−６−フエニルヘキサン
酸を使用し、Ｎ−ベンゾイルアラニルの代りにＺ
−Gly−Leu−OHを使用して、Ｚ−Gly−
LeuCHFCH₂CH₂CH₂CH₂C₆H₅を合成した。実施例 20 Ｚ−Ala−GlyCHFCH₂CH（CH₃）₂の合成〔１−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニ
ルアミド）−３−フルオロ−５−メチル−２−ヘ
キサノン〕実施例１の方法に従がい、Ｎ−ベンゾイルアラ
ニンの代りにＺ−Ala−Gly−OHを使用し、無水
フルオロ酢酸の代りに２−フルオロ−４−メチル
ペンタン酸無水物を使用して、Ｚ−Ala−Gly−
CHFCH₂CH（CH₃）₂を合成した。実施例 21 Boc−ProCHFCO₂−ｔ−ブチルの合成〔２−（2′−ｔ−ブトキシカルボニル−2′−フ
ルオロアセチル）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル
ピロリジン〕実施例３の方法に従がい、エチルフルオロアセ
テートの代りにｔ−ブチルフルオロアセテートを
使用して、Boc−Pro CHFCO₂−ｔ−ブチルを
合成した。実施例 22 システインプロテアーゼのカテプシンＢに対す
るα−アミノフルオロメチルケトンであるＺ−
Phe−AlaCH₂Fの非可逆的阻害効果を、公知阻
害剤であるＺ−Phe−AlaCHN₂およびＺ−Phe−
AlaCH₂Clと比較した。比較に用いたカテプシン
Ｂはヒトおよびラツトの肝臓から分離精製した。
酵素活性の測定には、合成オリゴペプチド基質
Bz−Val−Lys−Lys−Arg−AFCを10mMDTT
およびアクテイベーター塩EDTA1mMを用い、
PH6.5に遊離されたAFCの螢光を検出した。酵素
活性の単位は、50％グリセロールリン酸緩衝液
100mlについて標準化した。標準濃度の酵素
（10mM）を各阻害剤（50nM）と25゜で３，５，
10，15，20および30分の各時間予備加温し、次い
で各試験サンプルにつき、同じ合成基質および条
件を用いて活性測定して、精製酵素の残存活性単
位を調べた。各阻害剤で阻害された酵素活性の量
は、各阻害剤について対照活性値から残存活性値
を差し引いて求めた。得られたデータは、0.1μM
のＺ−Phe−AlaCH₂Fが精製カテプシンＢの有
効な阻害剤であることを示した。Ｚ−Phe−
AlaCH₂FのK₃（不活性化速度定数）は9.2±1.3×
10^-3s^-1であり、K_I（阻害剤解離定数）は0.57±
0.09μMであり、K₃／K_I（阻害剤特異定数）は
16200M^-1s^-1であつた；Ｉ＝0.40（0.10μM）。Ｚ−
Phe−AlaCHN₂においてはK₃＝4.1±1.7×
10^-3s^-1、K_I＝7.4±3.0μM、およびK₃／K_I＝
546M^-1s^-1；Ｉ＝2.5−0.50μMであつた。Ｚ−
Phe−AlaCH₂Fの阻害剤特異定数（K₃／K_I）は
Ｚ−Phe−AlaCHN₂に比べて30倍大きかつた。実施例 23 α−アミノフルオロメチルケトンＺ−Phe−
AlaCH₂Fの、ヒト白血球ならびにブタ膵臓から
のエラスターゼであるセリンプロテアーゼを非可
逆的に阻害する能力を、公知阻害剤Ｚ−Phe−
AlaCH₂Fと比較した。GaCl₂（10mM）を含む
0.1MTESPH8.2中のエラスターゼ（0.3μM）の水
溶液を、合成基質MeOSuc−Ala−Ala−Pro−
Val−MNAに対して使用した。遊離された
MNA基を螢光測定により定量した。標準単位濃
度の酵素を各濃度の夫々の阻害剤と、37℃にて定
められた時間、即ち５，15，30および60分間予備
加温し、次に全試験サンプル夫々につき、阻害剤
を存在させない対照の場合と同じ合成基質を用い
て活性を測定した。各阻害剤で阻害された酵素活
性の量は、各阻害剤について対照の活性値から残
存活性を差し引くことにより求めた。得られたデ
ータは、アルカリ性条件下においてＺ−Phe−
AlaCH₂Fがエラスターゼを阻害することを示し
た。実施例 24 実施例22の方法に従がつて、システインプロテ
アーゼのカテプシンＬは、Ｚ−Phe−PheCH₂F
により、同じ条件および同じプロテアーゼ対ケト
ン阻害剤の濃度比において阻害されることが見出
された。実施例 25 実施例22の方法に従がつて、システインプロテ
アーゼのカテプシンＬは、Ｚ−Phe−AlaCH₂F
により、同じ条件および同じプロテアーゼ対ケト
ン阻害剤濃度比において阻害されることが見出さ
れた。実施例 26 実施例23の方法に従がつて、セリンプロテアー
ゼのプラスミノーゲンアクテイベーターは、
MeOSuc−Gly−Gly−ArgCH₂Fにより、同じ条
件およびプロテアーゼ濃度約50μMおよびケトン
阻害剤濃度約0.1mMの条件で阻害されることが
見出された。実施例 27 実施例23の方法に従がつて、セリンプロテアー
ゼの血漿カリクレインは、ケトン阻害剤Ｄ−Pro
−Phe−ArgCH₂Fにより、同じ条件およびプロ
テアーゼ濃度約10μMおよびケトン阻害剤濃度約
0.1mMの条件で阻害されることが見出された。実施例 28 実施例23の方法に従がつて、セリンプロテアー
ゼの腺カリクレンは、ケトン阻害剤Ｄ−Val−
Leu−ArgCH₂Fにより、プロテアーゼ濃度約
10μMおよびケトン阻害剤濃度約0.1mMの条件で
阻害されることが見出された。実施例 29 実施例23の方法に従がつて、セリンプロテアー
ゼのトリプシンは、ケトン阻害剤Ｚ−LysCH₂F
により、プロテアーゼ濃度約10μMおよびケトン
阻害剤濃度約0.1mMで阻害されることが見出さ
れた。実施例 30 次の各阻害剤：Ｚ−Phe−AlaCHN₂；Ｚ−Phe
−AlaCH₂Cl；およびＺ−Phe−AlaCH₂Fを使し
て、ラツトの脾臓、膵臓、肝臓および腎臓の組織
ホモジネートのカテプシンＢに対する阻害率を測
定した。前記組織をホモジナイズし、13000rpmで25分
間遠心分離し、上澄を分離した。上澄の一部を水
で希釈して0.01μMの濃度とした。実施例22の方
法を繰返した。第３表に示すとおり、各組織サン
プルについて、三種阻害剤によるカテプシンＢの
阻害を比較した。結果をτ（不活性化もしくは阻
害のハーフタイム）で示す。ハーフタイムが小さ
いほど阻害剤の阻害能が大きいことを示す。阻害
剤の濃度は0.10μMであり、反応温度は25℃を用
いた。

【表】

【表】上記好ましい態様の記載は、説明のためのもの
である。したがつて、これらの記載は本発明を記
載の範囲内のみに限定するものではなく、この開
示により改変および変法を行ないうることは明ら
かである。上記態様は、本発明の原理ならびに実
用的応用例を最も明確に説明し、当業者が所望の
特定の用途に合せて、本発明を修正し、種々の態
様で使用することを可能ならしめるために選択し
て、本明細書に記載したものである。したがつ
て、本発明の範囲は特許請求の範囲の記載のみに
限定されるものである。

Claims

【特許請求の範囲】１次式(a)、(b)、(c)または(d)：（式中、R₁およびR₂は各々独立して、水素原
子、炭素原子数１ないし６のアルキル基、炭素原
子数１ないし６の置換アルキル基、アリール基、
アルキル部分の炭素原子数が１ないし４のアルキ
ルアリール基よりなる群から選ばれ、ｎは１ない
し４の整数を表わし、Ｘはペプチド末端のブロツ
キング基を表わし、そしてＹはアミノ酸残基もし
くは１ないし６個のアミノ酸のペプチド鎖残基を
表わす）で表わされるα−アミノフルオロケトン。２置換アルキル基が、水酸基、アミノ基、グア
ニジノ基、カルボキシル基またはメルカプト基で
置換された炭素原子数１ないし６のアルキル基で
ある特許請求の範囲第１項記載の化合物。３Ｘがアセチル基、ベンゾイル基、カルボベン
ゾキシ基、グルタリル基、ｔ−ブトキシカルボニ
ル基、スクシニル基、メトキシスクシニル基、Ｄ
−プロリン残基、Ｄ−バリン残基、Ｄ−ロイシン
残基またはＤ−フエニルアラニン残基である特許
請求の範囲第１項記載の化合物。４Ｘがベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル
基、メトキシスクシニル基またはカルボベンゾキ
シ基である特許請求の範囲第１項記載の化合物。５ R₂が水素原子である特許請求の範囲第１項
記載の化合物。６Ｙがアミノ酸残基または１ないし４個のアミ
ノ酸のペプチド鎖残基である特許請求の範囲第１
項記載の化合物。７ Bz−AlaCH₂Fである特許請求の範囲第１項
記載の化合物。８Ｚ−Phe−AlaCH₂Fである特許請求の範囲
第１項記載の化合物。９ Boc−ProCHFCO₂Etである特許請求の範囲
第１項記載の化合物。１０ Boc−AlaCHFCO₂−ｔ−ブチルである特
許請求の範囲第１項記載の化合物。１１ MeOSuc−Ala−Ala−ProAlaCH₂Fであ
る特許請求の範囲第１項記載の化合物。１２ MeOSuc−Phe−Ala−PhePhe−Val−
LeuCH₂Fである特許請求の範囲第１項記載の化
合物。１３次式(a)、(b)、(c)または(d)：（式中、R₁およびR₂は各々独立して、水素原
子、炭素原子数１ないし６のアルキル基、炭素原
子数１ないし６の置換アルキル基、アリール基、
アルキル部分の炭素原子数が１ないし４のアルキ
ルアリール基よりなる群から選ばれ、ｎは１ない
し４の整数を表わし、Ｘはペプチド末端のブロツ
キング基を表わし、そしてＹはアミノ酸残基もし
くは１ないし６個のアミノ酸のペプチド鎖残基を
表わす）で表わされるα−アミノフルオロケトンを、プロ
テアーゼ阻害条件下に、該プロテアーゼの活性部
位全てを阻害するに十分な量で、プロテアーゼと
接触させることよりなる、プロテアーゼを非可逆
的に阻害する方法。１４プロテアーゼが、システインプロテアーゼ
またはセリンプロテアーゼである特許請求の範囲
第１３項記載の方法。１５プロテアーゼがセリンプロテアーゼである
特許請求の範囲第１３項記載の方法。１６プロテアーゼ阻害条件が、プロテアーゼを
α−アミノフルオロケトンと約４−10のPHで接触
させることよりなる特許請求の範囲第１３項記載
の方法。１７プロテアーゼ阻害条件が、プロテアーゼを
α−アミノフルオロケトンと約６−９のPHで接触
させることよりなる特許請求の範囲第１３項記載
の方法。１８プロテアーゼ阻害条件が、プロテアーゼを
α−アミノフルオロケトンと約20−37゜の温度で
接触させることよりなる特許請求の範囲第１３項
記載の方法。１９プロテアーゼ阻害条件が、プロテアーゼを
α−アミノフルオロケトンと約25゜の温度で接触
させることよりなる特許請求の範囲第１３項記載
の方法。２０ α−アミノフルオロケトンが、Ｚ−Phe−
AlaCH₂Fである特許請求の範囲第１３項記載の
方法。２１プロテアーゼがカテプシンＢである特許請
求の範囲第２０項記載の方法。２２プロテアーゼがエラスターゼである特許請
求の範囲第２０項記載の方法。２３ α−アミノフルオロケトンが、Ｚ−Phe−
PheCH₂Fであり、プロテアーゼがカテプシンＬ
である特許請求の範囲第１３項記載の方法。２４ α−アミノフルオロケトンが、MeOSuc−
Gly−Gly−ArgCH₂Fであり、プロテアーゼがプ
ラスミノーゲンアクテイベーターである特許請求
の範囲第１３項記載の方法。２５ α−アミノフルオロケトンが、Ｄ−Pro−
Phe−ArgCH₂Fであり、プロテアーゼが血漿カ
リクレインである特許請求の範囲第１３項記載の
方法。２６ α−アミノフルオロケトンが、Ｄ−Val−
Leu−ArgCH₂Fであり、プロテアーゼが腺カリ
クレインである特許請求の範囲第１３項記載の方
法。２７ α−アミノフルオロケトンがＺ−
LysCH₂Fであり、プロテアーゼがトリプシンで
ある特許請求の範囲第１３項記載の方法。２８ (a) Ｎ−アシルアミノ酸またはそのペプチ
ド誘導体を約２当量の無水フルオロ酢酸ととも
に不活性溶媒中に懸濁させ、その際、前記溶媒
は前記Ｎ−アシルアミノ酸もしくはそのペプチ
ド誘導体の重量とほぼ等量で存在させ、 (b) 工程(a)からの生成物に、温度を約0゜に冷却し
ながら、前記Ｎ−アシルアミノ酸またはそのペ
プチド誘導体に対して約２当量の第三アミンを
添加し、そして (c) 工程(b)からの生成物に、触媒量の置換４−ジ
アルキルアミノピリジン触媒を添加して、目的
ケトンと不純物を含む有機溶液を生じさせるこ
とよりなる、次式(a)、(b)、(c)または
(d)：（式中、R₁およびR₂は各々独立して、水素原
子、炭素原子数１ないし６のアルキル基、炭素原
子数１ないし６の置換アルキル基、アリール基、
アルキル部分の炭素原子数が１ないし４のアルキ
ルアリール基よりなる群から選ばれ、ｎは１ない
し４の整数を表わし、Ｘはペプチド末端のブロツ
キング基を表わし、そしてＹはアミノ酸残基もし
くは１ないし６個のアミノ酸のペプチド鎖残基を
表わす）で表わされるα−アミノフルオロケトンの合成方
法。２９工程(c)からの有機溶液を精製して、α−ア
ミノフルオロケトンを不純物から単離する工程を
さらに含む特許請求の範囲第２８項記載の方法。３０工程(a)における不活性溶媒がベンゼンであ
る特許請求の範囲第２８項記載の方法。３１工程(b)における第三アミンがトリエチルア
ミンである特許請求の範囲第２８項記載の方法。３２置換４−ジアルキルアミノピリジンが、４
−ジメチル−アミノピリジンである特許請求の範
囲第２８項記載の方法。３３ α−アミノフルオロケトンが、Bz−
AlaCH₂Fであり、Ｎ−アシルアミノ酸がＮ−ベ
ンゾイルアラニンである特許請求の範囲第２８項
記載の方法。３４ α−アミノフルオロケトンが、Ｚ−Phe−
AlaCH₂Fであり、ペプチド誘導体がＮ−ベンジ
ルオキシカルボニルフエニルアラニル−アラニン
である特許請求の範囲第２８項記載の方法。３５ α−アミノフルオロケトンが、MeOSuc−
Ala−Ala−Pro−AlaCH₂Fであり、ペプチド誘
導体が、MeOSuc−Ala−Ala−Pro−Ala−OH
である特許請求の範囲第２８項記載の方法。